十八、改善营养性贫血功能检验方法

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谅羊
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1 附件 5: 改善缺铁性贫血功能评价方法试验项目试验原则及结果判定 Items, Principles and Result Assessment 1 试验项目 1.1 动物实验体重血红蛋白红细胞比积 / 红细胞游离原卟啉 1.2 人体试食试验血红蛋白血清铁蛋白红细胞游离原卟啉 / 红细胞运铁蛋白饱和度 2 试验原则 2.1 动物实验和人体试食试验所列指标均为必做项目 2.2 针对儿童的人体试食试验, 只测血红蛋白和红细胞内游离原卟啉 2.3 在进行人体试食试验时, 应对受试样品的食用安全性作进一步的观察 3 结果判定 3.1 动物实验 : 血红蛋白指标阳性, 红细胞游离原卟啉 / 红细胞压积二项指标一项指标阳性, 可判定该受试样品改善缺铁性贫血功能动物实验结果为阳性 3.2 人体试食试验针对改善儿童缺铁性贫血功能的, 血红蛋白和红细胞内游离原卟啉二项指标阳性, 可判定该受试样品具有改善缺铁性贫血功能作用针对改善成人缺铁性贫血功能的, 血红蛋白指标阳性, 血清铁蛋白红细胞内游离原卟啉 / 血清运铁蛋白饱和度二项指标一项指标阳性, 可判定该受试样品具有改善缺铁性贫血功能作用 46

2 改善缺铁性贫血功能检验方法 Method for the Assessment of Improving Nutritional Anaemia Function 1. 动物实验 1.1 原理用低铁饲料喂饲动物可形成实验性缺铁性贫血模型, 再给予受试样品, 观察其对血液细胞学血液生化学等指标的影响, 可判定该受试样品对改善动物缺铁性贫血的作用 1.2 实验动物健康初断乳大鼠, 单一性别, 每组大鼠 8-12 只 1.3 低铁饲料配方 : 成分添加量 g/kg 玉米淀粉蛋清蛋白 * 蔗糖玉米油 ( 无添加剂 ) 70.0 纤维素 50.0 混合矿物盐 (AIN-93G-MX) 35.0 混合维生素 (AIN-93G-VX) 10.0 L- 胱氨酸氯化胆碱 * 亦可使用 EDTA 处理的酪蛋白 AIN-93G 混合矿物盐配方矿物质添加量 g or mg/kg mix Calcium carbonate anhydrous Potassium phosphate monobasic Potassium citrate, tripotassium monohydrate Sodium chloride Potassium sulfate Magnesium oxide Zinc carbonate 1.65 Sodium meta-silicater9h 2 O

3 Manganous carbonate 0.63 Cupric carbonate 0.30 Chromium potassium sulfater12h 2 O Boric acid (17.5% B), mg Sodium fluoride (45.24% F), mg Nickel carbonate (45% Ni), mg Lithium chloride (16.38% Li), mg Sodium selenate anhydrous(41.79% Se), mg AIN -93G 混合维生素配方维生素添加量 g/kg mix Nicotinic acid Ca pantothenate Pyridoxine-HCl Thiamin-HCl Riboflavin Folic acid Biotin Vitamin B-12 (cyanocobalamin) (0.1% in mannitol) Vitamin E (all-rac-a-tocopheryl acetate)2 (500 IU/g) Vitamin A (all-trans-retinyl palmitate)2 (500,000 IU/g) Vitamin D-3 (cholecalciferol) (400,000 IU/g) Vitamin K-1 (phylloquinone) Powdered sucrose 剂量分组及受试样品给予时间实验设三个剂量组和一个低铁对照组, 以人体推荐量的 5 倍为其中的一个剂量组, 另设二个剂量组, 必要时设阳性对照组 ( 硫酸亚铁或乳酸亚铁, 剂量为 2 ppm 或 2 mg/(kgbw), 以 Fe 元素计 ) 受试样品给予时间 30 天, 必要时可延长至 45 天 1.5 实验步骤建立缺铁性贫血大鼠模型选用健康断乳大鼠在实验环境下适应 3-5 天后饲予低铁饲料及去离子水 ( 或双蒸水 ), 采用不锈钢笼及食罐, 同时, 采用剪尾取血法放血,5 天一次, 每次 ml 实验过程中避免铁污染自第 3 周开始每周选取部分大鼠采尾血测 Hb, 如多数动物 Hb 低于 100g/L 时, 测定全部大鼠的体重及 Hb 恢复实验 48

4 选取 Hb<100g/L 的大鼠作为实验动物, 根据贫血大鼠 Hb 水平和体重将其随机分为低铁对照组和三个实验组, 各组均继续饲予低铁饲料, 低铁对照组给予相应溶剂, 实验组分别给予不同剂量的受试样品, 受试样品给予时间 30 天, 必要时可延长至 45 天, 测定体重及各项血液学指标 1.6 观察指标体重血红蛋白红细胞比积 / 红细胞内游离原卟啉血红蛋白测定 ( 氰化高铁法 ) 消光系数法和标准曲线法任选其一测定血红蛋白吸光系数法原理血红蛋白 (haemoglobin,hb) 被铁氰化钾氧化后生成高铁血红蛋白, 再与氰离子结合形成氰化高铁血红蛋白 ( 红色 ), 氰化高铁血红蛋白 ( 红色 ) 极为稳定, 在 540nm 波长下, 摩尔吸光系数为 44000, 据此, 用分光光度法测其光密度, 运用吸光系数作血红蛋白的定量测定仪器分光光度计 10 微升微量吸管试剂称取碳酸氢钠 (NaHCO 3,AR)140 毫克铁氰化钾 200 毫克氰化钾 50 毫克, 用水溶解并稀释到 1000 毫升贮存於棕色试剂瓶内, 在暗处或冰箱 (4 ) 保存, 至少可稳定数月到 1 年实验步骤取试剂 2.5 毫升於 5 毫升带盖试管中, 加入 10 微升血液, 混匀后, 放置 15 分钟选用 0.5 厘米光径比色杯, 于 540nm 波长下, 以试剂调零点, 将所得样品管之光密度乘以 736, 即为血红蛋白浓度 (g/l) 计算公式如下 : C = DHiCN =D HiCN 736 t Ct= 待测的血红蛋白 (g/l) 浓度 D 540 HiCN = 氰化高铁血红蛋白在 540nm 波长下测出的光密度 251 = 测定时血液的稀释倍数 ( 血 10μL 加入试剂 2.5mL 中 ) = 氰化高铁血红蛋白的摩尔吸光系数 0.5 = 比色杯的光径 = 血红蛋白的分子量注意事项 49

5 试剂不要放在聚乙烯瓶内, 以免因氰离子与其反应而使试剂作用降低仪器因摩尔吸光系数法完全依靠仪器的吸光度来计算, 故此法要求所用的仪器性能要符合要求 ( 如仪器的波长准确与否, 以及灵敏度及线性等 ), 否则将直接影响测定的结果仪器在使用前最好应以 WHO 规定的氰化高铁血红蛋白参考液校正后再使用参考液最好选用 ICSH( 国际血液学标准化委员会 ) 确定的由 RIV( 荷兰国立公共卫生研究院 ) 制作的氰化高铁血红蛋白参考液或上海医学化验所制备的氰化高铁血红蛋白标准液标准曲线法原理血红蛋白 (hemoglobin,hb) 在铁氰化钾和氰化钾的作用下生成极为稳定的氰化高铁血红蛋白 ( 红色 ), 其颜色深浅与血红蛋白的含量成正比用分光光度计在 540nm 波长下, 测定血红蛋白标准品和参考标准物质的吸光度, 制成标准曲线, 测得待测样品的吸光度后查标准曲线即可得 Hb 的浓度仪器 10μL 血色素吸管 ( 或定量毛细管 ) 5mL 或 10mL 带盖试管分光光度计试剂称取碳酸氢钠 (NaHCO 3,AR)140mg 铁氰化钾 200mg 氰化钾 50mg, 用蒸馏水溶解并稀释到 1000mL, 贮存于棕色试剂瓶内, 保存于 4 冰箱可稳定至 1 年实验步骤吸取 2.5mL 试剂于 5mL 带盖试管中, 用 10μL 血色素吸管 ( 或定量毛细管 ) 取大鼠尾血或静脉血 10μL 放置于已放入试剂的试管中 ; 混匀放置 15min 选用 0.5cm 光径比色杯, 于 540nm 波长下, 以试剂调节仪器零点, 测定各样品管的吸光度, 同时测定血红蛋白标准和参考标准物质的吸光度, 绘制血红蛋白的标准曲线查标准曲线可求得待测样品和参考标准物质的血红蛋白含量 (g/l), 计算参考物质的回收率注意事项不要将试剂放在聚乙烯瓶内, 以免因氰离子与其反应而使试剂作用降低不宜直接使用消光系数方法计算血红蛋白的含量, 因为仪器的波长准确与否仪器的灵敏度和线性等因素均直接影响测定结果每次测定时, 在不同间隔反复测定血红蛋白标准液和参考标准物质 ( 低中高 3 个浓度 ) 数据处理及结果判定实验数据可用方差分析, 但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验, 方差齐, 计算 F 值,F 值 < F0.05, 结论 : 各组均数间差异无显著性 ;F 值 F 0.05,P 0.05, 用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计 ; 对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转 50

6 换, 待满足正态或方差齐要求后, 用转换后的数据进行统计 ; 若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的, 改用秩和检验进行统计结果判定受试样品组与对照组比较, 血红蛋白浓度升高经统计处理差异有显著性, 且受试样品组前后升高幅度平均达到 10g/L 以上, 判定该实验结果阳性红细胞内游离原卟啉测定原理血红蛋白的合成过程中, 幼红细胞中的原卟啉在血红素合成酶的作用下与铁结合, 当铁供应不足时, 红细胞内的原卟啉乃以游离形式累积起来超过正常水平因此, 检测红细胞内游离原卟啉 (Free erythrocyte proloporphyrin, FEP) 的含量是检查缺铁性红细胞生成的有效方法血液样品经生理盐水稀释后, 分别以乙酸乙酯 : 乙酸混合液 (4:1) 和 0.5N 盐酸提取分离血中游离原卟啉, 在一定波长下测定其原卟啉的荧光强度而定量仪器荧光分光光度计或 930 型荧光光度计离心机混旋器试剂肝素抗凝剂一支单位的肝素以 0.9% 生理盐水稀释至 25mL(1mL=500 单位 ) %(W/V) 硅藻土生理盐水悬浊液称取 5g 硅藻土加 0.9% 生理盐水至 100mL :1 乙酸乙酯和乙酸混合液 N HCl 原卟啉标准液原卟啉标准贮备液 (50mg/L): 称取 5mg 原卟啉, 加 4mL 无水乙醇使之溶解, 以 1.5N HCl 稀释至 100mL 原卟啉标准中间液 (1.0mg/L): 取 2mL 原卟啉贮备液, 以乙酸乙酯与乙酸 (4:1) 混合液稀释到 100mL 原卟啉标准应用液 (0.1mg/L): 取 1mL 原卟啉中间液, 以乙酸乙酯与乙酸 (4:1) 混合液稀释到 10mL 实验步骤试剂样品管空白管标准管肝素 (ml) 全血 (ml) 0.02 水 (ml) % 硅藻土悬浊液 (ml) 原卟啉标准应用液 (ml) 0.5 乙酸乙酯与乙酸 (4:1) 混合液 (ml)

7 注 : 按上表依次加入各种试剂, 在加入乙酸乙酯与乙酸混合液前, 用混旋器混合已加入的混合液, 然后边混合边加入乙酸乙酯与乙酸混合液离心 15 分钟, 将各管上清液分别倒入 10mL 比色管中, 每管加 4mL 0.5N 盐酸, 振摇 5 分钟静止使之分层, 将上层溶剂抽出弃去, 测定盐酸液的荧光强度 (30 分钟内比色 ) 荧光测量若使用日立 MPF-4 型荧光分光光度计测定条件为激发波长为 403nm, 狭缝 10nm; 发射波长为 605nm, 狭缝为 5nm, 液槽为 1cm 厚石英槽若使用国产 930 型荧光光度计测试, 条件为激发滤光片 420, 荧光滤片 550, 灵敏度 1 500, 满度开关开至最大, 液槽为 1cm 厚石英槽, 检出灵敏度为 0.01µg/4mL 在不同量原卟啉 (0µg,0.01µg,0.03µg,0.05µg,0.07µg,0.1µg) 呈线性关系计算样品荧光强度空白荧光强度 100 血中原卟啉含量 (µg/l 全血 ) = 标准管原卟啉含量 (µg) 10 标准管荧光强度空白荧光强度样品取样量 (ml) 数据处理及结果判定实验数据可用方差分析, 但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验, 方差齐, 计算 F 值,F 值 < F 0.05, 结论 : 各组均数间差异无显著性 ;F 值 F 0.05,P 0.05, 用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计 ; 对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换, 待满足正态或方差齐要求后, 用转换后的数据进行统计 ; 若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的, 改用秩和检验进行统计结果判定受试样品组与对照组比较, 红细胞内游离原卟啉降低经统计处理差异有显著性, 即可判定该实验结果阳性注意事项荧光强度随时间延长而逐渐衰退, 但 30 分钟内基本稳定加乙酸乙酯 - 乙酸混合液时, 一定要边混合边加入, 否则影响测定结果滤纸法测定 : 将滴有 20 微升血点全部剪下放入试管中, 同时取同样大小空白滤纸放入标准管和空白管中, 各管均加入 5% 硅藻土悬浊液 0.2 亳升, 振荡后放置过夜, 以下步骤同直接法计算 : FEP( 微克 /100 毫升全血 )=C/B A/D 100 A= 标准管原卟啉含量 (0.02 毫克 ) B= 标准管荧光强度 - 空白管荧光强度 C= 血样荧光强度 - 空白管荧光强度 D= 取样量红细胞压积测定 : 使用全自动血细胞分析仪进行数据处理及结果判定同

8 1.7 数据处理和结果判定实验数据可用方差分析, 但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验, 方差齐, 计算 F 值,F 值 < F 0.05, 结论 : 各组均数间差异无显著性 ;F 值 F 0.05,P 0.05, 用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计 ; 对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换, 待满足正态或方差齐要求后, 用转换后的数据进行统计 ; 若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的, 改用秩和检验进行统计结果判定受试样品组与低铁对照组相比, 若血红蛋白差异有显著性, 且其前后平均升高幅度达到 10g/L 以上, 同时, 受试样品红细胞内游离原卟啉或红细胞压积与低铁对照组相比差异有显著性, 可判定该受试样品改善缺铁性贫血功能动物实验结果阳性 1.8 注意事项本项实验关键在于贫血模型的建立低铁饲料含铁量最好控制在 9mg/Kg 以下, 所用试剂应为分析纯, 动物饮用水应为去离子水或双蒸水, 采用不锈钢笼具, 所用器皿应用 10% 硝酸溶液处理实验过程中严防外来铁的污染及彼此交叉污染 2 人体试食试验 2.1 受试者纳入标准受试者为小细胞低色素贫血, 且有明确的缺铁原因和临床表现的成人和儿童成人纳入标准 : 男性 Hb 80g/L-130g/L, 女性 Hb 80g/L-120g/L 儿童纳入标准 : 6 岁儿童 Hb 70g/L-110g/L;7-18 岁青少年 80g/L-120g/L 2.2 受试者排除标准合并有心脑血管肝肾消化道等严重疾病及精神病患者过敏体质或对该受试样品过敏者严重贫血患者短期内服用与受试功能有关的物品, 影响到对结果的判断者未按标准服用受试样品资料不全影响功效或安全性判断者 2.3 试验设计及分组要求采用自身和组间两种对照设计按受试者的血红蛋白水平随机分为试食组和对照组, 尽可能考虑影响结果的主要因素如性别年龄经济状况等, 进行均衡性检验, 以保证组间的可比性每组受试者不少于 50 例 2.4 受试样品的剂量和使用方法试食组按推荐服用方法服用量服用受试产品, 对照组可服用安慰剂或采用空白对照, 53

9 也可服用具有同样作用的阳性物受试样品给予时间 30 天, 必要时可延长至 120 天试验期间不改变原来的饮食习惯, 正常饮食 2.5 观察指标安全性指标一般状况 ( 包括精神睡眠饮食大小便血压等 ) 血尿便常规检查肝肾功能检查 ( 儿童受试者不测定此项 ) 腹部 B 超胸透心电图检查 ( 各项指标在试验前检查一次, 儿童受试者不测此项 ) 膳食调查于试验开始前结束前进行三天的询问法膳食调查, 观察饮食因素对试验结果的影响症状观察食欲不振乏力烦燥头晕眼花精神不集中心慌气短等功效性指标儿童观察指标 : 血红蛋白红细胞内游离原卟啉成人观察指标 : 血红蛋白血清铁蛋白血清运铁蛋白饱和度 / 红细胞内游离原卟啉血红蛋白 : 见血清铁蛋白测定 ( 放射免疫法 ): 原理 125 人血清中的铁蛋白 (SF) 与加入的 I 标记的 SF 竞争性地与抗铁蛋白抗体结合用第二抗体分离结合部分, 分别测定总放射性与沉淀物放射性计数依据标准 SF 试剂作出标准曲线, 从而可在曲线上查出相应样品血清的 SF 浓度 *SF+Ab *SF-Ab+*SF + SF SF-Ab + SF *SF: 标记的铁蛋白 SF: 未标记的铁蛋白 Ab: 抗铁蛋白抗体仪器离心机 γ- 射线计数仪试剂 125 I- 血清铁蛋白放射免疫分析试剂盒. 54

10 操作步骤操作步骤 : 铁蛋白测定操作程序和试剂用量 (ml) ( 见下表 ) 绘制标准曲线以各标准管的 B/ B 0 % 作纵座标, 标准铁蛋白浓度为横座标 ( 对数边 ) 作标准曲线样品或质控由 B/ B 0 % 值从曲线上查到相应的含量组别名称 (T) (NBS) 总计数值非特异管标准曲线组待 (B 0 ) (B) 测零标准管标准管管温育液铁蛋白标准 0.1 待测血样或质控 0.1 铁蛋白抗体 I- 铁蛋白充分摇匀,37, 温育 1.0 小时分离试剂充分摇匀, 室温 15 分钟 3500 转 / 分, 离心 15 分钟, 弃上清液, 测沉淀计数结果计算非特异结合率 : NBS ( cpm) 本底 ( cpm) NBS(%) = T(cpm) - 本底 ( cpm) 100% 零管结合率 : B0( cpm) NBS( cpm) B 0 / T(%) = T(cpm) - 本底 ( cpm ) 100% 标准管 ( 样品质控 ) 结合率 : B( cpm) NBS( cpm) B/B 0 (%) = B0(cpm) - NBS ( cpm ) 100% 注意事项本实验为抗原抗体结合反应, 操作时要注意防止可引起抗原抗体失活的因素 ( 如高温冰冻等 ) 测定时, 要防止液体溅出, 以免造成同位素污染, 使本底值增高离心后, 抽去上清液时勿将平铺在管底的免疫复合物吸起, 否则测定结果不准确非特异管零管是为鉴定试剂是否符合规定而设立的血清铁蛋白浓度也可用酶联免疫吸附法测定具体测定方法按相应试剂盒说明书进行血清运铁蛋白饱和度测定原理血清中加入过量的铁, 使血清中的运铁蛋白全部与铁结合, 达到饱和, 过剩的铁用碳 55

11 酸镁吸附除去, 然后按测血清铁的方法, 测定总结合的铁量, 即为总铁结和力从中可计算出未饱和铁量及血清运铁蛋白饱和度血清铁测定血清铁 (S1) 是指存在于血清中与血清运铁蛋白结合的铁, 它以高铁的形式附着在血清 pl 球蛋白的转递蛋白上, 成人正常值为 µg/100mL 缺铁性贫血时常低于 50µg/100mL, 当血红蛋白浓度降低不明显时, 血清铁已减少, 被认为是早期缺铁性贫血诊断依据之一铬天青 B 铵盐比色法铬天青 B 铵盐作为显色剂测血清铁, 比过去多采用的联吡啶等作为显色剂有较高的灵敏度, 其克分子吸光系数在 630nm 波长下为 L mol -1 cm -1 可大大减少样品血清量, 方法简便, 准确原理 Fe 3 /Fe 2 与铬天青 B(CAB) 和十六烷基三甲基溴化铵 (CTMA) 反应, 形成三元胶囊状络合物使试剂颜色加深, 其颜色加深程度与血清铁含量成正比, 在 ph 为 , 波长为 630nm 时, 有最大吸收峰, 利用柠檬酸船为铁的掩蔽剂, 样品为自身空白, 不需除蛋白, 即可测出血清铁的含量试剂缓冲溶液 ph4.75, 取 25g 无水醋酸钠,110g 氯化钠,8mL 冰醋酸, 用蒸馏水定容 1000mL 用酸度计测 ph 应为显色剂 % 铬天青 B 铵盐溶液 (A 液 ): 取 0.1g 铬天青 B 铵盐, 定容于 l00ml 蒸馏水中, 放在棕色瓶中可在室温下保存 1 个月 % 十六烷基三甲基溴化铵 (B 液 ): 取十六烷基三甲基溴化铵 0.3g, 用蒸馏水定容至 100mL 显色剂应用液 : 取 90mL B 液,60mL A 液, 小心混匀, 用缓冲溶液定容至 1000mL, 放在棕色瓶内可保存 1 个月掩蔽剂 : 称 17.0g 柠檬酸 (C 6 H 8 O 7 H 2 O),35.0g 柠檬酸钠 (Na 3 C 6 H 5 O 7 H 2 O), 约加 50mL 蒸馏水加热助溶, 冷却后定容至 l00ml 铁标准液贮备液 :3mmol/L, 取 1.176g 硫酸亚铁铵 (6 分子结晶水 ) 至少量蒸馏水中, 加 50mL 浓硝酸混匀反应 10 分钟, 用蒸馏水定容至 1000mL 工作液 :30µmol/L, 取 10mL 贮备液, 用蒸馏水定容至 1000mL 方法按下表加入各种试剂样品管标准管空白 1 空白 2 空白 3 血清 (ml ) Fe 标 (30µmol/L) 0.1 蒸馏水 (ml ) 显色剂应用液 (ml) 隐蔽剂 (ml )

12 混匀, 放置 20 分钟, 在 721 型分光光度计上, 波长 630nm, 以空白管调零点记录光密度注 :1 样品管和标准管以空白 1 调 0 点 ; 2 空白管 2 以空白 3 调 0 点计算样品管光密度空白 2 管光密度血清铁浓度 (µmol/l) = 30 标准管光密度样品管光密度空白 2 管光密度或血清铁浓度 (µg/100ml)= 标准管光密度注意事项要求所用器皿用 2N 盐酸浸泡过夜, 试剂纯度为分析纯以上, 所用蒸馏水为双蒸水或去离子水缓冲液 ph 对结果影响较大, 测定时 ph 应保证在之间严格限制波长的选择 ( 需经校下 ), 血清样品在 nm 之间有一个杂质吸收峰原子吸收光谱法用原子吸收光谱法测定生物样品中微量元素的含量具有操作简便快速灵敏度较高的优点, 故被广泛应用试剂混合酸消化液 : 4 份硝酸,1 份高氯酸混合即成铁标准溶液铁标贮备液 : 取 g 纯金属铁, 用盐酸或硝酸溶解后, 用 0.1N 盐酸稀释到 1000mL, 移入聚乙烯塑料瓶内, 存放在 4 冰箱,1mL 含 1mg 铁铁标工作液 : 取 10mL 贮备液, 用 0.1N 盐酸定容至 l00ml,lml=l00µg 铁操作样品收集及处理取静脉血 2mL 于盛有 l0mg 草酸钾的 5mL 试管中 ( 于每试管中加入 0.2mL5% 草酸钾, 置烘箱中烤干即成 ), 离心 (3000 转 / 分 )15 分钟将分离出的血浆吸入另一带盖小试管中, 备用消化取 1.0mL 血浆, 于 100mL 高型烧杯中, 约加 3mL 混合酸消化液, 上盖表皿, 放置数小时或过夜, 在沙浴电热板上徐徐加热煮沸, 在冒白色浓烟激烈作用后溶液呈无色或淡黄色反应终了, 取下烧杯 ( 若酸用量不够, 最后可出现溶液变黑现象, 此时可再加 2 ml 混合酸消化液继续消化直至五色 ) 冷却后用 10-20mL 去离子水冲洗表皿和杯壁, 除去表皿继续加热, 直到再度冒白色浓烟, 待溶液体积接近蒸干, 残留酸量不超过 l ml, 取下冷却, 用蒸馏水稀释至 3mL 测定 57

13 吸取 0.0mL,0.5mL,1.0mL,2.0mL,3.0mL,5.0mL 铁标准应用液, 用 0.1N 盐酸定容至 100mL, 混合, 各容量瓶中每 ml 分别相当于 0µg,0.5µg,1µg,2µg,3µg,5µg 铁将处理后的样液, 试剂空白, 铁标系列溶液分别导入火焰进行测定, 测定条件 (Pekin-Elener403 型原子吸收分光光度计 ): 波长 248.3nm; 空心阴极灯电流 :30mA, 狭缝宽 0.2mm, 空气流量 13.51/min, 乙炔流量 :5.21/ 分以铁含量对应浓度吸光度绘制标准曲线, 根据标准曲线求得样品铁含量计算 (A 1 -A 2 ) V X= 100 m 式中 :X 血浆中铁的含量 (µg/100ml 血清 ) A1 测定用样品液中铁的含量 (mg/l) A 2 测定空白液中铁的含量 (mg/l) V 样品处理液定容总体积 (ml) m 血浆取样量 (ml) 总铁结合量测定试剂铁标准液铬天青 B 铵盐法贮备液 :(3mmol/L) 取 1.176g 硫酸亚铁铵 (6 分子结晶水 ) 置蒸馏水中, 加 50mL 浓硝酸混匀反应 10 分钟, 用蒸馏水定容至 1000mL 工作液 :(30µmol/L) 取 10mL 贮备液, 用蒸馏水定容至 1000mL 原子吸收分光光度法贮备液 : 取 g 纯金属铁, 用盐酸或硝酸溶解后, 用 0.1N 盐酸稀释到 1000mL, 移入聚乙烯塑料瓶内, 存放 4 o C 冰箱,1mL 含 1mg 铁工作液 : 取 10mL 贮备液, 用 0.1N 盐酸定容至 100mL,1mL=100µg 铁轻质碳酸镁 (AR)( 或碱式碳酸镁 ) 其质量应符合要求实验步骤应用铬天青 B 铵盐方法测总铁结合量取 0.1mL 血清放入尖底离心管, 加 60µmol/l 铁标准液 0.1mL 充分混合, 室温放置 15 分钟再加 4-5mg 轻质碳酸镁, 放置 15 分钟, 混合 3-4 次然后以 3000 转 / 分离心 5-8 分钟, 取上清液 0.1mL 按铬天青 B 铵盐比色法测血清铁的步骤进行操作, 计算原子吸收分光光度法测总铁结合量取 1.0mL 血清, 加铁标准液 (20µg/mL) 0.5mL, 充分混合, 放置 15 分钟加 150mg 轻质碳酸镁, 充分混匀 1 分钟以上, 放置 30 分钟, 混合 3-4 次离心 10 分钟, 取上清液 1mL 按原子吸收分光光度法测血清铁的操作步骤进行消化, 测定, 计算计算血清总铁结合量可用 (mg/100l) 表示未饱和铁量 = 血清总铁结合量 - 血清铁 58

14 血清铁血清蛋白运铁蛋白饱和度 (%)= 100 血清总铁结合量数据处理及结果判定实验数据可用方差分析, 但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验, 方差齐, 计算 F 值,F 值 < F 0.05, 结论 : 各组均数间差异无显著性 ;F 值 F 0.05,P 0.05, 用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计 ; 对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换, 待满足正态或方差齐要求后, 用转换后的数据进行统计 ; 若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的, 改用秩和检验进行统计红细胞内游离原卟啉 : 见结果判定受试样品组与对照组比较, 血红蛋白升高且平均升高幅度 10g/L, 血清铁蛋白增加, 血清运铁蛋白饱和度升高, 红细胞游离原卟啉降低, 经统计处理差异有显著性, 即可分别判定该指标结果阳性 2.6 数据处理及结果判定 : 试验数据为计量资料, 可用 t 检验进行分析凡自身对照资料可以采用配对 t 检验, 两组均数比较采用成组 t 检验, 后者需进行方差齐性检验, 对非正态分布或方差不齐的数据进行适当的变量转换, 待满足正态方差齐后, 用转换的数据进行 t 检验 ; 若转换数据仍不能满足正态方差齐要求, 改用 t' 检验或秩和检验 ; 但变异系数太大 ( 如 CV>50%) 的资料应用秩和检验结果判定 : 改善儿童缺铁性贫血 : 试验前后自身比较和试验后组间比较, 血红蛋白红细胞内游离原卟啉二项指标差异有显著性 ; 同时, 试食组自身前后比较, 血红蛋白平均升高幅度 10g/L, 可判定受试样品具有改善缺铁性贫血功能的作用改善成人缺铁性贫血 : 试验前后自身比较和试验后组间比较, 血红蛋白指标差异有显著性 ; 同时, 试食组自身前后比较, 血红蛋白平均升高幅度 10g/L, 血清铁蛋白红细胞内游离原卟啉 / 血清运铁蛋白饱和度二项指标中一项指标阳性, 可判定该受试样品具有改善缺铁性贫血功能 59

材料方法

材料方法生物技术通报姜燕采用鼠抗人血红蛋白单克隆抗体和胶体金标记鼠抗人血红蛋白单克隆抗体及对照抗体羊抗鼠利用双抗体免疫夹心反应原理特异性地结合人血红蛋白抗原在内可得到胶体金显色结果的原理研制便潜血单克隆一步法胶体金检测试卡用于诊断因各种原因引起的消化道出血疾病应用杂交瘤技术制备两株鼠抗人血红蛋白抗体方法检测效价免疫胶体金技术制备胶体金检测试卡法检测效价的结果显示鼠抗人