核仁素在糖尿病性心肌病中的表达孙丽, 等 1057 Western blot showed the protein levels of myocardial nucleolin in the model group were obviously higher than those in the co

Size: px

Start display at page:

Download "核仁素在糖尿病性心肌病中的表达孙丽, 等 1057 Western blot showed the protein levels of myocardial nucleolin in the model group were obviously higher than those in the co"

牙棍项
5 years ago
Views:

1056 中南大学学报 ( 医学版 ) J Cent South Univ (Med Sci) 2014, 39(10) http://www.csumed.org DOI:10.11817/j.issn.1672-7347.2014.10.012 www.csumed.org/xbwk/fileup/pdf/2014101056.

1 1056 中南大学学报 ( 医学版 ) J Cent South Univ (Med Sci) 2014, 39(10) DOI: /j.issn 核仁素在糖尿病性心肌病中的表达孙丽 1, 贺欣 1, 王娟 2, 蒋碧梅 1, 童中艺 1, 刘艳娟 1, 李媛彬 1 1, 肖献忠 ( 中南大学 1. 基础医学院病理生理学系, 长沙 ;2. 湘雅医院感染科, 长沙 ) [ 摘要 ] 目的 : 探讨核仁素在糖尿病性心肌病中的表达情况方法 : 实验分为对照组和 II 型糖尿病性心肌病模型组 ( 模型组 ); 模型组采用高脂高糖饲料持续喂养 ( 第 5,6 周于小鼠腹腔注射 60 mg/kg 链脲佐菌素 ) 构建, 第 8 周末测定小鼠血糖, 第 20 周末测定两组小鼠空腹血糖值并计算心脏质量与体质量的比值, 观察心肌形态学病理改变, 采用免疫组织化学法和 Western 印迹检测心肌核仁素的表达水平结果 : 糖尿病模型组小鼠较对照组空腹血糖值明显升高 (P<0.05); 模型组小鼠心肌细胞肥大排列紊乱, 出现断裂及溶解 ; 免疫组织化学染色及 Western 印迹显示模型组小鼠心肌核仁素蛋白水平较对照组明显升高 (P<0.05) 结论: 核仁素可能在糖尿病性心肌病的发生和发展中起着一定的作用 [ 关键词 ] II 型糖尿病 ; 心肌病 ; 核仁素 ; 表达 Nucleolus expression in diabetic cardiomyopathy SUN Li 1, HE Xin 1, WANG Juan 2, JIANG Bimei 1, TONG Zhongyi 1, LIU Yanjuan 1, LI Yuanbin 1, XIAO Xianzhong 1 (1. Department of Pathophysiology, School of Basic Medical Science, Central South University, Changsha ; 2. Department of Infectious Disease, Xiangya Hospital, Central South University, Changsha , China) ABSTRACT Objective: To investigate the nucleolus expression in the diabetic cardiomyopathy. Methods: The rats were divided into a control group and a type II diabetic cardiomyopathy group (model group). In the model group, rats were fed with high-fat and high-sugar food (rats were intravenously injected with 60 mg/kg chain urea with cephalosporins in the 5th and 6th weeks in mice). The level of blood glucose was determined at the end of 8th week and the level of fasting blood glucose was examined at the end of 20th week. The ratio of the heart mass and body mass was calculated, and the pathological changes in myocardial morphology were observed. The immunohistochemical method and Western blot were used to detect the expression level of myocardial nucleolin. Results: The level of fasting blood glucose was significantly increased in the diabetic model group than that in the control group (P<0.05). Rats in the model group were found hypertrophic cardic cells, with fracture, dissolusion, and disordered arrangement. Immunohistochemical staining and 收稿日期 (Date of reception): 作者简介 (Biography): 孙丽, 硕士, 主要从事心血管生理方面的研究通信作者 (Corresponding author): 蒋碧梅, jiangbimei@163.com 基金项目 (Foundation item): 国家自然科学基金 ( ); 教育部新世纪优秀人才计划 (NECT ) 及教育部博士后基金 ( ) This work was supported by the National Natural Science Foundation of China ( ), Program for New Century Excellent Talents in University of Ministry of Education of China (NECT ), and China Postdoctoral Science Foundation ( ).

2 核仁素在糖尿病性心肌病中的表达孙丽, 等 1057 Western blot showed the protein levels of myocardial nucleolin in the model group were obviously higher than those in the control group (P<0.05). Conclusion: Nucleolin may play a role in the pathogenesis and development of the diabetic cardiomyopathy. KEY WORDS Type II diabetes; cardiomyopathy; nucleolin; expression 糖尿病性心肌病是糖尿病患者在无明显高血压冠状动脉及瓣膜病变先天性心脏病等情况下, 出现心力衰竭和心律失常等症状的特异性心肌疾病 [1] [2] 这一概念由 Hamby 等学者在 1974 年首次提出, 而其发病率又以 II 型糖尿病居多 [3] 在过去的十年中, 研究者对糖尿病性心肌病的发病机制做了深入的研究 [4], 发现病变的糖尿病心肌通常在外部激活的各种转录因子作用下, 逐渐发生心肌重塑和心肌结构上的改变 [5], 并最终导致收缩功能障碍和心力衰竭 [6-7] 预防或逆转心肌重塑, 明显可以改善糖尿病性心肌病甚至是 II 型糖尿病患者的预后, 也因此成为了心血管领域甚至糖尿病代谢领域的热点核仁素 (C23) 是细胞核中含量最丰富的非核糖体蛋白之一 [8], 其穿梭于细胞核细胞浆和细胞膜中, 参与细胞的增殖分化凋亡, 核仁发生和核糖体装配等, 并对 DNA 和 RNA 的代谢发挥着多方面的调节作用 [9-13] 然而, 核仁素在糖尿病性心肌病中是否发挥重要作用, 目前仍不清楚本研究在该实验室前期研究中所构建的 II 型糖尿病性心肌病模型上, 进一步探讨核仁素蛋白在小鼠 II 型糖尿病性心肌病模型中的表达情况, 为进一步研究核仁素在心肌肥厚发生发展中的作用提供理论依据 1 材料与方法 1.1 动物和材料所用实验动物 C57BL/6 小鼠 (22 g, 雌雄各半,40 只 ) 购自南京大学模式动物研究中心 ; 血糖仪及试纸购自瑞士 Roche 公司 ; 兔抗核仁素单克隆抗体购自美国 Sigma 公司 ;BCA 蛋白定量试剂盒购自北京鼎国昌盛生物技术有限公司 ; 辣根过氧化物酶标记的羊抗兔 IgG,DAB 显色试剂盒购自武汉博士德生物技术公司 ;RIPA 蛋白裂解液 ( 强 ) 购自碧云天试剂公司, 苏木精伊红纯羊血清等由中南大学湘雅三医院形态学中心实验室提供 1.2 方法构建 II 型糖尿病性心肌病模型按随机数字表法将小鼠随机分为对照组和模型组, 每组 20 只模型组给予高脂高糖饲料 (20% 葡萄糖 10% 猪油 2.5% 胆固醇和 67.5% 常规饲料 ) 喂养 20 周, 第 5,6 周分别于小鼠腹腔注射链脲佐菌素处理 1 次, 剂量为 60 mg/kg; 对照组给予普通饲料喂养加腹腔注射同等剂量柠檬酸缓冲液处理, 小鼠在整个实验过程中自由饮食和饮水血糖值测定实验第 8 周末用血糖试纸检测各组小鼠血糖值 1 次并将模型组血糖值 7.0 mmol/l 的小鼠剔除, 对照组血糖值 7.1 mmol/l 的小鼠剔除心脏组织 HE 染色及免疫组织化学染色实验第 20 周末, 取两组小鼠 6 只, 心脏组织经 4% 多聚甲醛固定, 以常规石蜡包埋切片, 常规 HE 染色选取常规石蜡包埋切片, 脱蜡后抗原修复,3%H 2 O 2 室温封闭 1 h, 用一抗 ( 封闭液与 PBS 1:1 混匀, 核仁素浓度为 1:200) 孵育于 4 过夜, 用二抗 ( 封闭液 +PBS 1:1, 二抗兔浓度为 1:400) 于室温孵育 1~2 h,abc 试剂孵育 (A 与 B 二者摇匀混合,A 溶液以 1:200 稀释摇匀 ;B 溶液以 1:200 稀释摇匀 )1~2 h,dab 显色 1~2 min 后置显微镜下观察结果 Western 印迹分析实验第 20 周末取两组小鼠心脏组织, 按每 100 μg 组织加入 990 μl 放射免疫沉淀法 (radio-immunoprecipitation assay, RIPA) 蛋白裂解液及 10 μl100 mmol/l 苯甲基磺酰氟 (phenylmethanesulfonyl fluoride,pmsf) 蛋白酶抑制剂, 在冰上充分研磨后转移至 EP 管中 ; 于 4 和 r/min 离心 15 min, 收集上清, 采用 BCA 试剂盒将蛋白进行定量 ; 取 30 µg 蛋白裂解液, 加入等体积 2 SDS 电泳加样缓冲液混合,100 煮沸 10 min 样品经 12%SDS-PAGE 分离, 用电转移法将胶上蛋白质转至醋酸纤维膜上用封闭缓冲液 (2%BSA,50 mmol/l Tris-HCl,0.15 mol/l NaCl, ph7.5) 在室温下封闭 4 h 然后加入兔抗核仁素单克隆抗体 (1:1 000 稀释 ) 于摇床上, 置室温下孵育 2 h 用洗膜液洗去一抗后, 加入辣根过氧化物酶偶联的抗兔 IgG 二抗 (1:1 000 稀释 ) 于摇床上, 孵育 1 h, 洗

1058 中南大学学报 ( 医学版 ), 2014, 39(10) http://www.csumed.org 膜液洗去二抗用 DAB 显色, 进行灰度扫描及定量分析以 GAPDH 抗体作为内对照 1.3 统计学处理采用 Image-Pro Plus 6.0 软件分别分析 Western 印迹核仁素蛋白灰度值和免疫组织化学核仁素蛋白积分吸光度值 ; 采用 SPSS 17.

12%(P<0.05, 图 1) 心脏质量与体质量比值 (HW/TW) 变化情况见图 2, 与对照组相比, 糖尿病性心肌病模型组 HW/ TW 明显增加, 增加水平达 135%(P<0.05) 2.

3 1058 中南大学学报 ( 医学版 ), 2014, 39(10) 膜液洗去二抗用 DAB 显色, 进行灰度扫描及定量分析以 GAPDH 抗体作为内对照 1.3 统计学处理采用 Image-Pro Plus 6.0 软件分别分析 Western 印迹核仁素蛋白灰度值和免疫组织化学核仁素蛋白积分吸光度值 ; 采用 SPSS 17.0 统计软件进行数据分析, 计量资料用均数 ± 标准差 ( x± s) 表示, 两组比较采用 t 检验, 多组间比较采用单因素方差分析,P<0.05 认为差异有统计学意义 2 结果 2.1 两组小鼠的血糖和心脏质量与体质量的比值变化实验第 8 周末符合要求的小鼠对照组 18 只, 糖尿病性心肌病模型组 15 只与对照组相比, 糖尿病性心肌病模型组空腹血糖值明显增加, 增加水平达 %(P<0.05, 图 1) 心脏质量与体质量比值 (HW/TW) 变化情况见图 2, 与对照组相比, 糖尿病性心肌病模型组 HW/ TW 明显增加, 增加水平达 135%(P<0.05) 2.2 HE 染色观察两组小鼠心肌形态学变化心脏组织 HE 染色结果如图 3 显示 : 对照组心肌细胞排列整齐, 胞浆染色均匀, 胞核大小匀一 ; 与之比较的模型组心肌细胞明显增大排列紊乱, 胞核大小不规则, 心肌细胞肥大, 部分肌原纤维断裂溶解, 间质可见大量胶原累积 Blood glucose/(mmol/l) HW/TW 图 1 第 8 周末检测两组小鼠空腹血糖值 Figure 1 Level of fasting blood glucose in 2 groups of mice at the end of the 8th week P<0.05 vs the control group 图 2 第 8 周末各组小鼠 HW/TW 变化情况 Figure 2 HW/TW changes in 2 groups of mice at the end of the 8th week P<0.05 vs the control group 图 3 HE 染色观察两组小鼠心肌形态学变化 ( 200) Figure 3 Myocardial morphology in 2 groups of mice by HE dye ( 200)

of mice ( 200) 4 C23 C23/GAPDH 3 2 GAPDH 1 A 0 B 图 5 Western 印迹检测小鼠心肌核仁素蛋白水平 Figure 5 Western blot showing the level of nucleolin protein in myocardiacytes of mice A:

4 核仁素在糖尿病性心肌病中的表达孙丽, 等糖尿病性心肌病中核仁素蛋白表达情况采用免疫组织化学方法检测对照组及模型组心肌组织中核仁素的表达情况, 结果显示 : 与对照组比较, 模型组心肌组织中核仁素蛋白水平明显升高 ( 图 4) 进一步采用 Western 印迹检测对照组和模型组心肌组织中核仁素的表达情况, 结果显示 : 模型组中心肌核仁素蛋白水平较对照组小鼠显著升高, 是其 2.47 倍 (P<0.05, 图 5) 图 4 免疫组织化学方法检测两组小鼠心肌组织核仁素蛋白的表达水平 ( 200) Figure 4 Immunohistochemical method showing the expression level of nucleolin protein in the myocardial tissues of 2 groups of mice ( 200) 4 C23 C23/GAPDH 3 2 GAPDH 1 A 0 B 图 5 Western 印迹检测小鼠心肌核仁素蛋白水平 Figure 5 Western blot showing the level of nucleolin protein in myocardiacytes of mice A: Representative Western blot; B: Quantification of band intensity; P<0.05 vs the control group, n=4 3 讨论 II 型糖尿病患者在临床成人糖尿病中所占比例达 90% 以上 [3], 由于 II 型糖尿病的发病率较 I 型糖尿病高且发病机制不同, 故本实验采用高脂高糖饲料喂养小鼠 20 周, 第 5 周腹腔注射链脲佐菌素 (60 mg/kg) 构建 II 型糖尿病性心肌病模型第 8 周末各项实验指标的检测结果说明此时小鼠发生糖尿病继续喂养 12 周, 检测 HW/TW 的变化, 用 HE 染色检测糖尿病小鼠心肌细胞结构改变情况根据两组血糖值心脏 HW/TW 的变化以及 HE 染色显示有心肌肥大等结果, 提示本实验成功构建了糖尿病心肌病模型心血管并发症是导致糖尿病患者死亡的主要 [14-16] 原因大量的临床和实验证实了糖尿病性心肌病是一种独立于大血管并发症的特异性心肌病, 以心肌细胞肥大早期舒张功能不全和晚期收缩功能障碍为主要特征糖尿病性心肌病的发病机

5 1060 中南大学学报 ( 医学版 ), 2014, 39(10) 制复杂, 目前尚未完全清楚近年来, 国内外研 [17-19] 究者对糖尿病性心肌病的发病机制做了大量的研究, 且取得了一定进展, 包括可能通过肾素血管紧张素醛固酮系统的激活糖毒性和钙离子交换障碍等因素, 导致心肌炎症细胞浸润心肌细胞肥大心肌细胞凋亡和氧化损伤等一系列改变核仁素是一种凋亡相关蛋白 [17-18], 在心肌内源性保护中发挥重要的作用 [19] 核仁素是否在糖尿病性心肌病发生发展中发挥作用目前尚不清楚本实验首次探讨了核仁素在糖尿病性心肌病中的表达情况成功构建糖尿病心肌病模型后, 笔者分别采用免疫组织化学及 Western 印迹两种经典方法检测了两组小鼠心肌核仁素蛋白水平, 结果发现模型组小鼠较对照组小鼠心肌中核仁素表达水平明显升高, 差异具有统计学意义, 提示糖尿病性心肌病的发生发展可能与核仁素的表达有关, 但核仁素是否在糖尿病性心肌病中发挥作用以及发挥何种作用, 有待进一步深入研究总之, 本实验发现了核仁素与糖尿病性心肌病的发生和发展存在一定关系, 这将对今后核仁素在糖尿病性心肌病中的功能研究提供有用的信息参考文献 1. Rubler S, Dlugash J, Yuceoglu YZ, et al. New type of cardiomyopathy associated with diabetic glomerulosclerosis[ J]. Am J Cardiol, 1972, 30(6): Hamby RI, Zoneraich S, Sherman L. Diabetic cardiomyopathy[ J]. JAMA, 1974, 229(13): Roger VL, Go AS, Lloyd-Jones DM, et al. Heart disease and stroke statistics 2012 update: a report from the American Heart Association[ J]. Circulation, 2012, 125(1): e2-e Mudd JO, Kass DA. Tackling heart failure in the twenty-first century[ J]. Nature, 2008, 451(7181): Lee Y, Kim M, Han J, et al. MicroRNA genes are transcribed by RNA polymerase II[ J]. EMBO J, 2004, 23(20): Mandavia CH, Pulakat L, DeMarco V, et al. Over-nutrition and metabolic cardiomyopathy[ J]. Metabolism, 2012, 61(9): Zhang X, Chen C. A new insight of mechanisms, diagnosis and treatment of diabetic cardiomyopathy[ J]. Endocrine, 2012, 41(3): Bugler B, Caizergues-Ferrer M, Bouche G, et al. Detection and localization of a class of proteins immunologically related to a 100-kDa nucleolar protein[ J]. Eur J Biochem, 1982, 128(2/3): Christian S, Pilch J, Akerman ME, et al. Nucleolin expressed at the cell surface is a marker of endothelial cells in angiogenic blood vessels[ J]. J Cell Biol, 2003, 163(4): Joo EJ, ten Dam GB, van Kuppevelt TH, et al. Nucleolin: acharan sulfate-binding protein on the surface of cancer cells[ J]. Glycobiology, 2005, 15(1): Legrand D, Vigié K, Said EA, et al. Surface nucleolin participates in both the binding and endocytosis of lactoferrin in target cells[ J]. Eur J Biochem, 2004, 271(2): Shi H, Huang Y, Zhou H, et al. Nucleolin is a receptor that mediates antiangiogenic and antitumor activity of endostatin[ J]. Blood, 2007, 110(8): Porkka K, Laakkonen P, Hoffman JA, et al. A fragment of the HMGN2 protein homes to the nuclei of tumor cells and tumor endothelial cells in vivo[ J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2002, 99(11): Galderisi M, Anderson KM, Wilson PW, et al. Echocardiographic evidence for the existence of a distinct diabetic cardiomyopathy (the Framingham Heart Study)[ J]. Am J Cardiol, 1991, 68(1): Hayat SA, Patel B, Khattar RS, et al. Diabetic cardiomyopathy: mechanisms, diagnosis and treatment[ J]. Clin Sci (Lond), 2004, 107(6): Galderisi M. Diastolic dysfunction and diabetic cardiomyopathy: evaluation by Doppler echocardiography[ J]. J Am Coll Cardiol, 2006, 48(8): Wu CD, Chou HW, Kuo YS, et al. Nucleolin antisense oligodeoxynucleotides induce apoptosis and may be used as a potential drug for nasopharyngeal carcinoma therapy[ J]. Oncol Rep, 2012, 27(1): Wise JF, Berkova Z, Mathur R, et al. Nucleolin inhibits Fas ligand binding and suppresses Fas-mediated apoptosis in vivo via a surface nucleolin-fas complex[ J]. Blood, 2013, 121(23): Jiang B, Zhang B, Liang P, et al. Nucleolin protects the heart from ischaemia-reperfusion injury by up-regulating heat shock protein 32[ J]. Cardiovasc Res, 2013, 99(1): ( 本文编辑陈丽文 ) 本文引用 : 孙丽, 贺欣, 王娟, 蒋碧梅, 童中艺, 刘艳娟, 李媛彬, 肖献忠. 核仁素在糖尿病性心肌病中的表达 [ J]. 中南大学学报 : 医学版, 2014, 39(10): DOI: /j.issn Cite this article as: SUN Li, HE Xin, WANG Juan, JIANG Bimei, TONG Zhongyi, LIU Yanjuan, LI Yuanbin, XIAO Xianzhong. Nucleolus expression in diabetic cardiomyopathy[ J]. Journal of Central South University. Medical Science, 2014, 39(10): DOI: / j.issn

标题

环球中医药 2016 年 5 月第 9 卷第 5 期摇 Global Traditional Chinese Medicine, May 2016,Vol 郾 9, No 郾 5 摇 557 两种电针对脊髓损伤 14 天后大鼠运动功能神经元及 MEK2 p 鄄 ERK1 表达的影响论著宋良玉摇吕威摇景泉凯摇莫雨