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1 第 8 卷第 9 期食品安全质量检测学报 Vol. 8 No 年 9 月 Journal of Food Safety and Quality Sep., 2017 高效液相色谱法检测保健食品中的番茄红素王梅 *, 任炼, 袁平, 唐雪林 ( 重庆市永川食品药品检验所, 重庆 ) 摘要 : 目的建立高效液相色谱法测定保健食品中番茄红素的分析方法方法用含有 0.1% 2,6- 二叔丁基 -4- 甲基苯酚抗氧化剂的甲醇 : 二氯甲烷 (10:90, V:V) 作为提取溶液通过 Agilent Eclipse XDB-C 18 (4.6 mm 250 mm, 5 µm) 色谱柱 ; 甲醇 : 乙酸乙酯 (85:15, V:V) 作为流动相, 二极管阵列检测器, 检出波长 475 nm, 色谱柱温 25, 流速 1.0 ml/min, 进样体积 10 μl, 作为检测条件结果番茄红素在 0~200 μg/ml 范围内线性良好, 相关系数 r=0.9995, 最低检出限为 μg/ml, 平均回收率在 89.7%~109.8% 之间, RSD 为 8.4% 结论本方法可以准确快速地检测保健食品中的番茄红素关键词 : 保健食品 ; 番茄红素 ; 高效液相色谱法 Determination of lycopene in health food by high performance liquid chromatography WANG Mei *, REN Lian, YUAN Ping, TANG Xue-Lin (Chongqing Yongchuan Institute for Food and Drug Control, Chongqing , China) ABSTRACT: Objective To establish a method for determination of lycopene in health food by high performance liquid chromatography (HPLC). Methods Mixed solution of methyl alcohol: dichloromethane (10:90, V:V) with 0.1% 2,6-di-tert-butyl-4-methylphenol (BHT) antioxidants were used as extraction solutions. The extracting solutions were injected into HPLC system equipped with a diode array detector (DAD) at the absorption wavelength of 475 nm, with an Agilent Eclipse XDB-C 18 reverse phase column (4.6 mm 250 mm, 5 µm), which was kept at 25. The mobile phase was composed of 85% methanol and 15% ethyl acetate at a flow rate of 1.0 ml/min. The injection volume was 10 μl. Results The linearity range was 0~200 μg/ml (r=0.9995), the limit of detection (LOD) was μg/ml, and the average recoveries were between 89.7% and 109.8% with RSD of 8.4%. Conclusion This method can accurately and quickly determine the lycopene in healthy food. KEY WORDS: healthy food; lycopene; high performance liquid chromatography 1 引言番茄红素 (lycopene) 是自然界中广泛存在的一种类胡萝卜素 (carotenes), 属于含非氧化分子的脂溶性色素 [1], 其具有清除自由基抑制前列腺癌细胞生长增强免疫力 DNA 修复防癌预防心血管疾病和慢性病等生理作用 [2-7] 番茄红素作为增强免疫力类保健食品的功效成分, 越来越多的用于保健食品生产目前, 检测番茄红素的方法主要有分光光度法 [8] 薄 [9] 层色谱法和高效液相色谱法 (high performance liquid chromatography, HPLC) [10] 等分光光度法易受其他色素影响, 薄层色谱法耗时长不易定量 [11,12], 而 HPLC 具有分 * 通讯作者 : 王梅, 硕士, 工程师, 主要研究方向为食品化妆品检测 @qq.com *Corresponding author: WANG Mei, Master, Engineer, Chongqing Yongchuan Institute for Food and Drug Control, Chongqing , China @qq.com

2 3354 食品安全质量检测学报第 8 卷离效果好干扰少耗时短能准确定量检出浓度更低等优点 [13,14] GB 食品添加剂番茄红素 ( 合成 ) [15] 适用于食品与其他类胡萝卜素生产中常用的合成中间体作为原料经维地稀缩合反应制得食品添加剂番茄红素, 不适用于直接以番茄红素作为原料制成的保健食品中番茄红素的检测 GB/T 保健食品中番茄红素的测定 [16] 是以焦性没食子酸 - 二氯甲烷作为提取溶剂, 焦性没食子酸的目的是为了延缓番茄红素的分解, 由于焦性没食子酸不溶于二氯甲烷, 且不稳定, 必须严格控制检测时间, 通过加大流速, 提高柱温等方式, 达到快速准确的检测因此, 需要一种稳定性更好的抗氧化性试剂替代焦性没食子酸, 以有效提高保健食品中番茄红素测定的准确性本文以含有番茄红素的胶囊保健品为试验材料, 优化提取方法, 改进流动相, 建立一种快速准确检测保健食品中番茄红素的高效液相色谱法, 旨在保障市场的规范化, 保护广大消费者的权益 2 材料与方法 2.1 材料试剂与仪器市售番茄红素保健食品 ( 威海紫光生物科技开发有限公司 ) 二氯甲烷 ( 分析纯, 成都市科龙化工试剂厂 ); 石油醚 ( 分析纯, 重庆川东化工 ( 集团 ) 有限公司 ); 丙酮 ( 优级纯, 成都市科龙化工试剂厂 ); 乙酸乙酯 ( 色谱纯, 成都市科隆化学品有限公司 ); 甲醇乙腈 ( 色谱纯, Merck KGaA); 2,6- 二叔丁基 -4- 甲基苯酚 (2,6-di-tert-butyl-4-methylphenol, BHT)( 色谱纯, 阿拉丁 ); 番茄红素标准品 ( 纯度 : 95.9%, 中国食品药品检定研究院 ) Waters e2695 超高效液相色谱仪 ( 美国 Waters 公司 ); IDH 20 超声波提取仪 ( 爱安姆科技 ( 北京 ) 有限公司 ) 2.2 样品处理优化准确称取 ~ g( 精确至 g) 市售番茄红素保健食品至 25 ml 离心管, 分别加入含有 0.1%BHT 的二氯甲烷石油醚乙酸乙酯丙酮提取溶剂各 10 ml, 超声 30 min( 超声仪中加入冰块保持低温 ), 定容至刻度精密吸取上述提取液各 2.0 ml, 加入甲醇稀释至 10 ml, 观察现象, 过 0.45 μm 滤膜后待用尽量在避光条件下提取以甲醇 : 乙腈 (50:50, V:V) 为流动相, 不同溶剂的提取液和稀释后的溶液进行上机检测 2.3 色谱条件色谱柱 : Agilent Eclipse XDB-C 18 (4.6 mm 250 mm, 5 µm); 检测波长为 475 nm, 色谱柱温 25, 流速 1.0 ml/min, 进样体积 10 μl 2.4 流动相选择与优化分别以甲醇 : 乙腈 (50:50, V:V) 甲醇: 乙酸乙酯 (50:50, V:V) 甲醇: 乙酸乙酯 (85:15, V:V) 作为流动相, 比较不同流动相对保健食品中番茄红素的分离效果 3 结果与分析 3.1 不同溶剂的提取效果保健食品成分复杂, 提取溶剂显得尤为重要尤其番茄红素是一种易被氧化的功能性物质, 提取及检测过程中物质的不稳定性常导致定量不准确因此, 本研究选用 BHT 作为抗氧化剂 [12] 以二氯甲烷石油醚乙酸乙酯丙酮等 4 种溶剂对胶囊型保健品中的番茄红素进行提取, 提取溶剂的溶解效果见表 1 通过结果比较, 稀释后样品峰面积均出现增大, 二氯甲烷提取液稀释后峰面积增大 10 倍左右, 峰分离效果和纯度较其他几种溶剂好综合上述条件 : 选择用含有 0.1%BHT 的甲醇和二氯甲烷混合液作为提取溶剂, 由于稀释后析出油脂状物质, 继续优化甲醇和二氯甲烷的比例, 当甲醇 : 二氯甲烷 =10:90(V:V) 时效果最好因此, 选用含有 0.1%BHT 的甲醇 : 二氯甲烷 (10:90, V:V) 混合溶液作为提取溶剂, 具有较好的提取效果 3.2 流动相的优化以番茄红素标准品为参照, 以优化后提取条件提取的样品为测试样品, 选择甲醇 : 乙腈和甲醇 : 乙酸乙酯 2 种组合的流动相进行检测结果显示, 样品与标准品出峰时间相同, 当流动相为甲醇 : 乙腈 (50:50, V:V) 时, 出峰时间为 17 min, 只有一个峰, 峰面积为 μv S, 但峰的纯度较低, 包裹有其他物质 ; 以甲醇 : 乙酸乙酯 (50:50, V:V) 为流动相时, 出峰时间为 5 min, 有 2 个未完全分离的峰, 峰纯度较低, 峰面积达到 μv S, 但较甲醇 - 乙腈作流动相好 Table 1 表 1 不同溶剂提取保健品中番茄红素的效果分析 Effects of different solvents on the extraction of lycopene from health care products 二氯甲烷石油醚乙酸乙酯丙酮超声前完全溶解澄清透明深红色未完全溶解有沉淀物橙红色未完全溶解有沉淀物橙红色未完全溶解有沉淀物橙红色超声后未有明显变化颜色变深仍未完全溶解颜色变深仍未完全溶解颜色变深仍未完全溶解稀释后出现浑浊析出油脂状物质析出少量油脂状物质析出少量油脂状物质析出少量油脂状物质

3 第 9 期王梅, 等 : 高效液相色谱法检测保健食品中的番茄红素 3355 以甲醇 : 乙酸乙酯为流动相, 优化流动相比例当甲醇 : 乙酸乙酯为 (85:15, V:V) 时, 通过光谱比较, 番茄红素峰已完全分离 ( 见图 1), 且番茄红素的峰纯度较高 ( 见图 2 图 3) 3.3 线性范围和检测限番茄红素用含 0.1%BHT 的甲醇 : 二氯甲烷 (10:90, V:V) 配制成 2.0 mg/ml 标准储备液, 于 -20 冰箱中避光暂时保存用含 0.1% BHT 的甲醇 : 二氯甲烷 (10:90, V:V) 稀释成 μg/ml 的系列标准溶液, 现配现用将番茄红素系列标准溶液上机检测 ( 标准品色谱图见图 4, 标准品光谱图见图 5, 试剂空白色谱图见图 6), 在上述优化的色谱条件下测定以浓度为横坐标峰面积为纵坐标绘制标准曲线其线性回归方程为 Y=77258X-71659, 相关系数 r 为本方法检出限为 μg/ml (S/N=3) 3.4 精密度和重复性将提取的样品重复检测 6 次, 色谱峰的保留时间波动小于 0.1 min, 峰面积相对偏差 (RSD) 为 0.5% 实验方法精密度良好图 1 样品色谱图 Fig. 1 Chromatogram of sample 图 2 峰 1( 番茄红素 ) 的光谱图 Fig. 2 Spectrogram of peak 1 (lycopene)

4 3356 食品安全质量检测学报第 8 卷图 3 峰 2 的光谱图 Fig. 3 Spectrogram of peak 2 图 4 标准品色谱图 Fig. 4 Chromatogram of standard 图 5 番茄红素标准品光谱图 Fig. 5 Spectrogram of lycopene standard

5 第 9 期王梅, 等 : 高效液相色谱法检测保健食品中的番茄红素 3357 图 6 空白色谱图 Fig. 6 Chromatogram of blank 称取 6 份 0.2 g 样品, 按照优化条件提取并测定, 结果见表 2 RSD 值为 2.4%, 重复性良好 3.5 回收率通过向样品中添加已知浓度的番茄红素标样评价本方法的回收率 ( 表 2), 每个样品重复 6 次平均回收率在 89.7%~109.8% 之间, RSD 为 8.4% 组别表 2 HPLC 检测胶囊中番茄红素的回收率 Table 2 Recoveries of lycopene determined by HPLC 样品质量 (g) 加标量 (mg) 测定值 (mg) 回收率 (%) 结论平均回收率 (%) RSD (%) 本研究综合分析保健品中番茄红素的提取和检测方法, 由于番茄红素是一个易氧化的物质, 在制备标准品和提取溶剂中都加入 BHT 试剂甲醇 : 二氯甲烷 (10:90, V:V), 甲醇 : 乙酸乙酯 (85:15, V:V) 为流动相, 最低检出限为 μg/ml 该方法有较好的精密度重复性和较高的回收率, 能够快速简便准确地检测保健品中的番茄红素参考文献 [1] Shen Y, Zhang X, Prinyawiwatkul W, et al. Simultaneous determination of red and yellow artificial food colourants and carotenoid pigments in food products [J]. Food Chem, 2014, 157(8): [2] Zhou SK, Zhang RL, Bi TN, et al. Inhibitory effect of lycopene against the growth of human gastric cancer cells [J]. Afr J Tradit Complem, 2016, 13(4): [3] Borel P, Desmarchelier C, Dumont U, et al. Dietary calcium impairs tomato lycopene bioavailability in healthy humans [J]. Br J Nutr, 2017, 116(12): [4] Manach C, Milenkovic D, Tom VDW, et al. Addressing the inter-individual variation in response to consumption of plant food bioactives-towards a better understanding of their role in healthy ageing and cardiometabolic risk reduction [J]. Mol Nutr Food Res, 2016, DOI: /mnfr [5] Han GM, Han XF. Lycopene reduces mortality in people with systemic lupus erythematosus: A pilot study based on the third national health and nutrition examination survey [J]. J Dermatol Treat, 2016, 27(5): 430. [6] Roldan-Gutierrez JM, Luque de Castro MD. Lycopene: the need for better methods for characterization and determination [J]. Trac-Trend Anal Chem, 2007, 26: [7] Yang CM, Yen YT, Huang CS, et al. Growth inhibitory efficacy of lycopene and β-carotene against androgen-independent prostate tumor cells xenografted in nude mice [J]. Mol Nutr Food Res, 2011, 55(4): [8] Davis AR, Fish WW, Perkins-Veazie P. A rapid hexane-free method for analyzing lycopene content in watermelon [J]. J Food Sci, 2003, 68: [9] 刘博, 黄新异, 邸多隆, 等. 番茄红素软胶囊质量标准研究 [J]. 食品科技, 2009, 34(3): Liu B, Huang XY, Di DL, et al. Study on quality standard for lycopene soft gels [J]. Food Sci Technol, 2009, 34(3): [10] Cucu T, Huvaere K, Bergh MAVD. A simple and fast HPLC method to determine lycopene in foods [J]. Food Anal Method, 2012, 5(5): [11] 程家丽, 刘婷婷, 马彦宁, 等. 液相色谱法测定保健食品中番茄红素的不确定度评定 [J]. 食品安全质量检测学报, 2016, 7(11):

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6 3358 食品安全质量检测学报第 8 卷 Cheng JL, Liu TT, Ma YN, et al. Uncertainty evaluation of the determination of lycopene in health food by high performance liquid chromatography [J]. J Food Saf Qual, 2016, 7(11): [12] 刘婷婷, 程家丽, 张雪松, 等. 保健食品中番茄红素测定方法的建立 [J]. 中国食物与营养, 2017, 23(3): Liu TT, Cheng JL, Zhang XS, et al. Determination on lycopene in health foods by HPLC [J]. Food Nutr China, 2017, 23(3): [13] 陈冬东, 郗存显, 彭涛, 等. 高效液相色谱 - 串联质谱法测定保健食品中的番茄红素 [J]. 食品科学, 2012, 33(20): Chen DD, Xi CX, Peng T, et al. Determination of lycopene in dietary supplements by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry [J]. Food Sci, 2012, 33(20): [14] Ho KKHY, Ferruzzi MG, Liceaga AM, et al. Microwave-assisted extraction of lycopene in tomato peels: Effect of extraction conditions on all- trans, and cis -isomer yields [J]. LWT-Food Sci Technol, 2015, 62(1): [15] GB 食品安全国家标准食品添加剂番茄红素 ( 合成 )[S]. GB National standard of food safety-food additive- Lycopene (composite) [S]. [16] GB/T 保健食品中番茄红素的测定 [S]. GB/T Determination of lycopene in healthy foods [S]. 作者简介 ( 责任编辑 : 杨翠娜 ) 王梅, 硕士, 工程师, 主要研究方向为食品化妆品检测 @qq.com

g ml 10% ph 色谱条件 kinetex C μm 100 A 4. 6 mm 150 mm 25 5 μl A B 10 mmol /L ml /min

g ml 10% ph 色谱条件 kinetex C μm 100 A 4. 6 mm 150 mm 25 5 μl A B 10 mmol /L ml /min 25 4 2013 8 监测技术 5 1 2 1 ( 1. 江苏省疾病预防控制中心, 江苏南京 210009; 2. 南京医科大学第二附属医院, 江苏南京 210029) 5 Phenomenex kinetex C 18 2. 6 μm 4. 6 mm 150 mm 10 mmol /L ph 2. 5 + 60 40 DAD 280 nm 5 20. 0 mg /L ~ 100 mg /L 0.