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霓眺於
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1 第 39 卷第 4 期 2018 年 8 月同济大学学报 ( 医学版 ) JOURNAL OF TONGJI UNIVERSITY(MEDICAL SCIENCE) Vol 39 No 4 Aug doi: / j 基础研究上海地区汉族健康成年人唾液微生物菌群结构分析史聪 1,2, 蔡丽婷 3, 邵方洋 1,2, 郑赛巍 1,2, 汪丙杰 1,2 1,2, 何园 (1. 同济大学口腔医学院, 上海 ; 2. 同济大学附属口腔医院黏膜病学教研室上海牙修复与再生工程实验中心, 上海 ; 3. 同济大学生命科学与技术学院生物信息学科, 上海 ) 摘要目的研究健康成年人唾液微生物群落结构方法采集 37 名健康的上海地区常驻汉族居民的非刺激唾液, 利用 Illumina Hisep 测序平台对微生物 16 S rdna 的 V3~ V4 高度可变区扩增产物进行测序, 分析唾液微生物的群落结构结果共获得条优质序列, 平均每个样本为 ( ± ) 条, 这些序列可归为 110 个属,12 个门其中有 5 个优势菌门 (97 54%), 以及 12 个核心菌属 (79 71%) 男性与女性两组之间的生物多样性指数及主成分分析等差异均无统计学意义 (P>0 05) 结论对上海地区汉族健康成年人口腔唾液微生物群落结构的分析, 为进一步研究人类口腔唾液微生物群落结构提供了基础资料, 且为口腔疾病的防治及诊断提供了参考关键词唾液 ; 高通量测序 ; 微生物群落结构 ; 宏基因组学中图分类号 R372 文献标志码 A 文章编号 (2018) Analysis of microbial community structure in saliva from healthy Han Chinese living in Shanghai SHI Cong 1,2, CAI Li ting 3, SHAO Fang yang 1,2, ZHENG Sai wei 1,2, WANG Bing jie 1,2, HE Yuan 1,2 (1. School of Stomatology, Tongji University, Shanghai , China; 2. Dept. of Oral Medicine, School and Hospital of Stomatology, Tongji University Shanghai Engineering Research Center of Tooth Restoration and Regeneration, Shanghai , China; 3. Dept. of Bioinformatics, School of Life Sciences and Technology, Tongji University, Shanghai , China) Abstract Objective To analyze salivary microbial community structure in healthy Han adults in Shanghai. Methods In this study, unstimulated saliva samples were collected from 37 orally healthy Han Chinese living in Shanghai. The Illumina Hisep sequencing platform was employed to sequence the 16S rdna V3 V4 hypervariable regions for analysis of salivary bacterial profiles. Results A total of high quality sequences were obtained belonging to 110 genera from 12 bacterial phyla in this study, with an average of ( ± ) for each sample. We found 5 dominant phyla (97 54%),and 12 core genera(79 71%). Besides, there was no difference in the diversity index and PCoA analysis between males and females. Conclusion The microbial community structure in saliva from orally healthy Han Chinese living in Shanghai has been analyzed, which provides certain reference for future study and new ideas for the prevention and diagnosis of oral diseases. Key words saliva; high throughput nucleotide sequencing; microbial community structure; metagenomics 收稿日期 : 基金项目 : 上海市科委医学引导项目 ( ) 作者简介 : 史聪 (1991 ), 女, 硕士研究生.E mail: shicong@ tongji.edu.cn 通信作者 : 何园.E mail: drheyuan@ tongji.edu.cn 29

2 同济大学学报 ( 医学版 ) 第 39 卷口腔疾病的发生发展均与微生物群落结构失调有关深入了解健康状态下的口腔微生物群落特征, 有助于进一步认识疾病状态下的微生物群落特征, 利于疾病的早期诊断及疗效监测口腔内的微生物群落有细菌病毒真菌支原体古细菌和原生生物等 [1], 其中细菌的群落结构非常复杂, 目前检测到的大约有种近年来, 随着高通量测序技术及宏基因组学发展迅速, 使得人们对微生物的认识有了全新的视角本研究拟采用宏基因组学技术, 分析健康人的唾液微生物群落结构, 为口腔疾病的预防及诊治提供参考 1 资料与方法 1 1 一般资料 37 名符合纳入标准的受检者均为上海地区的常住汉族居民, 其中男性 20 名, 女性 17 名, 见表 1 所有受检者均由两名经培训的口腔专业医生依据 1997 年 WHO 口腔健康调查基本方法进行临床检查受检者的纳入标准为 : DFT(decay filled index, DFT) = 0;CPI(community periodontal index, CPI)= 0 排除标准为 : 患有其他口腔疾病 ( 如口腔黏膜病唾液腺疾病等 ); 口腔内有修复体 ; 少于 28 颗牙齿 ; 患有全身系统性疾病及肿瘤 ; 近 1 个月内使用抗生素或抗真菌药物 ; 吸烟 ; 女性处于月经期妊娠期或哺乳期所有受检者均在取样前签署了知情同意书, 并且该研究得到了同济大学医学伦理道德委员会的批准表 1 37 名受检者的样本信息 Tab 1 Characteristics of 37 individuals in this study 组别男性 (n = 20) 女性 (n = 17) P 年龄 / 岁 25 7± ± 序列数 ± ± 样本采集所有受检者均在样本收集前完成必要的口腔检查及样本信息登记表取样前嘱受检者禁食 2 h 受检者清水漱口 1 min, 采集 1 5 ml 非刺激性唾液, 封口后立即置于 -20 冰箱中保存, 并且随后转入 -80 冰箱中长期保存 1 3 唾液样本总 DNA 提取,PCR 扩增及测序口腔唾液总 DNA 采用 QIAamp DNA micro 试 30 剂盒提取 ( 凯杰企业管理有限公司 ), 提取方法参照试剂盒使用说明, 随后用分光光度计检测提取物的质量和浓度随后采用 TRANS 公司的 TransStartFastpfu DNA Polymerase,20 μl 反应体系对 V3 ~ V4 可变区进行 PCR 扩增 ( 北京全式金生物技术有限公司 ), 并且应用 2% 琼脂糖凝胶电泳检测纯化后 PCR 产物 16 S rrna 的 V3 ~ V4 可变区通用引物设计如下上游引物为 5 CCTAYG GGRBGCASCAG 3 ; 下游引物为 5 GGACTACNN GGGTWTCTAAT 3 最后, 由 Illumina HiSeq 2500 测序平台对扩增产物进行测序 ( 上海凌恩生物科技有限公司, 中国 ) 1 4 数据处理采用 Trimmomatic 和 QIIME(version 1 8) 对序列进行处理和分析本研究过滤掉了序列长度小于 200 bp 的序列, 并且采用 USEARCH 方法鉴别并过滤掉嵌合体序列按照 97% 的相似度划分操作分类单元 ( operational taxonomic units, OUTs), 并与 Greengenes 数据库进行比对, 通过 RDP 分类器对 OUT 进行逐级分类运用 QIIME 计算稀释曲线和多样性指数, 并应用 Unweighted UniFrac 方法计算样本差异矩阵距离, 然后进行主成分分析 ( PCoA) 定义一级核心菌属, 标准为 : 在所有样本中均有分布, 且在样本中相对丰度均值 2% 的菌属 [2] 并且应用 itol 对主要菌属 ( 平均相对丰度 >0 1%) 构建唾液菌丛系统发育树 P < 0 05 为差异有统计学意义 2 结果 2 1 样本信息及基因组 DNA 序列分析本研究通过 Illumina HiSeq 测序平台测序共获得条优质序列, 每个样本平均为 ( ± ) 条这些序列可归为 110 个属,12 个门, 90 78% 的序列可以分类到 72 个已知属, 测序质量较高, 可以用于后续数据分析根据 observed_species 数据, 做出每个样本的稀释曲线, 曲线均趋于平坦, 说明本次实验测序深度达到要求, 见图唾液微生物结构健康青年人的口腔唾液菌群科分类到 12 门其中 5 个高丰度菌门 ( 相对丰度 >5%) 占总序列数的 97 54%, 分别为 : 厚壁菌门 (Firmicutes,42 21%) 变

第４期史聪等上海地区汉族健康成年人唾液微生物菌群结构分析形菌门Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ２７７８拟杆菌门ＢａｃｔｅｒＧｅｍｅｌｌａｃｅａｅｇｅｎ韦荣菌属Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ３４１颗梭杆菌门Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉａ５２５除了５个高丰度菌Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ２７４放线菌属Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓｏｉｄｅｔｅｓ１４３４

ＳＲ１健康青年人列中所占比例为９９６９见图２Ｆｉｇ１图１稀释曲线Ｒａｒｅｆａｃｔｉｏｎｃｕｒｖｅｓｏｆｔｈｅｏｒａｌｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ稀释曲线可以反映物种多样性由图可知ｏｂｓｅｒｖｅｄｓｐｅｃｉｅｓ数量随着序列条数增加而增加最后达到平台期说明本研究深度达到要求为了更清楚地表达唾液的微生物群落结构进一步系统发育树见图４图３

多样性指数差异无统计学意义Ｐ００５说明男性与女性之间 α 多样性没有差异见图５Ａ各样本的主成分分析比较集中且男性与女性在各自象限有交叉说明男性与女性之间菌群结构相似见图５Ｂ３图２唾液微生物门在样本中的分布Ｆｉｇ２Ｐｈｙｌｕｍｌｅｖｅｌｒｅｌａｔｉｖｅａｂｕｎｄａｎｃｅ健康组菌群可分类到１２个门９７５４的序列属于５个高丰度菌门

3 第４期史聪等上海地区汉族健康成年人唾液微生物菌群结构分析形菌门Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ２７７８拟杆菌门ＢａｃｔｅｒＧｅｍｅｌｌａｃｅａｅｇｅｎ韦荣菌属Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ３４１颗梭杆菌门Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉａ５２５除了５个高丰度菌Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ２７４放线菌属Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓｏｉｄｅｔｅｓ１４３４放线菌门Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ７９６粒链球菌属Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ３０９梭杆菌属门以外还有３个菌门在所有样本中均有分布分别２５２纤毛菌属Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ２４６见图３口腔微生物分布相对集中以上８个核心菌门在总序对主要菌属平均相对丰度０１构建唾液菌丛为ＴＭ７螺旋体门ＳｐｉｒｏｃｈａｅｔｅｓＳＲ１健康青年人列中所占比例为９９６９见图２Ｆｉｇ１图１稀释曲线Ｒａｒｅｆａｃｔｉｏｎｃｕｒｖｅｓｏｆｔｈｅｏｒａｌｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ稀释曲线可以反映物种多样性由图可知ｏｂｓｅｒｖｅｄｓｐｅｃｉｅｓ数量随着序列条数增加而增加最后达到平台期说明本研究深度达到要求为了更清楚地表达唾液的微生物群落结构进一步系统发育树见图４图３样本中核心微生物ＴｈｅｒｅｌａｔｉｖｅａｂｕｎｄａｎｃｅｏｆｃｏｒｅｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅｉｎｓａｍｐｌｅｓＦｉｇ３在属水平健康人的唾液微生物菌群结构分布也比较集中相对丰度１０的有链球菌属和奈瑟菌属２３唾液微生物多样性分析各样本的序列覆盖度均在９９７以上说明样本的测序量达到要求基本覆盖所有微生物且男性与女性比较中Ｓｈａｎｎｏｎ多样性指数差异无统计学意义Ｐ００５说明男性与女性之间 α 多样性没有差异见图５Ａ各样本的主成分分析比较集中且男性与女性在各自象限有交叉说明男性与女性之间菌群结构相似见图５Ｂ３图２唾液微生物门在样本中的分布Ｆｉｇ２Ｐｈｙｌｕｍｌｅｖｅｌｒｅｌａｔｉｖｅａｂｕｎｄａｎｃｅ健康组菌群可分类到１２个门９７５４的序列属于５个高丰度菌门占序列比例为９９６９的８个核心菌门在所有样本中均有分布说明健康青年人口腔微生物分布相对集中健康青年人的口腔唾液微生物在属水平的分布也相对集中主要微生物相对丰度１０为链球菌属２５９０和奈瑟菌属１３０５根据对核心菌的定义共得到１２个核心菌属占微生物总序列的７９７１分别为链球菌属Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ奈瑟菌属Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ嗜血菌属Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ７６２普氏菌属Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ６５８罗氏菌属Ｒｏｔｈｉａ４５３卟啉单胞菌属Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ４０２讨论唾液菌群是机体内环境的重要组成部分其结构在健康状态下保持相对稳定及与宿主之间的稳态是维持口腔健康必不可少的条件然而当这种平衡被某些原因打破后菌群结构失调将引发疾病的发生目前发现与微生物有关的疾病包括龋病３牙周炎４等还有些口腔微生物甚至影响全身健康如有学者发现链球菌Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ与糖尿病有关５糖尿病严重影响患者的生活质量６只有对健康状态下的口腔唾液菌群菌群结构有明确的认识才能更好的发现疾病状态下微生物菌落结构的改变及这种改变的影响３１

同济大学学报 ( 医学版 ) 第 39 卷 Fig 4 图 4 健康成年口腔唾液菌丛属水平系统发育树 Circular phylogenetic tree of saliva from healthy adults at genus level 选取属水平菌平均相对丰度 >0 1% 者, 共有 47 个属 ; 左侧图例为科水平, 右侧图中内圈不同颜色代表不同的科水平菌,

4 同济大学学报 ( 医学版 ) 第 39 卷 Fig 4 图 4 健康成年口腔唾液菌丛属水平系统发育树 Circular phylogenetic tree of saliva from healthy adults at genus level 选取属水平菌平均相对丰度 >0 1% 者, 共有 47 个属 ; 左侧图例为科水平, 右侧图中内圈不同颜色代表不同的科水平菌, 同一科的属用相同颜色表示, 外带显示相对丰度 Fig 5 图 5 健康人唾液菌群多样性分析 Analysis of the diversity of salivary microbiota in male and female subjects A: 健康的男性与女性唾液样本的 Shannon 多样性指数分析, 可见男性与女性之间菌群多样性无差异 ;B: 健康的男性和女性两组唾液样本的主坐标分析, 可见男性与女性之间菌群结构没有差异正常情况下, 整个口腔, 包括牙齿与黏膜均浸润在唾液中, 可以说唾液构成了口腔的外环境研 [7] 究表明, 唾液微生物组受唾液采集方法储存及 DNA 提取的影响很小因此, 唾液是研究口腔微生 32 物群落的重要生物样本 [8] 近年来, 高通量测序技术以及宏基因组学的发展使得人们对人类微生物组研究领域发生了革命性的进展, 尤其是对肠道微生物的研究 [9] 相对于以往基于细菌培养的方法而言, 高通量测序技术使得许多不能等培养的微生物得以被检测到与人类口腔微生物鉴别芯片 (human oral microbe identification microarray, HOMIM) 相比, 高通量测序技术可以检测到大量的低丰度物种 [10], 如 SR1 Tenericutes spp. 和 Synergistetes spp. 本研究测序的序列覆盖度在 99 7% 以上, 平均每个样本为 ( ± ) 条序列, 并且稀释曲线达到平台期, 比以往的研究更深入地检测了口腔微生物菌群 [11] Segata 等和其他 HMP ( Human Microbiome Project, HMP) 成员在一项由美国国立卫生研究院设立的人类微生物组计划中, 通过对 V1 ~ V3 和 V3 ~ V5 16 S rrna 高变区进行测序, 探索了超过 200 个

5 第 4 期史聪等 : 上海地区汉族健康成年人唾液微生物菌群结构分析个体的 18 个身体部位 ( 包括口腔唾液 ) 这一大型的队列研究项目明确了超过 95% 的口腔唾液微生物是由 5 个主要门组成 : 厚壁菌门变形菌门拟杆菌门放线菌门梭杆菌门在本研究中, 健康人的唾液微生物组成与 HMP 的研究结果一致, 说明本次测序结果是可靠的核心微生物组是指所有或者绝大多数样本共有的微生物 [12] 核心微生物代表了口腔微生物的组成及菌群结构, 一个健康的口腔微生物群应该由一个健康的核心微生物主导这些含量丰富的核心微生物将保持健康生态系统所必需的功能稳定性和体内平衡目前来看, 在属水平定义核心微生物组比在门水平定义更加合理因此, 本研究定义了一级核心菌属, 标准为 : 在所有样本中均有分布, 且在样本中相对丰度均值 2% 的菌属 [2] 根据对核心菌的定义共得到 12 个核心菌属 : 链球菌属奈瑟菌属嗜血菌属普氏菌属罗氏菌属卟啉单胞菌属 Gemellaceae gen. 韦荣菌属颗粒链球菌属梭杆菌属放线菌属纤毛菌属链球菌属奈瑟菌属放线菌属韦荣菌属颗粒链球菌属是与健康息息相关的, 这个观点在第十二届欧洲牙周病研讨会中被达成共识 [13] 格登链球菌 (S.gordonii) 是口腔生物膜群落的重要组成成分, 作为口腔共生菌, 可以促进生物膜的稳态的形成 [14], 并且可以增加上皮屏障功能, 有利于维持健康组织上皮的完整性血链球菌 (S.sanguis) 也是常见的口腔共生菌, 其产生的过氧化氢和血链素被认为可以拮抗牙周致病菌 [15] 韦荣菌属也是参与口腔生物膜形成的早期定植菌, 可与链球菌属共聚, 促进格登链球菌生物膜的形成 [16] 放线菌属可与血链球菌共聚, 保护其免受氧化损伤 [17] 并且韦荣菌属奈瑟菌属放线菌属在许多研究中均被证实为健康人口腔中的优势菌 [4,18] 本研究在核心微生物中也发现大量常见的与人类疾病相关的微生物其中, 卟啉单胞菌属属于红色复合体, 与牙周炎的发生发展密切相关 [19] 还有证据表明, 牙龈卟啉单胞菌可能是包括口腔癌肠癌和胰腺癌在内的消化道肿瘤发展的驱动因素, 口腔鳞状细胞癌 ( OSCC) 也与其高度相关 [10] F. nucleatum 是梭杆菌属中调查最广泛的物种, 研 [20] 究表明,F. nucleatum 可以在人类牙齿上形成典型的牙菌斑, 与牙周病有关, 并可引起人类头颈部胸部肺部肝脏和腹部的侵袭性感染罗氏菌是在龋洞中发现的, 且在磨牙龋洞中的检测率很高, 表明其与龋病相关 [21] 纤毛菌属可存在于人体口腔及生殖道黏膜, 进入血液循环, 可引发严重的脓毒血症这些微生物在健康状态下不具有致病性, 但是在机体免疫功能降低或口腔菌群结构失调时引发疾病影响宿主的健康因此, 健康人口腔微生物的研究, 可促进对口腔微环境的了解, 在疾病预防和早期诊断及治疗中有重要意义参考文献 [ 1 ] KISTLER J O, BOOTH V, BRADSHAW D J, et al. Bacterial community development in experimental gin givitis[ J]. PLoS One, 2013,8(8): e [ 2 ] HE Y, GONG D, SHI C, et al. Dysbiosis of oral buc cal mucosa microbiota in patients with oral lichen pla nus[j]. Oral Dis, 2017,23(5): [ 3 ] BELSTRØM D, HOLMSTRUP P, FIEHN N E, et al. Salivary microbiota in individuals with different levels of caries experience [ J ]. J Oral Microbiol, 2017, 9 (1): [ 4 ] MEURIC V, Le GALL DAVID S, BOYER E, et al. Signature of microbial dysbiosis in periodontitis [ J]. Appl Environ Microbiol, 2017,83(14). [ 5 ] De GROOT P F, BELZER C, AYDIN Ö, et al. Dis tinct fecal and oral microbiota composition in human type 1 diabetes, an observational study[ J]. PLoS One, 2017,12(12): e [ 6 ] 兰琴, 郑亮, 奚晓玲, 等. 上海市高行社区老年人群糖尿病前期的患病率及其危险因素的调查分析 [ J]. 同济大学学报 ( 医学版 ),2017,38(3): [ 7 ] LIM Y, TOTSIKA M, MORRISON M, et al. The sa liva microbiome profiles are minimally affected by col lection method or DNA extraction protocols [ J]. Sci Rep, 2017,7(1): [ 8 ] YOSHIZAWA J M, SCHAFER C A, SCHAFER J J, et al. Salivary biomarkers: toward future clinical and diagnostic utilities [ J]. Clin Microbiol Rev, 2013, 26 (4): [ 9 ] LIU J, YANG H, YIN Z, et al. Remodeling of the gut microbiota and structural shifts in Preeclampsia patients in South China[ J]. Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 33

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