第 10 期梁丽丽, 等 : 郑州地区耐多药结核分枝杆菌 gyra 和 gyrb 基因突变特征及对氟喹诺酮类药物耐药研究 875 MDRMTBtoFQsweredeterminedbyDrugresistancegenes.Results Inthe256patients,MTBculturewa

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麟堂卢
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1 874 第 35 卷第 10 期 2018 年 10 月新乡医学院学报 JournalofXinxiangMedicalUniversity Vol.35 No.10 Oct.2018 欁欁本文引用 : 梁丽丽, 苑星, 刘新, 等. 郑州地区耐多药结核分枝杆菌 gyra 和 gyrb 基因突变特征及对氟喹诺酮类药物耐药研究 [J]. 新乡医学院学报,2018,35(10): DOI: /xxyxyxb 郑州地区耐多药结核分枝杆菌 gyra 和 gyrb 基因突变特征及对氟喹诺酮类药物耐药研究梁丽丽 1, 苑星 1, 刘新 1, 崔秀琴 2 3, 高谦 (1. 河南省胸科医院内六科, 河南郑州 ;2. 新乡医学院第一附属医院结核内二科, 河南卫辉 ; 3. 复旦大学上海医学院教育部分子病毒学重点实验室, 上海 ) 欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁临床研究摘要 : 目的分析郑州地区耐多药 (MDR) 结核分枝杆菌 (MTB) 临床分离株中 gyra 和 gyrb 基因突变特征及其对氟喹诺酮类 (FQs) 药物耐药的特点方法收集 2015 年 5 月至 2016 年 12 月河南省胸科医院收治的 256 例肺结核患者的痰标本, 进行 MTB 固体罗氏培养液体分枝杆菌培养,MTB 培养阳性者行比例法药物敏感性试验, 采用聚合酶链式反应扩增 MDRMTB 的 gyra 和 gyrb 基因, 对扩增产物进行测序和序列比对分析应用耐药基因判断 MDRMTB 对 FQs 药物耐药的敏感性和特异性结果 256 例患者中 MTB 培养阳性 215 例, 其中非 MDR 肺结核患者 137 例, MDR 肺结核患者 78 例 78 株 MDR MTB 临床分离株对氧氟沙星 (Ofx) 0.5mg L -1 莫西沙星 (Mfx0.5) 及 2.0mg L -1 莫西沙星 (Mfx2.0) 的耐药率分别为 55.1%(43/78) 55.1%(43/78) 32.1%(25/78);137 株非 MDR MTB 临床分离株对 Ofx Mfx0.5 及 Mfx2.0 的耐药率分别为 7.3%(10/137) 5.8%(8/137) 0.7%(1/137); 非 MDR MTB 临床分离株对 Ofx Mfx0.5 Mfx2.0 的耐药率显著低于 MDRMTB 临床分离株 (χ 2 = ,P< 0 001) gyra 基因 gyrb 基因在 Ofx 耐药株中的突变率分别为 90.7%(39/43) 11.6%(5/45);gyrA 基因 gyrb 基因在 Mfx0.5 耐药株中的突变率分别为 88.4%(38/43) 11.6%(5/43);gyrA 基因 gyrb 基因在 Mfx2.0 耐药株中的突变率分别为 100.0%(25/25) 12.0%(3/25) 以 FQs 药物敏感性试验结果为金标准,gyrA 基因突变判断 MDRMTB 对 Ofx Mfx0.5 Mfx2.0 耐药的敏感性分别为 90.7% 88.4% 58.1%, 特异性分别为 88.6% 85.7% 100.0%,gyrB 基因突变判断 MDRMTB 对 Ofx Mfx0.5 Mfx2.0 耐药的敏感性分别为 62.5% 62.5% 37.5%, 特异性分别为 45.7% 45 7% 68.6%, 检测 gyra 基因突变判断 MDRMTB 对 FQs 药物耐药的特异性高于 gyrb 基因突变 (χ 2 = ,P<0.001), 检测 gyra 基因突变判断 MDRMTB 对 Ofx 耐药的敏感性高于 gyrb 基因突变 (χ 2 =4 53,P<0.05) 结论郑州地区 MDRMTB 对 FQs 耐药率较高, 耐药的主要原因是 gyra 基因突变, 最常见的 gyra 基因突变位于 94 位点关键词 : 结核分枝杆菌 ; 氟喹诺酮类 ; 氧氟沙星 ; 莫西沙星 ; 基因型 ; 耐多药 ; 突变 ;gyra 基因 ;gyrb 基因中图分类号 :R 文献标志码 :A 文章编号 : (2018) CorrelationbetweenphenotypicresistancetofluoroquinolonesandgyrAandgyrBgenemutationsin multidrug resistantmycobacterium tuberculosisinzhengzhou,china LIANGLi li 1,YUANXin 1,LIUXin 1,CUIXiu qin 2,GAOQian 3 (1.DepartmentofInternalMedicine,HenanProvincialChestHospital,Zhengzhou450000,HenanProvince,China;2.TheSecond DepartmentofTuberculosis,theFirstAfiliatedHospitalofXinxiangMedicalUniversity,Weihui453100,HenanProvince,China; 3.KeyLaboratoryofMedicalMolecularVirology,InstitutesofBiomedicalSciencesandInstituteofMedicalMicrobiology,Shang haimedicalcolegeoffudanuniversity,shanghai200030,china) Abstract: Objective ToanalyzethecharacteristicsofgyrAandgyrBgenemutationsandthephenotypicresistanceto fluoroquinolones(fqs)inmulti drugresistant(mdr)mycobacteriumtuberculosis(mtb)isolatesinzhengzhou,china.meth ods Thesputumsamplesof256patientswithpulmonarytuberculosiswerecolectedinHenanProvincialChestHospitalfrom May2015toDecember2016.Thesputum sampleswereperformedwithmtbsolidrocheculturemethodandliquidculture method.thesampleswithpositivemtbwereperformedwithproportionaldrugsensitivitytest.thegyraandgyrbgenesof MDRMTBwereamplifiedbyPCR,andtheamplifiedproductsweresequencedandanalyzed.Thesensitivityandspecificityof DOI: /xxyxyxb 收稿日期 : 基金项目 : 国际科技合作与交流重大专项基金资助项目 ( 编号 :2014DFA30340); 河南省重点科技攻关项目 ( 编号 : ); 河南省医学科技攻关项目 ( 编号 : ) 作者简介 : 梁丽丽 (1975-), 女, 广东广州人, 硕士, 副主任医师, 研究方向 : 耐药结核病的诊治

2 第 10 期梁丽丽, 等 : 郑州地区耐多药结核分枝杆菌 gyra 和 gyrb 基因突变特征及对氟喹诺酮类药物耐药研究 875 MDRMTBtoFQsweredeterminedbyDrugresistancegenes.Results Inthe256patients,MTBculturewaspositivein215 patients.among215mtbpositivepatients,137caseswerenon MDRpulmonarytuberculosispatientsand78caseswereMDR pulmonarytuberculosispatients.theresistanceratesof78mdrmtbisolatestoofloxacin(ofx),0.5mg L -1 moxifloxacin (Mfx0.5)and2.0mg L -1 moxifloxacin(mfx2.0)were55.1%(43/78),55.1%(43/78)and32.1%(25/78)respec tively.theresistanceratesof137non MDRMTBisolatestoOfx,Mfx0.5andMfx2.0were7.3%(10/137),5.8%(8/137) and0 7%(1/137)respectively.Theresistanceratesofnon MDRMTBisolatestoOfx,Mfx0.5andMfx2.0weresignificantly lowerthanthoseofmdrmtbisolates(χ 2 =61.21,66.73,45.87;P<0.001).ThemutationrateofgyrAandgyrBgenewas 90.7%(39/43)and11.6%(5/45)inOfxresistantstrains.ThemutationrateofgyrAgenewas88.4%(38/43)inMfx0 5 resistantstrains,andthemutationrateofgyrbgenewas11.6%(5/43)inmfx0.5resistantstrains.themutationratesofgyra andgyrbgeneswere100.0%(25/25)and12.0%(3/25)inmfx2.0resistantstrains.thesensitivityandspecificityof MDR MTBtoFQsweredeterminedbythedrug resistancegenebasedontheresultsoffqsphenotypicdrugsensitivitytest. ThesensitivityofgyrAgenemutationinestimatingtheresistanceofMDRMTBtoOfx,Mfx0 5andMfx2.0was90.7%, 88 4% and58.1% respectively;andthespecificitywas88.6%,85.7% and100.0% respectively.thesensitivityofgyrb genemutationinestimatingtheresistanceofmdrmtbtoofx,mfx0.5,mfx2.0was62.5%,62.5and37.5%;andthespe cificitywas45.7%,45.7% and68.6%.thespecificityofjudgingresistanceofmdrmtbtofqsdrugbygyragenemutation wasbeterthanthatbygyrbgenemutation(χ 2 =17.86,15.44,13.92;P<0.001).Thesensitivityofjudgingresistanceof MDRMTBtoOfxdrugresistancebygyrAgenemutationwashigherthanthatbygyrBgenemutation(χ 2 =4.53,P<0.05). Conclusion TheresistancerateofMDRMTBtofluoroquinolonesishighinZhengzhou,China.Themainreasonofdrugre sistanceisgyragenemutation,andthemostcommongyragenemutationislocatedat94site. Keywords: Mycobacterium tuberculosis;fluroquinolones;ofloxacin;moxifloxacin;genotype;multidrugresistance;muta tion;gyragene;gyrbgene 结核病是威胁全世界的公共卫生问题, 是 2016 年全球九大死亡原因之一, 因结核病而死亡的人数居传染病死亡人数之首 [1] 耐药结核病是结核病防控的难点和重点, 世界卫生组织最新耐药结核病治疗指南建议将氟喹诺酮类 (fluoroquinolones,fqs) 药物作为抗结核治疗方案的核心药物之一 [2] FQs 药物对结核分枝杆菌 (Mycobacterium tuberculosis, MTB) 的杀菌机制是作用于由 gyra gyrb 基因编码的 2 个 A 亚基和 B 亚基组成的 DNA 解旋酶, 通过影响 DNA 复制而产生杀灭 MTB 的效果,MTB 对 FQs 药物产生耐药的分子机制是 gyra gyrb 基因的氟喹诺酮耐药决定区 (quinoloneresistancedetermi ningregion,qrdr) 发生突变 [3] 但不同的 FQs 药物及不同地区 FQs 药物主要的耐药基因及突变位点均不同, 本研究旨在了解郑州地区耐多药 (multi drugresistant,mdr) 肺结核患者对 FQs 药物的耐药情况, 分析 MDRMTB 对 FQs 药物耐药的耐药基因和突变位点, 并与药物敏感性试验进行对比, 筛选出判断 MDRMTB 对 FQs 药物耐药敏感性和特异性更高的耐药基因及位点, 以指导临床合理应用 FQs 药物治疗 MDR 肺结核现将结果报道如下 1 资料与方法 1.1 一般资料采用双盲前瞻性的临床研究方法, 收集 2015 年 5 月至 2016 年 12 月河南省胸科医院收治的肺结核患者 256 例为研究对象, 其中男 189 例, 女 67 例, 年龄 18~82(44.1±16.5) 岁, 均根据中华人民共和国卫生行业标准中肺结核诊断标准确诊 [4] 纳入标准:(1) 年满 18 岁 ;(2) 临床确诊肺结核 ( 包括初治和复治患者 );(3) 愿意在入组时提供足量痰标本 ;(4) 已签署知情同意书排除标准 : 无法提供足量痰标本者本研究在美国临床试验注册网站 (clinicaltrials.gov) 注册 ( 注册号 : NCT ) 并通过河南省胸科医院伦理委员会批准 1.2 主要试剂与仪器 MGIT 液体培养管 BACTECMGITTM960 液体培养系统分枝杆菌药物敏感性试剂盒均购自美国 BectonDickinson 公司, 罗氏培养基购自珠海贝索生物有限公司, 异烟肼 (iso niazide,inh) 利福平 (rifampicin,rfp) 氧氟沙星 (ofloxacin,ofx) 莫西沙星 (moifloxacin,mfx) 二甲基亚砜 (dimethylsulfoxide,dmso) 购自美国 Sigma 公司,TE 缓冲液购自北京索莱宝科技有限公司,2 TaqMasterMix 和 DNA 纯化试剂盒购自北京天根生化科技有限公司 ; 超低温冰箱 ( 日本三洋公司 ), 聚合酶链式反应 (polymerasechainreaction,pcr) 仪 ( 杭州博日科技有限公司 ) 1.3 标本采集及处理所有患者均在入组时留取至少 2mL 痰标本将标本进行 MTB 固体罗氏培

3 876 新乡医学院学报 htp:// 年第 35 卷养液体分枝杆菌培养培养阳性的 MTB 菌液分为 2 个部分, 一部分进行药物敏感性试验, 另一部分 -80 保存备用所有培养药物敏感性试验均按相关的标准化程序进行操作 [5] 药物敏感性试验中培养基药物终浓度如下 :INH 0.4mg L -1, RFP 40 0 mg L -1,Ofx 2.0 mg L -1,Mfx 0.5mg L -1 (Mfx0.5),Mfx2.0mg L -1 (Mfx 2 0) 药物敏感性结果判定: 耐药百分比 ( 含药培养基上菌落数 / 对照培养基上菌落数 100%)> 1% 者为 MTB 对该抗结核药物耐药对 INH 和 RFP 同时耐药的菌株则为 MDRMTB 1.4 MDR MTBDNA 模板的制备将药物敏感性试验确定为 MDRMTB 者所对应的保存菌株从 -80 复苏, 重新进行液体分枝杆菌培养, 从有 MDRMTB 生长的培养基中取 MDRMTB 菌落转移至含 1mL 生理盐水的 Eppendorf 离心管中,80 30min 灭活,12000r min -1 离心 5min, 弃上清液, 将菌体沉淀加入 500μLTE 缓冲液充分悬浮, 沸水浴 10min, 迅速置冰上 2min,12000r min -1 离心 10min, 上清液即为 DNA 模板溶液将上清液样本按编号顺序排列, 吸取 DNA 溶液置于 8 连排管中, 每 3 排的第 8 个样本设 1 个阳性对照 ( 已知突变的样本 ) 1.5 MDR MTB 的 PCR 扩增及测序使用 PCR 引物扩增 MDRMTB 的 gyra gyrb 基因 PCR 反应体系为 50.0μL, 其中 2 TaqMasterMix25.0μL, 引物 3.0μL,DMSO1.5μL,DNA 模板 3.0μL, 蒸馏水 17.5μL gyra 引物序列 :5 GGCCGTCGTAGT TAGGGATG 3,gyrB 引物序列 :5 GACGCGAAAGT CGTTGTGAA 3 PCR 扩增条件为 95 预变性 2min,95 变性 20s 54 退火 40s 72 延伸 2min, 共 35 个循环,72 延伸 5min,12 保存扩增后的 PCR 产物均为 320 个碱基对, 送上海桑尼生物科技有限公司进行纯化和测序 1.6 应用基因突变判断 MDR MTB 对 FQs 药物耐药的敏感性和特异性应用 ClustalW( 欧洲生物信息研究所 ) 序列对比软件, 将扩增产物的测序结果与标准 MTB 菌株 H37Rv 的 gyra 和 gyrb 基因序列进行比对, 若与标准 MTB 菌株序列相同, 则 gyra 和 gyrb 基因无突变, 即为野生株 ; 若序列不同, 则证实 gyra 和 gyrb 基因突变, 即为耐药株记录所有耐药株的突变类型和突变位点, 以该菌株的 FQs 药物敏感性试验结果为金标准, 可得出应用 gyra 和 gyrb 基因突变判断 MDRMTB 对 FQs 药物耐药的敏感性和特异性 1.7 统计学处理应用 SPSS20.0 软件进行分析, 计数资料进行 χ 2 检验,P<0.05 为差异有统计学意义 2 结果表例 MTB 培养阳性肺结核患者 MTB 临床分离株药物敏感性试验结果 2.1 MTB 培养阳性者的抗结核药物耐药情况 256 例患者中,MTB 培养阳性 215 例, 其中初治患者 80 例, 复治患者 135 例 ; 非 MDR 肺结核患者 137 例,MDR 肺结核患者 78 例 (77 例为复治患者,1 例为初治患者 ) 137 株非 MDRMTB 临床分离株中, 对 FQs 药物耐药 10 株, 其中对 Ofx 耐药 10 株, 对 Mfx 耐药 8 株, 对 Mfx2.0 耐药 1 株 78 株 MDR MTB 临床分离株中, 对 FQs 药物耐药 45 株, 其中对 Ofx 耐药 43 株, 对 Mfx0.5 耐药 43 株, 对 Mfx2.0 耐药 25 株非 MDRMTB 临床分离株对 Ofx Mfx0.5 Mfx2.0 的耐药率显著低于 MDRMTB 临床分离株 (χ 2 = ,P<0.001), 见表 1 Tab.1 Drugresistanceofphenotypedrugsensitivitytestresultsin215pulmonarytuberculosispatientswithpositiveMTB culture 株别 n INH 耐药 / 株 (%) RFP 耐药 / 株 (%) Ofx 耐药 / 株 (%) Mfx0.5 耐药 / 株 (%) Mfx2.0 耐药 / 株 (%) MDRMTB 78 78(100.0) 78(100.0) 43(55.1) 43(55.1) 25(32.1) 非 MDRMTB (13.9) 8(5.8) 10(7.3) 8(5.8) 1(0.7) χ P <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 < 对 Ofx 及 Mfx 耐药的 MDR MTB 基因突变类型与突变位点结果见表 2 43 株对 Ofx 耐药的 MDRMTB 中,39 株 (90.7%)gyrA 基因突变,5 株 (11.6%)gyrB 基因突变 ;43 株对 Mfx0.5 耐药的 MDRMTB 中,38 株 (88.4%)gyrA 基因突变,5 株 (11.6%)gyrB 基因突变 ;25 株对 Mfx2.0 耐药的 MDRMTB 中,25 株 (100.0%)gyrA 基因突变,3 株 (12.0%)gyrB 基因突变 45 株对 FQs 药物耐药的 MDRMTB 经基因测序发现,gyrA 基因突变分布于位点, 涉及 3 个密码子,7 种突变类型, 其中 94 位点突变最多 ; gyrb 基因突变分布于位点,

4 第 10 期梁丽丽, 等 : 郑州地区耐多药结核分枝杆菌 gyra 和 gyrb 基因突变特征及对氟喹诺酮类药物耐药研究 877 涉及 5 个密码子,5 种突变类型, 突变位点分布均基因 90 位点突变 11 株, 药物敏感性试验证实对 Ofx 匀 gyra 基因 94 位点突变 26 株, 药物敏感性试验耐药 8 株 (72.7%), 对 Mfx0.5 耐药 7 株 (63 6%), 证实对 Ofx Mfx0.5 耐药 26 株 (100.0%), 对 Mfx 对 Mfx2.0 耐药 4 株 (36.4%) 43 株 Mfx 耐药的 2.0 耐药 19 株 (73.1%) gyra 基因 91 位点突变 5 gyra 基因突变株中, 发现 5 株双突变株, 其中包括 2 株, 药物敏感性试验证实对 Ofx Mfx0.5 耐药 5 株株 A90V+S91P 1 株 A90V+D94N 1 株 A90V+ (100 0%), 对 Mfx2.0 耐药 3 株 (60.0%) gyra D94Y 1 株 D94N+D94Y 表 2 MDRMTB 的药物敏感性试验及 gyra gyrb 基因测序结果 Tab.2 ResultsofdrugsensitivitytestandthesequencingresultsofgyrA,gryBgenesinMDRMTB 药物敏感 gyra 基因 gyrb 基因 n 性类型突变类型菌株数突变类型菌株数 Ofx 敏感 35 WT 31 WT 32 A90V(GCG GTG) 4 a G551R(GGG AGG) 2 a A100T(GCC ACC) 1 T539N(ACC AAC) 1 P5195(CCG TCG) 1 Ofx 耐药 43 WT 4 WT 38 D94G(GAC GGC) 15 b R534R(CGG CGT) 1 D94A(GAC GCC) 4 T539N(ACC AAC) 1 D94N(GAC AAC) 5 E540D(GAA GAC) 1 D94Y(GAC TAC) 3 A543V(GCG GTG) 1 A90V(GCG GTG) 10 G551R(GGG AGG) 1 S91P(TCG CCG) 5 D94(GAC TGC) 1 Mfx0.5 敏感 35 WT 30 WT 32 A90V(GCG GTG) 5 c G551R(GGG AGG) 2 a A100T(GCC ACC) 1 T539N(ACC AAC) 1 P5195(CCG TCG) 1 Mfx0.5 耐药 43 WT 5 WT 38 D94G(GAC GGC) 15 d R534R(CGG CGT) 1 D94A(GAC GCC) 4 T539N(ACC AAC) 1 药物敏 gyra 基因 gyrb 基因 n 感性类型突变类型菌株数突变类型菌株数 D94N(GAC AAC) 4 E540D(GAA GAC) 1 D94Y(GAC TAC) 3 A543V(GCG GTG) 1 A90V(GCG GTG) 10 G551R(GGG AGG) 1 S91P(TCG CCG) 5 D94(GAC TGC) 2 Mfx2.0 敏感 53 WT 35 WT 48 A90V(GCG GTG) 10 e T539N(ACC AAC) 2 a D94G(GAC GGC) 2 G551R(GGG AGG) 2 D94A(GAC GCC) 2 E540D(GAA GAC) 1 D94N(GAC AAC) 2 P5195(CCG TCG) 1 D94Y(GAC TAC) 3 S91P(TCG CCG) 3 A100T(GCC ACC) 1 Mfx2.0 耐药 25 D94G(GAC GGC) 13 a WT 22 D94A(GAC GCC) 2 R534R(CGG CGT) 1 D94N(GAC AAC) 3 A543V(GCG GTG) 1 A90V(GCG GTG) 4 G551R(GGG AGG) 1 S91P(TCG CCG) 2 D94(GAC TGC) 2 注 :WT(wildtype) 指菌株的相关基因片段测序未发生突变 a : 有 1 株为双突变 ; b : 有 5 株为双突变 ; c : 有 2 株为双突变 ; d : 有 4 株为双突变 ; e : 有 3 株为双突变 2.3 应用耐药基因判断 MDR MTB 对 FQs 药物 0 001); 检测 gyra 基因突变判断 MDRMTB 对 Ofx 耐药的敏感性和特异性结果见表 3 检测 gyra 基耐药的敏感性高于 gyrb 基因突变 (χ 2 =4.53,P< 因突变判断 MDRMTB 对 FQs 药物耐药的特异性高 0 05) 于 gyrb 基因突变 (χ 2 = ,P< 表 3 应用 gyra 与 gyrb 基因突变判断 MDRMTB 对 FQs 药物耐药的敏感性和特异性 Tab.3 SensitivityandspecificityofjudgingFQsdrugresistanceinMDRMTBbygyrAandgyrBgenemutations 基因型 Ofx 耐药 Mfx0.5 耐药 Mfx2.0 耐药敏感性 /% 特异性 /% 敏感性 /% 特异性 /% 敏感性 /% 特异性 /% gyra 基因 gyrb 基因 χ P <0.05 <0.001 >0.05 <0.001 >0.05 <0.001 注 : 以药物敏感性试验结果为金标准 3 讨论目前, 与 MTB 对 FQs 药物耐药相关的基因中, 研究最广泛的是 gyra 基因和 gyrb 基因突变王志 [6] 锐等研究证明,gyrA 基因 QRDR 发生突变是 MTB 对 FQs 药物产生耐药的主要原因但国内有关 MDRMTB 对 FQs 药物耐药基因的相关研究较少, 本研究主要就 MDRMTB 对 FQs 药物耐药的相关基因和突变位点进行分析, 以寻找最能体现 MDRMTB 对 FQs 药物耐药的基因突变本研究结果显示, 在 90.7% 的对 Ofx 耐药 MDRMTB 中发现 gyra 基因突变 ; 在 88.4% 的低浓度 Mfx(0.5mg L -1 ) 耐药 MDRMTB 中发现 gyra 基因突变 ; 在 100% 的高浓度 Mfx(2.0mg L -1 ) 耐药 MDRMTB 中发现 gyra

5 878 新乡医学院学报 htp:// 年第 35 卷基因突变 ; 以上结果说明 gyra 基因突变是 MDR MTB 对 FQs 药物耐药的主要原因本研究中 MDR MTB 与 FQs 药物耐药相关的 gyra 基因突变分布于位点, 其中 gyra 基因于 94 位点出现突变的频率最高, 且在 gyra 基因 94 位点出现突变的所有 MDRMTB 均对 Ofx 和低浓度 Mfx 耐药, 并对大部分高浓度 Mfx 耐药, 不仅说明 MDRMTB 对 FQs 药物存在交叉耐药性, 还提示 gyra 基因 94 位点突变可能是判断 MDRMTB 对 FQs 药物耐药的一个敏感指标故在确定 MDR 肺结核患者抗结核治疗方案时, 若分子基因检测证实 gyra 基因 94 位点突变, 不应再选择 FQs 药物, 或至少不能将其做为抗结核治疗方案中的核心药物之一本研究结果显示, 在 gyra 基因突变并对 Mfx 耐药的 MDRMTB 中还发现 5 株双突变菌株, 包括 2 株 A90V+S91P 1 株 A90V+D94N 1 株 A90V+ D94Y 1 株 D94N+D94Y 这 5 株双突变菌株中仅 1 株对高浓度 Mfx 耐药, 其余 4 株均对低浓度 Mfx [7] 耐药, 与以往刘志广等的研究结论 gyra 基因的双突变与 MTB 对高浓度 FQs 药物耐药有关不同 [7] 其原因可能为所观察的菌株不同, 刘志广等研究的菌株为 MTB, 而本研究的菌株为 MDRMTB;gyrA 基因的双突变株在样本中比例较少, 故本研究认为, 双突变菌株对高浓度或低浓度 FQs 药物耐药的关系较难判断本研究中,gyrB 基因突变分布于位点, 在对 FQs 药物耐药菌株中 gyrb 基因突变发生率为 11.6% ~12.0% 有研究证实,gyrB 基因在 540 位点的突变与 FQs 药物耐药密切相关 [8], 但本研究发现,gyrB 基因 5 个位点的突变分布均匀, 并未发现 540 位点突变频率高于其他位点在本研究中,gyrB 基因突变常与 gyra 基因突变共同存在,gyrB 基因的突变率远低于 gyra 基因, 故认为 gyrb 基因突变并不是判断 MDRMTB 对 FQs 药物耐药的敏感性和特异性指标 FQs 药物是治疗结核病重要的二线药物, 但 FQs 药物的临床应用已二十余年, 且被广泛应用于其他细菌感染的治疗, 致使该类药物的耐药率不断上升本研究发现,78 株 MDRMTB 临床分离株, 对 Ofx 的耐药率为 55.1%, 对 Mfx0.5 的耐药率为 55 1%, 对 Mfx2.0 的耐药率为 32.1%, 明显高于非 MDRMTB 临床分离株综上所述, 郑州地区 MDRMTB 对 FQs 药物耐药率较高, 耐药的主要原因是 gyra 基因突变, 最常见的 gyra 基因突变位于 94 位点 gyrb 基因突变率明显低于 gyra 基因故对 MDRMTB 患者来说, 在应用分子基因检测技术检测 MDRMTB 对 FQs 药物的耐药性时, 应重点检测 gyra 基因突变本研究尚有一些不足之处, 如样本量较小, 没有进行 FQs 药物最低抑菌浓度的测定, 无法准确了解 gyra gyrb 基因不同位点突变与最低抑菌浓度的相关性, 还需今后的进一步研究参考文献 : [1] WORLDHEALTH ORGANIZATION.GlobalTuberculosisReport 2017[M].Geneva:WorldHealthOrganization,2017: [2] WORLD HEALTH ORGANIZATION.WHO treatmentguidelines fordrug resistanttuberculosis(2016update)[m].geneva:world HealthOrganization,2016: [3] MALIKS,WILLBYM,SIKESD,etal.Newinsightsintofluoro quinoloneresistanceinmycobacterium tuberculosis:functionalge neticanalysisofgyraandgyrbmutations[j].plosone,2012,7 (6):e [4] 中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会. 中华人民共和国卫生行业标准 [M]. 北京 : 人民卫生出版社,2017:1 4. [5] 赵雁林, 王黎霞, 成诗明, 等. 结核分枝杆菌药物敏感性试验标准化操作程序及质量保证手册 [M]. 北京 : 人民卫生出版社, 2013: [6] 王志锐, 谢彤. 氟喹诺酮耐药与结核分枝杆菌中 gyra 和 gyrb 基因突变的研究进展 [J]. 医学综述,2017,23(13): [7] 刘志广, 郭倩, 魏剑浩, 等. 结核分枝杆菌 gyra 基因突变与氧氟沙星耐药水平的相关性研究 [J]. 实用预防医学,2015,22(6): [8] DISTATTHAKITA,PRAMMANANANT,TRIBUDDHARATC,et al.roleofgyrbmutationsinpre extensivelyandextensivelydrug resistanttuberculosisinthaiclinicalisolates[j].antimicroba gentschemother,2016,60(9): ( 本文编辑 : 李胜利英文编辑 : 徐自超 )

福建农业学报材料与方法试验菌株引物主要仪器主要试剂细菌培养模板的制备反应条件扩增产物的检测特异性试验敏感性试验分离菌株检测产物的克隆及序列测定结果与分析

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第 10 期 梁丽丽, 等 : 郑州地区耐多药结核分枝杆菌 gyra 和 gyrb 基因突变特征及对氟喹诺酮类药物耐药研究 875 MDRMTBtoFQsweredeterminedbyDrugresistancegenes.Results Inthe256patients,MTBculturewa

第 10 期梁丽丽, 等 : 郑州地区耐多药结核分枝杆菌 gyra 和 gyrb 基因突变特征及对氟喹诺酮类药物耐药研究 875 MDRMTBtoFQsweredeterminedbyDrugresistancegenes.Results Inthe256patients,MTBculturewa