茂县土地岭大熊猫走廊带

Size: px

Start display at page:

Download "茂县土地岭大熊猫走廊带"

佣胃鲍
5 years ago
Views:

中国组织工程研究 Chinese Journal of Tissue Engineering Research 液相质谱联用法同时检测体外生殖培养液中的 18 种氨基酸 www.crter.

0860 ORCID: 0000-0001-8992-3909( 黄元礼 ) 文章快速阅读 : 建立测试体外生殖培养液中 18 种氨基酸的方法 (1) 样品预处理 ; (2) 排除蛋白及干扰物质 (1) 初筛待测各物质的质谱 ; (2) 分析参数 (1) 设定各参数 ; (2) 方法学考察 ; (3) 测量样品检测 : (1)18 种氨基酸在培养液中的含量 ; (2) 对比标示值 ; (3)

1 中国组织工程研究 Chinese Journal of Tissue Engineering Research 液相质谱联用法同时检测体外生殖培养液中的 18 种氨基酸研究原著黄元礼 1, 柯林楠 1, 李常坤 2, 王春仁 1 ( 1 中国食品药品检定研究院医疗器械所, 北京市 ; 2 岛津企业管理 ( 中国 ) 有限公司, 北京市 ) DOI: /j.issn ORCID: ( 黄元礼 ) 文章快速阅读 : 建立测试体外生殖培养液中 18 种氨基酸的方法 (1) 样品预处理 ; (2) 排除蛋白及干扰物质 (1) 初筛待测各物质的质谱 ; (2) 分析参数 (1) 设定各参数 ; (2) 方法学考察 ; (3) 测量样品检测 : (1)18 种氨基酸在培养液中的含量 ; (2) 对比标示值 ; (3) 评价方法的可行性文题释义 : 人类辅助生殖技术 : 指采用医疗辅助手段使不育夫妇妊娠的技术, 包括人工授精和体外受精 - 胚胎移植及其衍生技术两大类体外生殖培养液 : 是含有能量成分渗透压调节成分酸碱度调节成分氨基酸生长因子等, 保证生殖细胞在体外可以存活并成长的一种培养液不同的体外生殖细胞使用不同的培养液, 在不同的生长阶段, 也会使用不同的培养液, 因此体外生殖培养液的成分对最终体外生殖手术的成功率有很大影响摘要背景 : 目前, 对于体外生殖培养液的质量控制文件或技术标准中, 对成分含量指标及检测方法未做明确规定, 为保证该类产品的安全有效性, 应及早建立质量标准目的 : 采用液相质谱联用法检测体外生殖培养液中 18 种氨基酸指标成分, 分析不同用途培养液中 18 种氨基酸的含量方法 : 采用超高效液相色谱三重四级杆质谱联用法, 检测体外生殖培养液中 18 种氨基酸 ( 甘氨酸亮氨酸蛋氨酸酪氨酸组氨酸苏氨酸丙氨酸异亮氨酸色氨酸胱氨酸赖氨酸天门冬氨酸缬氨酸苯丙氨酸脯氨酸丝氨酸谷氨酸精氨酸 ) 指标成分, 色谱柱为 SUPELCO Discovery HS F5-3(15 cm 2.1 mm,3 μm), 流动相为 0.1% 甲酸水溶液 -0.1% 甲酸乙腈溶液, 梯度洗脱, 流速 0.35 ml/min, 柱温 40 ; 质谱采用电喷雾离子源, 负离子模式扫面, 扫描方式为多反应监测结果与结论 :18 种氨基酸在 mmol/l 浓度范围内线性关系练好 ;18 种氨基酸的平均加样回收率在 86.3%-125.3% 之间, 精密度实验与重复性实验的相对标准偏差均小于 4.7%, 说明采用液相质谱联用法检测体外生殖培养液灵敏快速准确专属性强, 可为体外生殖培养液的质量标准研究提供依据关键词 : 超高效液相 ; 三重四级杆质谱仪 ; 体外生殖培养液 ; 氨基酸 ; 含量 ; 质量控制 ; 组织工程 ; 生物材料主题词 : 氨基酸类 ; 受精, 体外 ; 色谱法, 液相 ; 质量控制 ; 组织工程基金资助 : 国家重点研发计划 (2016YFC ) Simultaneous determination of 18 different amino acids in in vitro fertilization medium by ultra-high performance liquid chromatography tandem mass-spectrometry Huang Yuan-li 1, Ke Lin-nan 1, Li Chang-kun 2, Wang Chun-ren 1 ( 1 National Institutes for Food and Drug Control, Beijing , China; 2 Shimadzu (China) Co., Ltd., Beijing , China) Abstract BACKGROUND: At present, in the quality control file or technical standards of in vitro fertilization medium, indicators for component contents and detection methods have not yet been defined. To ensure the safety and effectiveness of these products, we should try to establish and improve the quality standards. OBJECTIVE: To establish a method for simultaneously testing 18 kinds of amino acids by ultra-high performance liquid chromatography tandem mass-spectrometry (UHPLC-MSMS), and to analyze the difference in the content 黄元礼, 男,1985 年生, 北京市人, 汉族,2015 年中国医学科学院药物研究所毕业, 硕士, 助理研究员, 主要从事医疗器械化学性能评价研究组织工程生物材料的性能评价研究共同第一作者 : 柯林楠, 女,1977 年生, 北京市人, 汉族,2004 年中科院生态环境研究中心毕业, 硕士, 副主任技师, 从事医疗器械质量控制临床前安全评价及标准化工作通讯作者 : 王春仁, 博士, 研究员, 国务院政府特殊津贴专家, 现任中国食品药品检定研究院医疗器械所生物材料室主任, 中国食品药品检定研究院医疗器械所, 北京市中图分类号 :R318 文献标识码 :B 稿件接受 : Huang Yuan-li, Master, Assistant researcher, National Institutes for Food and Drug Control, Beijing , China Ke Lin-nan, Master, Associate chief technician, National Institutes for Food and Drug Control, Beijing , China Huang Yuan-li and Ke Lin-nan contributed equally to this work. Corresponding author: Wang Chun-ren, M.D., Researcher, National Institutes for Food and Drug Control, Beijing , China 文章编号 : (2018)

2 黄元礼, 柯林楠, 李常坤, 王春仁. 液相质谱联用法同时检测体外生殖培养液中的 18 种氨基酸 [J]. 中国组织工程研究,2018,22(18): DOI: /j.issn of different amino acids in the medium for different uses. METHODS: Using the UHPLC-MSMS, we detected the indicator components of 18 different amino acids in the in vitro fertilization medium. These amino acids included glycine, leucine, methionine, tyrosine, histidine, threonine, alanine, isoleucine, tryptophan, cystine, lysine, aspartic acid, valine, phenylalanine, valine, serine, glutamic acid, arginine. The UHPLC separation was performed on a SUPELCO Discovery HS F5-3 column (15 cm 2.1 mm, 3 μm) in a gradient elute mode with acetonitrile and water (both containing 0.1% formic acid) as the mobile phase at a flow rate of 0.35 ml/min. The column temperature was 40. MS detection was performed with multiple-reaction monitoring mode using negative electro spray ionization. RESULTS AND CONCLUSION: The linearity was achieved in the range of mmol/l for the 18 different amino acids. The average recovery rate of these amino acids ranged 86.3% to 125.3%. The relative standard deviation of the precision experiment and the repeatability experiment was less than 4.7%. These findings indicate that this is a sensitive, rapid, accurate, and specific method that can be used for the quality control of in vitro fertilization medium. Subject headings: Amino Acids; Fertilization in Vitro; Chromatography, Liquid; Quality Control; Tissue Engineering Funding: the National Research and Development Plan of China, No. 2016YFC 引言 Introduction 自从 1978 年首列采用体外受精 - 胚胎移植技术的婴儿诞生以来, 该技术已发展 30 余年, 其主要操作过程是分别将卵子与精子取出后置于体外使其受精, 用人工方法让精子和卵子在体外进行早期胚胎发育, 然后将胚胎移植到母体子宫内发育而诞生婴儿, 是解决不育不孕症乃至实现优生优育的重要技术手段 [1-9] 尽管科技不断发展, 但辅助生殖技术仍面临一系列问题及困难作为该技术的关键一环卵母细胞与胚胎的体外培养, 一般会同时培育 10 个左右的胚胎, 但只会移植其中的二三个胚胎胚胎质量是影响临床妊娠结局的重要因素, 如何选择高质量高发育潜能的胚胎进行移植, 是辅助生殖技术能否成功的关键前提 [10] 目前, 胚胎形态学分析是最常用的评价胚胎质量方法, 其根据卵裂球数量发育速度碎片多核空泡和卵裂球均一性等形态学评估胚胎质量 [11] 形态学评估具有直观简便的特点, 便于迅速选择胚胎, 但也具有一定的局限性胚胎形态并不能够准确反映卵子与胚胎的发育潜能, 除了分裂期胚胎的形态学观测有较为公认的评估指标外, 其他时期胚胎质量评定缺少国际公认的标准 [12], 同时, 形态学评价具有主观性, 可重复性较低近年来, 很多研究表明, 体外胚胎培养液代谢成分分析即代谢组学研究, 可更有效评价胚胎质量自 1999 年 [13] Nicholson 等首次提出代谢组学的概念 : 对受病理生理刺激或基因改变的生物体系所反应的动态代谢物进行多参数定量分析, 反映生物体系受外部刺激所做出的变化胚胎代谢成分的产生, 一定程度上表现了胚胎自我修复的能力常见的代谢指标有血小板活性因子 [14] 人类白细胞抗原 G [15] 葡萄糖 [16] 活性氧 [17] 氨基酸等氨基酸参与胚胎发育的多种中药生理过程, 其代谢水 [18] 平可在一定程度上反映胚胎的发育潜能 Houghton 等利用高效液相色谱技术测定了不同发育阶段胚胎的氨基酸水平, 发现囊胚在发育过程中, 氨基酸的代谢是有区别的 [19] Brison 等发现甘氨酸亮氨酸水平降低和天冬氨酸水平升高, 能够提高临床妊娠率和活产率还有多篇报道表明氨基酸与胚胎的质量有关联 [20-22] 因此, 使用合适的检测手段准确评价胚胎培养液中的氨基酸含量, 对提高体外生殖技术成功率有较为重要的意义作者采用液相质谱联用法同时检测体外生殖培养液中的 18 种氨基酸, 无需衍生化及加同位素内标处理, 可稀释样本后直接进样测试, 显著提高了检测效率, 可作为分析培养液中氨基酸的一种分析方法 1 材料和方法 Materials and methods 1.1 设计建立评价测试方法 1.2 时间及地点实验于 2017 年 3 月在中国食品药品检定研究院完成 1.3 材料 18 种氨基酸对照品 : 甘氨酸亮氨酸蛋氨酸酪氨酸组氨酸苏氨酸丙氨酸异亮氨酸色氨酸胱氨酸赖氨酸天门冬氨酸缬氨酸苯丙氨酸脯氨酸丝氨酸谷氨酸精氨酸, 由中国食品药品检定研究院提供市售 6 种人类辅助生殖技术用液, 连续胚胎培养液, 等渗分离培养液, 精子冲洗液, 连续受精培养液, 囊胚培养液, 连续卵裂培养液, 其中等渗分离培养液和精子冲洗液不含氨基酸, 但分别含有硅胶颗粒及人血清白蛋白, 作为空白对照溶液 ; 乙腈 ( 色谱纯 ) 购自 Fisher Scientific 公司 ; 甲酸 ( 色谱纯 ) 购自 MERCK 公司 ; 岛津 LCMS-8060 三重四级杆质谱仪, 配备电喷雾离子源 ; 岛津 LC-30A 超高效液相色谱, 包括 LC-30AD 2 输液泵,DGU-20A5 在线脱气机, SIL-30AC 自动进样器,CTO-20AC 柱温箱,CBM-20A 系统控制器 ;Sartorius CP225D 电子天平 ; 日立 CR21G 冷冻离心机 ;IKA VORTEX GENIUS3 振荡器 ; 密理博 Milli-Q 超纯水仪 1.4 方法色谱条件色谱柱 :SUPELCO Discovery HS F5-3 (15 cm 2.1 mm,3 μm), 流动相为体积分数为 0.1% 甲酸水溶液 (A)- 体积分数为 0.1% 甲酸乙腈溶液 (B), 梯度洗脱程序见表 1; 流速 :0.35 ml/min; 柱温 40 ; 进样量 1 μl 质谱条件离子源 : 电喷雾离子源 ; 离子检测方式 : 多反应监测 ; 离子极性 : 负离子 ; 离子源接口电压 :-3.0 kv; 雾化气 : 氮气,3.0 L/min; 干燥气 : 氮气,15 L/min; 加热气 : 空气,10 L/min; 碰撞气 : 氩气 ; 脱溶剂管温度 : 250 ; 加热模块温度 :400, 接口温度 :300 ;18 种氨基酸的质谱分析条件参数见表溶液制备对照品储备液 : 精密称取 18 种氨基酸的对照品适量, 加纯化水配成浓度为 2.5 mmol/l 的对照品储备液对照品系列溶液 : 取对照品储备液, 依次用纯化水稀释成浓度为 0.25,0.5,2.5,5.0,12.5 μmol/l 的标准系 2916 ISSN CN /R CODEN: ZLKHAH

3 Huang YL, Ke LN, Li CK, Wang CR. Simultaneous determination of 18 different amino acids in in vitro fertilization medium by ultra-high performance liquid chromatography tandem mass-spectrometry. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2018;22(18): DOI: /j.issn 表 1 流动相梯度洗脱程序 Table 1 Procedure of gradient elution in the mobile phase 时间 (min) 流动相比例 (%) 停止表 2 十八种氨基酸的质谱分析参数 Table 2 Mass spectral parameters of the 18 different amino acids 成分定量离子 (m/z) 成分定量离子 (m/z) 甘氨酸 > 赖氨酸 > 丙氨酸 > 谷氨酸 > 脯氨酸 > 蛋氨酸 > 丝氨酸 > 组氨酸 > 缬氨酸 > 苯丙氨酸 > 苏氨酸 > 精氨酸 > 亮氨酸 > 酪氨酸 > 异亮氨酸 > 胱氨酸 > 天冬氨酸 > 色氨酸 > 列溶液供试品溶液 : 取培养液取培养液 200 μl, 加 200 μl 乙腈, 混匀后, r/min 离心 1 min, 取上清液稀释 10 倍后, 作为待测液, 个别氨基酸含量超过检测限, 继续稀释 10 倍后作为待测液专属性实验分别取上述对照品溶液供试品溶液进行测试, 得到总离子流图, 分析样品的专属性线性关系考察精密吸取 18 种氨基酸的混合标准系列溶液, 分别进样, 记录峰面积以对照品浓度 X 为横坐标, 峰面积 Y 为纵坐标进行线性回归, 绘制标准曲线最低检出限及最低定量限取对照品逐级稀释, 至主峰与噪音峰面积之比为 3/1( 即信噪比 S/N=3/1) 时, 得到各氨基酸的最低检出限 (LOD), 同理可得 S/N=10 时, 得到各氨基酸的最低定量限 (LOQ) 精密度实验精密吸取对照品溶液, 在上述色谱条件下, 连续进样 6 次, 记录峰面积, 计算峰面积的相对标准偏差重复性实验取同一批次样品, 按供试品溶液制备方法制备 6 份供试品溶液, 在上述色谱条件下, 记录峰面积, 计算 18 种氨基酸峰面积的相对标准偏差加样回收率实验取已知氨基酸含量的连续胚胎培养液, 共 9 份, 按低中高质量浓度分别精密加入混合对照品溶液适量, 按供试品溶液制备方法制备每一浓度溶液各 3 份, 分别进样, 记录峰面积, 计算加样回收率 1.5 主要观察指标 18 种氨基酸在体外生殖培养液中的含量 2 结果 Results 2.1 专属性实验对照品溶液及空白溶液 ( 精子冲洗液 ) 的总离子流图见图 1, 由于采用多通道测试, 对照品的出峰位置未见干扰峰, 专属性良好 2.2 线性关系考察在 μmol/l 的浓度范围内, 18 种氨基酸具有良好的线性关系, 相关系数 r 大于 0.999( 表 3) 在 μmol/l 的浓度范围内,18 种氨基酸具有良好的线性关系, 相关系数 r 大于 0.999( 表 3) 2.3 最低检出限及最低定量限实验 18 种氨基酸的最低检出限在 μmol/l 范围内, 最低定量限在 μmol/l, 见表精密度实验 18 种氨基酸峰面积的相对标准偏差在 0.6%-2.0% 范围内, 见表 3, 表明仪器精密度良好 2.5 重复性实验 18 种氨基酸峰面积的相对标准偏差在 0.8%-2.5% 范围内, 见表 3, 表明重复性良好 2.6 加样回收率实验 18 种氨基酸的回收率见表不同样品含量的测定取项下制备好的待测液进行测试, 各培养液中 18 种氨基酸的含量见表 5 3 讨论 Discussion 3.1 研究对象的选择在体外受精胚胎移植过程中, 胚胎在不同阶段会接触不同种类的培养液, 体外生殖培养液作为体外受精胚胎移植技术所需的必备医疗器械, 其安全有效性必须得到控制培养液的配方研究及配制是一项非常复杂的工作, 一方面要模拟人体的自然生理环境, 为生殖细胞提供最优的生存环境 ; 另一方面还要保证对胚胎婴儿无不良影响氨基酸作为胚胎培养过程中重要的调控因子, 不仅是胚胎生物合成生长所需的重要成分, 同时还参与碳水化合物代谢渗透压及细胞内 ph 值的调节等胚胎代谢氨基酸程度的不同, 以及代谢种类的不同, 都会导致不同的妊娠结局例如, 在囊胚阶段的胚胎培养基中, 亮氨酸明显降低, 谷氨酸和丙氨酸含量增加未发育到囊胚阶段的胚胎培养基中, 亮氨酸异亮氨酸蛋氨酸缬氨酸精氨酸天门冬酰胺及谷氨酰胺的含量有明显降低, 而谷氨酸甘氨酸丙氨酸天门冬氨酸及赖氨酸含量增加 [18] 同时, 有研究表明, 发育较好的胚胎培养液中甘氨酸和亮氨酸含量较少, 而天冬氨酸含量较高 [19-22] 这就提示, 氨基酸代谢能够区分发育潜能高的胚胎, 同时, 含量低的氨基酸说明胚胎在消耗这种氨基酸, 增加这种氨基酸在培养液中的含量有利于胚胎的成长因此, 通过准确快速的测量胚胎培养液中的氨基酸含量, 选择其中具有发育潜能的优质胚胎进行移植, 会提高体外受精 - 胚胎移植的成功率, 产生较多的社会及经济效益 3.2 研究方法的选择现阶段, 测量氨基酸多采用 3 种仪器, 分别为高效液相色谱氨基酸分析及液相质谱联用法高效液相色谱法是最普及的检测方法, 通过对氨基酸衍生化后进行分析, 适合工业化检测, 但由于衍生化需手工操作, 且氨基酸分离效果差, 无法精确定量, 分析时间也较长 ( 每个样本约用 1 h) 氨基酸分析法采用在线衍生化, 降低了人为影响因素, 但其本质为高效液相色谱, 因此分析时间同样较长液相质谱联用法分析时间短, 分离效果好, 可进行高通量检测且重复性好, 作者采用液相质谱联用法 P.O. Box 10002, Shenyang

4 黄元礼, 柯林楠, 李常坤, 王春仁. 液相质谱联用法同时检测体外生殖培养液中的 18 种氨基酸 [J]. 中国组织工程研究,2018,22(18): DOI: /j.issn A B min 图 1 对照品溶液及空白溶液的总离子流图 Figure 1 Mass extracted ion chromatogram of STD and BLANK min 图注 : 图中 A 为氨基酸混合对照品,B 为空白溶液 1 代表胱氨酸,2 代表天冬氨酸,3 代表丝氨酸,4 代表甘氨酸,5 代表苏氨酸,6 代表谷氨酸,7 代表丙氨酸,8 代表脯氨酸,9 代表赖氨酸,10 代表组氨酸,11 代表精氨酸,12 代表缬氨酸,13 代表蛋氨酸,14 代表酪氨酸,15 代表亮氨酸,16 代表异亮氨酸,17 代表苯丙氨酸,18 代表色氨酸, 氨基酸浓度为 2.5 μmol/l 表 3 十八种氨基酸的线性关系 Table 3 The linearity correlations of 18 different amino acids 氨基酸回归方程线性范围 (μmol/l) r 值最低检出限 (μmol/l) 最低定量限 (μmol/l) 精密度重复性甘氨酸 Y= X 丙氨酸 Y= X 脯氨酸 Y= X 丝氨酸 Y= X 缬氨酸 Y= X 苏氨酸 Y= X 亮氨酸 Y= X 异亮氨酸 Y= X 天冬氨酸 Y= X 赖氨酸 Y= X 谷氨酸 Y= X 蛋氨酸 Y= X 组氨酸 Y= X 苯丙氨酸 Y= X 精氨酸 Y= X 酪氨酸 Y= X 胱氨酸 Y= X 色氨酸 Y= X 表 5 十八种氨基酸在培养液中的含量 Table 5 Contents of 18 different amino acids in the in vitro fertilization medium (mg/l) 成分连续胚胎培养液中含量等渗分离培养液中含量精子冲洗液中含量受精连续培养液中含量囊胚培养液中含量卵裂连续培养液中含量甘氨酸丙氨酸脯氨酸丝氨酸缬氨酸苏氨酸亮氨酸异亮氨酸天冬氨酸赖氨酸谷氨酸蛋氨酸组氨酸苯丙氨酸精氨酸酪氨酸胱氨酸色氨酸 ISSN CN /R CODEN: ZLKHAH

5 Huang YL, Ke LN, Li CK, Wang CR. Simultaneous determination of 18 different amino acids in in vitro fertilization medium by ultra-high performance liquid chromatography tandem mass-spectrometry. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2018;22(18): DOI: /j.issn 表 4 十八种氨基酸的回收率 Table 4 Recoveries of 18 different amino acids 成分样品含量加入量测得量回收率 (%) 相对标准偏差 (%) 成分样品含量加入量测得量回收率 (%) 相对标准偏差 (%) 甘氨酸赖氨酸丙氨酸谷氨酸脯氨酸蛋氨酸丝氨酸组氨酸缬氨酸苯丙氨酸苏氨酸精氨酸亮氨酸酪氨酸异亮氨酸天冬氨酸胱氨酸色氨酸 P.O. Box 10002, Shenyang

6 黄元礼, 柯林楠, 李常坤, 王春仁. 液相质谱联用法同时检测体外生殖培养液中的 18 种氨基酸 [J]. 中国组织工程研究,2018,22(18): DOI: /j.issn 分析各个成分, 专属性强, 即使色谱柱无法完全分离, 在质谱检测器中各组分也不互相干扰同时, 由于其兼顾了液相的特点, 测试范围宽, 样品稀释倍数较少, 在提高了定量准确性的同时也大幅缩短了检测时间 3.3 测试结果分析该方法符合方法学验证要求, 检测结果准确, 重复性好, 回收率高在同一色谱条件下, 仅需对培养液进行除蛋白处理, 即可同时完成 18 种氨基酸的含量测定, 提高了检测的工作效率不同作用的体外生殖培养液中,18 种氨基酸含量也不同, 对比检测结果与投药量, 实验的检测结果均在标示含量允许范围内通过对比不同种类培养液中氨基酸的投药量, 可看出在胚胎成长阶段使用的培养液中, 会加入大量的甘氨酸, 与前文中提到为有利于胚胎成长应在培养液中增加消耗较多的氨基酸相互对应同时, 由于不同阶段胚胎消耗不同的氨基酸, 在囊胚培养液中, 天冬氨酸赖氨酸的含量明显较高, 在连续胚胎培养液中, 精氨酸的含量高于其他培养液说明在商品化的胚胎培养液中, 已开始关注氨基酸对胚胎的影响并调整氨基酸在培养液中的配比 3.4 研究展望此次研究通过建立一种体外生殖培养液中氨基酸测试的方法, 测定了几种商业化胚胎培养液中的氨基酸含量, 结果表明本方法具有可行性本方法取样量仅为 1 μl( 如含蛋白则需 100 μl), 取样量小, 适合胚胎培养过程中实时监测, 为配方筛选及改进提供帮助, 更适合于在胚胎培养中连续取样分析由于胚胎容受期较短, 迅速准确地分辨出哪个胚胎的成活率高是今后研究的重点同时, 培养液中还含有蛋白质抗生素抗凝剂维生素及无机盐类 [23-24], 各种物质联合起到促进细胞和胚胎发育保持活力等多种作用此次实验仅检测培养液配方中的一类, 有必要在后续工作中逐步建立培养液中其他物质的含量测定方法, 对培养液进行有效质量控制, 并尽早建立相关的质量技术标准, 提高辅助生殖技术的成功率作者贡献 : 第一作者进行实验设计和实验实施, 资料收集为第一作者完成, 由第一二作者成文, 第三作者审校经费支持 : 该文章接受了国家重点研发计划 (2016YFC ) 的资助所有作者声明, 经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道利益冲突 : 文章的全部作者声明, 在课题研究和文章撰写过程, 不存在利益冲突伦理问题 : 未涉及伦理冲突内容文章查重 : 文章出版前已经过 CNKI 反剽窃文献检测系统进行 3 次查重文章外审 : 文章经国内小同行外审专家双盲外审, 符合本刊发稿宗旨作者声明 : 黄元礼对研究和撰写的论文中出现的不端行为承担责任论文中涉及的原始图片数据 ( 包括计算机数据库 ) 记录及样本已按照有关规定保存分享和销毁, 可接受核查文章版权 : 文章出版前杂志已与全体作者授权人签署了版权相关协议开放获取声明 : 这是一篇开放获取文章, 根据知识共享许可协议署名 - 非商业性使用 - 相同方式共享 3.0 条款, 在合理引用的情况下, 允许他人以非商业性目的基于原文内容编辑调整和扩展, 同时允许任何用户阅读下载拷贝传递打印检索超级链接该文献, 并为之建立索引, 用作软件的输入数据或其它任何合法用途 4 参考文献 References [1] 庄广伦, 卢光琇, 石一复, 等. 辅助生育技术进展 [J]. 中国实用妇科与产科杂志,2001,17(1):6-31. [2] 韩堃, 郑源强, 石艳春. 人类辅助生殖技术研究进展 [J]. 中国妇幼健康研究, 2008,19(6): [3] 彭靖, 卢大儒. 试管婴儿技术的发展与探讨 [J]. 自然杂志, 2010,32(6): [4] 丁萍, 张爱青, 孟凡会, 等. 影响助生殖技术的因素分析 [J]. 青岛大学医学院学报,2001,37(4): [5] 梅志强. 人类辅助生殖技术的发展历史与现状 [J]. 中国计划生育学杂志, 2008,16(10): [6] 庄广伦. 辅助生殖技术的发展历程 [J]. 中国实用妇科与产科杂志, 2010, 26(10): [7] 陈贵安. 北京大学第三医院开展辅助生育技术近 10 年回顾 [J]. 北京大学学报 : 医学版,2002,34(5): [8] 张婷, 王晓民. 体外受精与试管婴儿外受精与年诺贝尔生理学或医学奖简介 [J]. 首都医科大学学报,2010,31(5): [9] 乔杰, 马彩虹. 中国辅助生殖技术发展现状 [J]. 国际生殖健康 / 计划生育杂志,2012,31(5): [10] 甄璟然, 郁琦. 体外培养中胚胎发育潜能的评价 [J]. 发育医学电子杂志, 2014,2(2): [11] Alpha Scientists in Reproductive Medicine and ESHRE Special Interest Group of Embryology.The Istanbul consensus workshop on embryo assessment: proceedings of an expert meeting.hum Reprod. 2011;26(6): [12] Guerif F,Gouge A,Giraudeau B,et al.limited value of morphological assessment at days 1 and 2 to predict blastocyst development potential: A prospective study based on 4042 embryos.hum Reprod. 2007;22(7): [13] Nicholson JK,Lindon JC,Holmes E.'Metabonomics': understanding the metabolic responses of living systems to pathophysiological stimuli via multivariate statistical analysis of biological NMR spectroscopic data. Xenobiotica.1999;29(11): [14] Pumel ET,Warner CM,Kort HI,et al.influence of the preimplantation embryo development (Ped) gene on embryonic platelet-activating factor (PAF) levels.j Assist Reprod Genet.2006;23: [15] Sher G,Keskintepe L,Fisch JD,et al.soluble human leukocyte antigen G expression in phase I culture media at 46 hours after fertilization predicts pregnancy and implantation from day 3 embryo transfer.fetil Steril.2005;83: [16] Zheng P,Rita Vassena R,Latham KE.Effects of in vitro oocyte maturati on and embryo culture on the expression of glucose transporters, glucose metabolism and insulin signaling genes in rhesus monkey oocytes and preimplantation embryos.mol Hum Reprod. 2007;13: [17] Bedin Pasqualotto E.Oxidative stress in follicular fluid [C].ESHRE Campus 2005 Copenhagen,Denmark 29 and 30 April,2005: [18] Houghton FD,Hawkhead JA,Humpherson PG,et al. Non-invasive amino acid turnover predicts human embryo developmental capacity. Hum Reprod.2002;17(4): [19] Brison DR,Houghton FD,Falconer D,et al.identification of viable embryos in IVF by non-invasive measurement of amino acid turnover. Hum Reprod.2004;19(10): [20] Sturmey RG,Hawkhead JA,Barker EA,et al.dna damage and metabolic activity in the preimplantation embryo.hum Reprod. 2009;24(1): [21] Seli E,Sakkas D,Scott R,et al.noninvasive metabolomic profiling of embryo culture media using Raman and near-infrared spectroscopy correlates with repraduefive potentlal of embryos in women undergoing in vitro fertilization.fenil Stefil. 2007; 88: [22] Seli E,Botros L,Sakkas D,et al.non-invasive metabolomic profiling of embryo culture media using proton NMR correlates with reproductive potential of embryos in women undergoing in vitro fertilization.fenil Steril. 2008;90: [23] 王增艳, 何方方, 孙正怡, 等. 冷冻环玻璃化法冷冻小鼠卵母细胞的效果评价 [J]. 生殖医学杂志,2008,17(1): [24] 李宗武, 朱传金, 刘庆勇. 人血浆及精浆中钙镁锌铜对精液成分的影响 [J]. 国外医学 : 医学地理分册, 2004,25(3): ISSN CN /R CODEN: ZLKHAH

DOI /j.issn Food Research And Development UPLC-MS/MS 5 0.

DOI /j.issn Food Research And Development UPLC-MS/MS 5 0. 118 217 5 38 1 DOI 1.3969/j.issn.5-6521.217.1.28 Food Research And Development 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1. 731 2. 731 - UPLC-MS/MS 5. 1 mol/l ProElut PXC 5 % - Thermo Hypersil Gold mm 2.1 mm 1.9 μm ESI