第 3 期胡明峰, 等 : 基于遥控机械力的重要生物分子的跨细胞膜导入 227 ion channels,we propose a novel solution to the remotely controlled cells Methods We used ultrasonic generator

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暗京江
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1 :5:9 第 35 卷第 3 期北京生物医学工程 206 年 6 月 Beijing Biomedical Engineering Vol 35 No 3 June 206 基于遥控机械力的重要生物分子的跨细胞膜导入胡明峰王颖奇葛琳,2 冯磊 3 李彬 4 杨晟刘晓冬摘要目的生物医学基础研究及其实践应用日益需要在分子细胞与系统活体间建立直接的关联, 解决方案之一是利用非接触方式远程控制细胞生命过程, 当前受到广泛关注的光基因学等手段即为此方面的重要突破性进展研究中的核心问题是如何实现在细胞乃至分子水平上对关键生命物质及生物学过程进行远程调控为此, 基于磁场和超声施加机械力, 并辅助以超声微泡磁纳米颗粒以及机械敏感通道, 提出实现细胞远程控制的新型解决方案方法使用超声输出设备对细胞膜周边的微泡施加机械力, 以黄色荧光蛋白 (yellow fluorescent protein,yfp) 标记的 DNA 作为转基因标记物, 测试不同条件下 DNA 跨膜进入细胞的效率运用化学合成法合成磁纳米颗粒, 使用电磁铁作为磁控系统, 利用细胞钙成像实验监测机械力敏感离子通道的开放情况结果在机械刺激作用下, 细胞外液中的 YFP 质粒可以跨膜进入细胞并有效表达与细胞共培养的磁纳米颗粒在电磁场的作用下, 致使机械敏感离子通道开放钙离子进入细胞及钙成像荧光上升结论基于遥控机械力能够实现生物分子跨膜运送的远程控制通过超声波 ( 强度 >0 6 W / cm 2 ) 诱发微泡爆破从而施加机械冲击并在细胞膜上成孔, 实现了 DNA 跨细胞膜导入及有效表达磁纳米颗粒通过可调控电磁场 ( 8 ~ 20 V,>30 mt) 对细胞膜施加机械刺激, 通过内源性机械敏感机制引起钙电流及膜兴奋性的增加, 从而实现跨膜钙信号的远程控制关键词跨膜运输 ; 磁纳米颗粒 ; 机械敏感离子通道 ; 磁控系统 ; 超声微泡致孔 DOI: / j.issn 中图分类号 R38 04 文献标志码 A 文章编号 (206) Transmembrane delivery of key biomolecules into the cell by remote control of mechanical force HU Mingfeng,WANG Yingqi,GE Lin,FENG Lei,2,LI Bin 3,YANG Sheng 4,LIU Xiaodong Department of Biomedical Engineering,School of Medicine,Tsinghua University,Beijing 00084; 基金项目 : 国家自然科学基金 (87382) 国家科技支撑计划 (202BAH26B0) 清华信息科学与技术国家实验室 ( 筹 )(TNList) 资助作者单位 : 清华大学医学院生物医学工程系 ( 北京 00084) 2 北京医疗器械检验所 ( 北京 000) 3 北京瑞天科技有限公司 ( 北京 00085) 4 清华大学电机工程与应用电子技术系 ( 北京 00084) 通信作者 : 刘晓冬, 教授 E mail:liuxiaodong@ mail.tsinghua.edu.cn 2 Beijing Institute of Medical Device Testing,Beijing 0; 3 Beijing Ruitian Science and Technology Co,LTD,Beijing 00085; 4 Department of Electrical Engineering,Tsinghua University,Beijing Abstract Objective Both basic and applicable research in biomedicine have growing demands in more effective approaches that build direct connections between molecules, cells, systems and bodies One of the solutions is to establish the remote control of cellular processes via non contact manners Optogenetics,as one of the breakthroughs, has caught great attentions in the field The key issue here is how to implement the remote control of crucial entities and processes at the cell and molecular levels Therefore, based on mechanical force through magnetics and ultrasonics,assisted with ultrasound microbubble,magnetic nanoparticles and mechanosensitive

2 第 3 期胡明峰, 等 : 基于遥控机械力的重要生物分子的跨细胞膜导入 227 ion channels,we propose a novel solution to the remotely controlled cells Methods We used ultrasonic generator to stimulate microbubbles around cells to induce mechanical force for membrane sonoporation Yellow fluorescent protein ( YFP ) expression with fluorescence as the index indicated the efficiency of sonoporation thus DNA transported under different conditions For magnetic control of transmembrane Ca 2+, chemically synthesized magnetic nanoparticles (MNP) were driven by electromagnetic control system Results Aided with mechanical stimuli, substantial amount of YFP plasmids successfully went across cell membrane and got expressed The fluorescence of cells co cultured with MNPs was enhanced upon stimulation of magnetic control system Conclusions Our results demonstrate that based on the remote control of mechanical force, one can achieve the remote control of transmembrane transport of key biomolecules The transmembrane transport and expression of DNA can be accomplished through sonoporation ( ultrasound strength: > 0 6 W/ cm 2 ) Cell membrane excitability as well as Ca 2+ signals could be enhanced through electromagnetics (8 to 20 V,>30 mt). Keywords transmembrane transport;magnetic nanoparticles;mechanosensitive ion channel;magnetic control system;sonoporation 0 引言生物医学在基础研究及其实践应用方面都取得了日新月异的进展, 而其中一个瓶颈问题是如何将分子细胞水平的工作与系统活体间建立直接的关联, 从而满足人类了解自身和维系健康的终极需求在分子水平, 基因治疗具有很多无可替代的优点和巨大的应用潜力 [], 而基因治疗研究的先决条件就是使外来基因能够顺利进入细胞, 进而发生重组和表达随着生物医学工程的发展, 人们越来越需要在保证细胞存活的前提下, 通过一定的手段将基因片段或药物等物质传送到细胞内部, 从而达到研究或治疗疾病的目的一方面超声可以对细胞施加机械刺激引起细胞膜周围微气泡的爆破, 进而在细胞膜上冲击出可愈合的小孔 ( sonoporation) 使外来基因进入细胞, 实现生物分子跨膜运输的远程控制该方法为寻找基因或药物等大分子的跨膜运输方式提供新的思路, 为疾病治疗提供新的手段 ; 另一方面, 跨膜钙信号传导及细胞膜的兴奋性对于神经循环及内分泌等生理活动至关重要, 实现跨膜钙信号传导和膜兴奋性的远程控制是现在研究的热点和难点 [2-7] 由于光和电场在组织中有很强的衰减, 所以在动物身上用电学或光学方法进行细胞膜兴奋性的研究非常困难 ; 磁场与生物分子之间具有弱的相互作用并能渗入深层组织, 所以磁场很有希望实现对体细胞跨膜钙信号和膜兴奋性的远程控制细胞膜的兴奋性很多都是由机械敏感离子通道 (mechanical sensitive ion channel,msic) 介导的 [8-9] 如果通过磁纳米颗粒 (magnetic nanoparticles,mnp) 和机械敏感离子通道在磁场作用的条件下实现细胞膜的兴奋性和跨膜钙信号传导, 该方法在研究很多生理活动方面将有很大的用途基于现有的技术和文献, 本研究提出在 MNP 与某些离子通道的机械敏感特性基础上建立磁纳米颗粒 - 机械敏感性离子通道磁控跨膜钙信号传导和膜兴奋调节体系, 研究跨膜钙信号传导和细胞膜的兴奋性, 并最终实现它们的远程控制本研究基于磁场和超声产生的机械力, 并辅助以超声微泡磁纳米颗粒以及机械敏感通道, 探求一种实现细胞远程控制的新型解决方案材料与方法材料 [0] 可水溶性的 MNP 依照文献所报道的方法制备使用的主要原料为 : 氯化铁 (FeCl 3 ), 柠檬酸三钠 (Na 3 Cit), 乙二醇, 乙酸钠 (NaAc), 乙醇, 氨水 (25%), 十六烷基三甲基溴化铵 (CTAB), 丙酮, 草酸, 氢氧化钠 (NaOH),N- 羟基丁二酰亚胺 (NHS), 碳化二亚胺主要试剂 :DMEM 和 PBS(life technologies) PS (GIBCO) 胎牛血清 (wisent inc) Fura 2AM 钙染料 (Invitrogen),SonoVue 微泡超声造影剂 (Bracco) 等所有试剂都是直接使用购买产品, 没有进一步纯化主要仪器 :IX7 荧光显微镜 (OLYMPUS 公司 ) 低温高速离心机 (Thermo) CO 2 培养箱 (Thermo) 安全柜 (Airstream) 磁场系统 ( 自主设计 ),SUT L 型超声扫描仪 ( 北京天行健医疗科技有限公司 ) 等

228 北京生物医学工程第 35 卷 2 2 方法超声介导基因跨膜运送细胞样品 ( HEK 293T 细胞 ) 与黄色荧光蛋白 (YFP)DNA 共培养, 实验组用超声辐照, 有效声强设定在 0 6 W / cm 2, 辐照时间为 60 s 48 h 以后在荧光显微镜下统计视场中 YFP 基因成功进入细胞并表达的细胞数目 2 2 MNP 的合成与性质测试用化学方法合成磁纳米颗粒 (

340 / 380 荧光比值上升 (Fura 2AM 可以和钙离子结合, 结合钙离子后在 340 nm 激发光下荧光随着钙离子浓度升高而升高 ; 而在 380 nm 激发光下荧光则随着钙离子浓度升高减弱这样就可以使用 340 nm 和 380 nm 这两个激发光下的荧光比值来检测细胞内的钙离子浓度 ) 实验步骤 : 把磁纳米颗粒 (MNP) 均匀加入生长状况良好的 N2A 细胞培养液中,

3 228 北京生物医学工程第 35 卷 2 2 方法超声介导基因跨膜运送细胞样品 ( HEK 293T 细胞 ) 与黄色荧光蛋白 (YFP)DNA 共培养, 实验组用超声辐照, 有效声强设定在 0 6 W / cm 2, 辐照时间为 60 s 48 h 以后在荧光显微镜下统计视场中 YFP 基因成功进入细胞并表达的细胞数目 2 2 MNP 的合成与性质测试用化学方法合成磁纳米颗粒 ( MNP) 主要原理是在乙二醇环境下, 用柠檬酸钠 ( Na 3 Cit) 还原 FeCl [0] 3 为了探求合成的磁纳米颗粒的磁学性质, 进行 MNP 的磁滞回曲线和矫顽力的分析 2 3 钙成像实验使用钙成像方法作为检测钙离子跨膜运输的方法, 其基本原理是 : 细胞膜兴奋, 导通钙离子的离子通道开放, 钙离子进入细胞, 胞内钙离子浓度升高, 钙离子染料 ( Fura 2AM) 的 340 / 380 荧光比值上升 (Fura 2AM 可以和钙离子结合, 结合钙离子后在 340 nm 激发光下荧光随着钙离子浓度升高而升高 ; 而在 380 nm 激发光下荧光则随着钙离子浓度升高减弱这样就可以使用 340 nm 和 380 nm 这两个激发光下的荧光比值来检测细胞内的钙离子浓度 ) 实验步骤 : 把磁纳米颗粒 (MNP) 均匀加入生长状况良好的 N2A 细胞培养液中, 使其与细胞共培养 6 ~ 0 h 之后分别向共培养了 MNP 和正常的 N2A 细胞的培养液中加入 Fura 2AM 工作液, 然后换正常胞外液孵育 30 min 在视野内选取足够数量的比较清晰的细胞, 开始钙成像的记录待荧光比值稳定后, 施加磁场 ( 磁场强度 30 ~ 40 mt, 电压 8 V), 观察并记录荧光比值变化图超声致孔实验装置 Figure Experimental system of sonoporation 过超声辐照的细胞却没有荧光这说明在超声的作用下,DNA 成功地实现了跨膜运输并进入了细胞内表达 ( 图 2), 证明一定强度的超声波能够造成细胞膜发生机械振动, 对细胞膜周围微泡施以机械刺激, 进而引起其爆破造成细胞膜穿孔, 成功地把细胞附近的 DNA 导入细胞, 然后表达 2 结果 2 超声细胞膜致孔系统的设计实验装置如图所示, 主要由超声输出设备超声换能器培养皿和水槽组成超声换能器产生的超声波通过水槽中的液体和培养皿中的细胞培养液作用于细胞膜周围的微泡, 促使其爆破引起细胞膜穿孔, 最终导致细胞周围的 DNA 进入细胞 2 2 基因跨膜运送的远程控制共培养了黄色荧光蛋白 DNA 和造影剂的 HEK 细胞被超声波辐照 60 s(0 6 W / cm 2 ),48 h 以后在荧光显微镜下可以看见有的细胞发荧光 ; 而没有经图 2 基因跨膜运送的远程控制 Figure 2 Remote control of transmembrane delivery of DNA 2 3 磁控系统的设计与磁纳米颗粒的特性电磁场系统由 3 部分组成 ( 图 3A) 把函数发生器连接到一个电流源放大电路中, 作为其电压输入信号这两部分共同构成了电磁铁的驱动电路需要特别指出的是, 电流源功效放大电路的设计如

第 3 期胡明峰, 等 : 基于遥控机械力的重要生物分子的跨细胞膜导入 229 图 3 所示, 它的最大功率是 2 W, 这足以满足电磁铁对功率的要求为了更好地选择所需要的电磁铁, 进行了很多不同磁铁的模拟, 结合模拟验证 ( 图 3B) 与实际测量, 确认一种型号为 P65 的电磁铁满足实验需要这种电磁铁在工作区域 ( 距工作面 0 ~ 3 cm) 的磁场强度较为稳定, 并且强度可以达到

MNP 在磁场作用下的运动情况, 并用相机记录 ( 图 3F) 下来结果表明在周期性脉冲磁场刺激下,MNP 会发生与其一致的周期性运动械力刺激, 改变细胞膜表面张力, 从而激活 N2A 细胞膜表面的机械敏感性离子通道 Piezo 通道 ( 图 4B), 这些通道可以导通钙离子进入细胞, 进而会引起胞内钙离子浓度的升高钙染料荧光 (Fura 2AM) 的 340 / 380 比值上升 ( 图

4 第 3 期胡明峰, 等 : 基于遥控机械力的重要生物分子的跨细胞膜导入 229 图 3 所示, 它的最大功率是 2 W, 这足以满足电磁铁对功率的要求为了更好地选择所需要的电磁铁, 进行了很多不同磁铁的模拟, 结合模拟验证 ( 图 3B) 与实际测量, 确认一种型号为 P65 的电磁铁满足实验需要这种电磁铁在工作区域 ( 距工作面 0 ~ 3 cm) 的磁场强度较为稳定, 并且强度可以达到 30 mt, 这足以使 MNP 发生运动磁纳米颗粒的磁滞回曲线 ( 图 3C) 表明这些颗粒没有磁滞现象, 这有利于提高实验的时效性而由矫顽力图谱 ( 图 3D) 的纵轴分布可以判断出 MNP 之间的相互作用非常弱此外, 从矫顽力图谱的大开口特性, 可以定性地判断 MNP 是一种多磁畴结构颗粒, 从而估算出它们的尺寸在 200 ~ 500 nm 之间然后, 用一个周期脉冲磁场测试 MNP 在磁场作用下的运动情况, 并用相机记录 ( 图 3F) 下来结果表明在周期性脉冲磁场刺激下,MNP 会发生与其一致的周期性运动械力刺激, 改变细胞膜表面张力, 从而激活 N2A 细胞膜表面的机械敏感性离子通道 Piezo 通道 ( 图 4B), 这些通道可以导通钙离子进入细胞, 进而会引起胞内钙离子浓度的升高钙染料荧光 (Fura 2AM) 的 340 / 380 比值上升 ( 图 4) 图 4 跨膜 Ca 2+ 信号的远程控制 Figure 4 Remote control of transmembrane Ca 2+ signals 3 讨论与结论图 3 磁控系统和磁纳米颗粒的性质 Figure 3 General scheme of the magnetron system and characterizations of MNP 2 4 跨膜钙信号的远程控制 MNP 与细胞共培养一段时间后, 会进入细胞内, 在电磁场的刺激下会发生运动, 对细胞膜产生机目前使药物或基因入胞的手段主要有生物法化学法和物理法诸多方法都有各自的优缺点 : 生物法是利用病毒介导即通过病毒转染的方式注入基因实现转染病毒介导的基因转染效率较高, 但其缺点就是安全性难以保障, 并且容易受到机体免疫系统的影响化学法中常用的是脂质体介导法脂质体介导转染存在的问题是靶向性差药物泄漏和不稳定等问题物理法常见的有显微镜注射法电导穿孔法和声致穿孔介导法本研究所采用的方法属于声致穿孔介导法, 与传统方法相比, 本方法有着成本低操作简便和无创等诸多优点, 具有很好的应用前景 [] 至于将该技术进一步应用于活体及医疗领域, 还须在如何降低超声输出强度提高致孔靶向性两方面做进一步的努力磁性纳米材料因其极小的尺寸特殊的磁学性能, 在诸多领域具有广阔的应用前景, 尤其在纳米生物医学材料领域, 如 MRI 靶向药物控制释放 DNA 细胞分离技术甚至癌症治疗等方面 [2-6] 近年来关于磁纳米颗粒用于跨膜钙信号传导和膜兴奋性的研究很多 [7-9], 其中在 Nature 和 Science 上发表了两篇关于磁纳米颗粒 - 温度敏感离子通道相关的跨膜钙信号传导和膜兴奋性研究的文章, 其主要方法是通过射频磁场遥控局部加热 MNP 及其附近细胞膜

5 230 北京生物医学工程第 35 卷上的温度敏感离子通道, 使温度敏感离子通道打开引起细胞膜兴奋和钙离子流入 [7] 利用此种技术已经实现了 : 对线虫行为的膜兴奋性调控和小鼠中血糖 / 胰岛素的摄入量调控 ( 所使用的温度敏感离子通道都是 TPRV) [7] 但是该方法的主要缺陷在于动物体内含有的温度敏感离子通道数量非常有限, 即使可以实现膜兴奋性调控, 对于内源性的离子通道作用依然很小所以如果要实现内源离子通道所产生的膜兴奋性和跨膜钙信号传导调控还需要进行更多的相关研究而相比之下, 机械敏感通道在生物体中分布更为广泛, 如果可以通过磁控的方式来实现钙离子跨膜运输和膜兴奋性, 将克服温度敏感离子通道在生物体内表达不足的缺陷本研究从 MNP 磁控模块系统和细胞的机械敏感通道 3 个方面实现了跨膜钙信号传导和膜兴奋性的远程控制, 将为很多疾病的分子机制研究提供有利的研究工具, 为相关疾病的研究提供一个简单易操作的平台至于该系统是否可以更普遍地远程控制其他机械敏感性通道 ( 比如 PKD 通道复合体 ) 或机械感知细胞 ( 如毛细胞 ) 还有待于进一步研究和验证基于超声及磁场的遥控机械力系统, 能够实现 DNA 及钙离子的跨膜导入, 为相关研究提供了新的工具, 也为进一步实现活体水平上对分子和细胞活动进行遥控, 从而实现病生理的无创干预这一目标提供了新的思路致谢感谢中国科学院地质与地球物理研究所潘永信研究员在磁纳米特性测定方面给予的协助参考文献 [ ] Persons DA. Gene therapy: Targeting beta thalassaemia [ J ]. Nature,200,467(733): [ 2 ] Lauritzen M, Mathiesen C, Schaefer K, et al. Neuronal inhibition and excitation, and the dichotomic control of brain hemodynamic and oxygen responses[j]. Neuro Image, 202, 62(2): [ 3 ] Economo MN, White JA. Membrane properties and the balance between excitation and inhibition control gamma frequency oscillations arising from feedback inhibition [ J ]. PLoS Computational Biology, 202, 8(): e [ 4 ] Wu HD, Xu M, Li RC, et al. Ultrastructural remodelling of Ca ( 2 + ) signalling apparatus in failing heart cells [ J ]. Cardiovascular Research, 202, 95(4): [ 5 ] Hansel D. The Role of Intrinsic Cell Properties in Synchrony of Neurons Interacting via Electrical Synapses Phase Response Curves in Neuroscience[ M]. New York: Springer, 202. [ 6 ] Lundbæk JA. Regulation of Protein Function by Membrane Elastic Properties Biomimetic Membranes for Sensor and Separation Applications[ M]. Netherlands: Springer, 202. [ 7 ] 张灵敏, 蔡继业. 磁性氧化铁纳米药物载体的研究进展 [ J]. 现代生物医学进展,20,(7): Zhang Lingmin, Cai Jiye. The progress in the research of magnetic iron oxide drug nano carrier [ J]. Progress in Modern Biomedicine, 20,(7): [ 8 ] Hara M, Tabata K, Suzuki T, et al. Calcium influx through a possible coupling of cation channels impacts skeletal muscle satellite cell activation in response to mechanical stretch [ J]. American Journal of Physiology Cell Physiology, 202, 302 (2): C [ 9 ] Schmidt D, del Marmol J, MacKinnon R. Mechanistic basis for low threshold mechanosensitivity in voltage dependent K + channels[ J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 202, 09(26): [0] Liu J, Sun Z, Deng Y, et al. Highly water dispersible biocompatible magnetite particles with low cytotoxicity stabilized by citrate groups[ J]. Angewandte Chemie International Edition, 2009, 48(32): [] Qiu Y, Zhang C, Tu J, Zhang D. Microbubble induced sonoporation involved in ultrasound mediated DNA transfection in vitro at low acoustic pressures[j]. Biomech, 202, 45(8): [2] Singh A, Sahoo SK. Magnetic nanoparticles: a novel platform for cancer theranostics[ J]. Drug Discovery Today, 204, 9( 4): [3] Banerjee R, Katsenovich Y, Lagos L, et al. Nanomedicine. Magnetic Nanoparticles and their Biomedical Applications [ J]. Current Medicinal Chemistry, 200, 7(27): [4] Thanh NTK. Magnetic Nanoparticles: From Fabrication to Clinical Applications[ M]. Florida : CRC PressINC, 202. [5] Tran N, Webster TJ. Magnetic nanoparticles: biomedical applications and challenges[ J]. Journal of Materials Chemistry, 200, 20(40): [6] 陈月, 陈宝安. 磁性氧化铁纳米颗粒在肿瘤靶向治疗中的应用及进展 [J]. 癌症, 200, 29(): [7] Stanley SA, Gagner JE, Damanpour S, et al. Radio wave heating of iron oxide nanoparticles can regulate plasma glucose in Mice [ J]. Science, 202, 336(608): [8] Jia Z, Ling J, Gu JG. Temperature dependence of rapidly adapting mechanically activated currents in rat dorsal root ganglion neurons [J]. Neuroscience Letters, 202, 522(2): [9] Sniadecki NJ. Minireview: a tiny touch: activation of cell signaling pathways with magnetic nanoparticles [ J ]. Endocrinology 200, 5(2): ( 收稿, 修回 )

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<30302DB7E2C3E6CDC6BDE9A3A D32A3A92E4D4449> 绎阴元元 510515 Caco-2 Caco-2 P