9 教学研究 [] 学 ( 生物学 ) 四个专业方向针对拔尖学生培养目标, 需要对已有生物学专业的实验课程内容进行改革, 北京师范大学生命科学学院在拔尖学生的实验课程 [] 培养方案方面进行了探索改革日本学者思田彰指出, 创新型人才能够构思和创造有价值的东西, 具有创造能力北京大学清华大学

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委罄吕
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1 DOI: 0.8/cjcb 中国细胞生物学学报 Chinese Journal of Cell Biology 06, 8(): 9 0 教学研究植物转基因技术在高校本科生实验课程中的应用及方案设计宋宏涛李万杰向本琼* 聂频文 (北京师范大学生命科学学院实验教学中心, 北京 00875; 北京师范大学细胞增殖及调控生物学教育部重点实验室, 北京 00875) 摘要植物转基因技术是生物学研究的常用技术, 也是高校生物学系本科生实验教学的重要内容之一该文结合不同的植物转基因技术手段, 对原有的植物转基因技术在实验课程中的应用方案进行了重新整合设计, 从转基因植株的获得筛选到多层次鉴定转基因效果等, 科学完整地设计了综合实验课程, 探究了实验的实施和可行性, 并给出了具体的课程实施建议该教学实验设计也为高校生物学实验课程改革作了全新的探究和尝试关键词植物转基因; 综合实验; 实验课程改革 The Application and Experimental Project Design of Plant Transgenic Technology in the Undergraduate Experimental Course Song Hongtao, Li Wanjie, Xiang Benqiong*, Nie Pinwen (Experimental Teaching Center, College of Life Science, Beijing Normal University, Beijing 00875, China; Key Laboratory of Cell Proliferation and Regulation Biology, Ministry of Education, Beijing Normal University, Beijing 00875, China) Abstract The plant transgenic technology is commonly used in biology research, and it is one of important contents in undergraduate experimental teaching courses. In this paper, the experimental project for plant transgenic technology is re-integrated and designed by combing multiple plant transgenic technologies. The comprehensive experimental project includes the production of transgenic plants, screening of transgenic plants and multi-level identification of transgenic effects. We also explore the feasibility of implementation for the experimental project, and give some detailed suggestions for its implementation. The experimental teaching design can be considered as a new exploration and attempt for the reform of the undergraduate biology experimental course. Keywords plant transgenic; comprehensive experimental project; reform of experimental course 引言了基础学科拔尖学生培养试验计划 (又名珠峰计. 课程设置背景 009年, 教育部联合中组部财政部启动实施划 ), 目标是针对高水平研究型大学的优势基础学收稿日期: 接受日期: 05-- 北京师范大学教学建设与改革项目(批准号: -0-6)资助的课题 *通讯作者 Tel: , xiangbq@bnu.edu.cn Received: October 7, 05 Accepted: December, 05 This work was supported by the Teaching Construction and Reform Project of Beijing Normal University (Grant No.-0-6) *Corresponding author. Tel: , xiangbq@bnu.edu.cn 网络出版时间: :5:59 URL: 拔尖学生重点培养的体制机制, 吸引优秀的学生投科, 建立一批国家青年英才培养基地, 建立高等学校身到基础科学研究, 形成拔尖创新人才培养的良好氛围, 并努力使受计划支持的学生未来能成为相关基础学科领域的领军人物[-] 00年, 北京师范大学开始实施基础学科拔尖学生培养试验计划并创立励耘学院, 分别设置数学物理化学生命科

2 9 教学研究 [] 学 ( 生物学 ) 四个专业方向针对拔尖学生培养目标, 需要对已有生物学专业的实验课程内容进行改革, 北京师范大学生命科学学院在拔尖学生的实验课程 [] 培养方案方面进行了探索改革日本学者思田彰指出, 创新型人才能够构思和创造有价值的东西, 具有创造能力北京大学清华大学中山大学等国内著名高校生物专业近年已经根据自身的特点实行了实验教学改革, 并且形成 [] 了具有特色的教学模式北京师范大学生命科学学院结合原有的实验课程体系设计了生物学综合实验 I~IV( 共四个模块 ) [], 本文主要针对生物学综合实验模块 III 中的植物转基因技术的应用实验内容进行了探究和设计. 植物转基因技术早在 0 世纪 70 年代, 人们就开始对植物转基因 [5] 开展研究 0 世纪 80 年代初, 转基因矮牵牛和转基 [6] 因烟草获得成功后, 植物基因工程发生了质的飞跃, 植物转基因技术得到了广泛的应用和发展近年来, 随着高等植物的细胞培养组织分化和再生以及基因重组技术发展日趋成熟, 植物转基因技术 [7,] 进入了快速发展的新阶段目前, 用于植物细胞外源基因导入的方法和技术有很多种, 主要分为载体介导法和 DNA 直接导入法载体介导法主要分为农杆菌介导法和病毒介导法 ; DNA 直接导入法包含化学物质诱导法电击穿孔法脂质体法显微注射法基因枪法花粉管通道法等在这些方法当中, 农杆菌介导的基因转化法有较为明显的优势 : 可插入大片段的外源基因 ; 外源基因转入时的拷贝数低, 并优先插入具有转录活性的区域 ; 基因沉默现象少, 基因转化的效率高, 尤其在双子叶植物当中 ( 高达 80%~90%), 在单子叶植物中稍低 ( 可达 0%~0%) [8] ; 转化再生的植株毋需原生质体培养再生, 并且通常是可育的, 转入的 [7] 外源基因通常呈预期的孟德尔遗传农杆菌介导的瞬时表达提供了一种快速分析基因型功能的方 [] 法农杆菌介导的瞬时表达是将目的基因插入共整合载体或双元载体, 转化根癌农杆菌通过真空渗透或针管注射入植物叶片组织中检测构建含目的基因的载体能否正确表达, 同时也可快速获 [5] 知目的蛋白有无活性浸花法在拟南芥当中的研究较多, 是指在拟南芥合适的发育时期, 用含有表面活性剂 silwet-77 的 5% 蔗糖溶液悬浮农杆菌, 并用此菌液浸染花序的方法这种方法不用进行愈伤组织培养, 能够在短时间之内对作物进行遗传改良, [6] 并且利于大批量的工作正是具有这些明显的优势使得农杆菌介导的外源基因转化的方法越来越成为各种植物基因转化的主要方法, 并形成了较为成熟的体系. 植物转基因技术在实验课程中的应用及问题国内高校植物转基因技术应用于实验课程教学中, 绝大部分是以烟草为实验材料进行转基因介导, 学生的操作大部分只是按部就班的验证性行为一些高校甚至考虑到实验周期长实验经费高, 采 [9] 用了演示观摩实验进行替代内蒙古大学生命科学学院探究了全新的植物细胞工程实验教学体系, 通过整合植物组织细胞和分子三个水平的实验教学内容和操作技术, 采用集中讲解独立操作全 [0] 天候开放的实验教学模式我院原有的植物转基因技术在实验课程中的应用体现在本科生三年级的生物技术大实验中, 基本内容涉及农杆菌介导的烟草转基因 [ 绿色荧光蛋白基因 (green fluorescent protein gene, gfp)] 植物的获得和利用 PCR 技术对转基因植株进行鉴定两大部分但是, 原有的这部分实验课程, 学生对实验原理的理解不够深入, 学习较为被动, 动手多动脑少的现象普遍存在 ; 实验内容的内在联系不够紧密, 学生对某项技术的学习也是浅尝辄止, 对相关实验技术没有机会深入了解, 迫切需要一种多层次多元化的实验教学模式鉴于此, 我院针对励耘理科实验班学生的有关植物转基因技术的实验课程设置进行了创新性探索和实施将实验分为两大模块 ( 图 ): 转基因植物的获得转基因植物的筛选及鉴定在转基因植物的获得部分中, 将 gfp 基因作为目的基因, 同时也是报告基因, 继续采用了技术较为成熟的农杆菌介导的叶盘法 [] 转化模式植物烟草后期在长达 6 周左右的转化植株筛选过程中, 穿插设置了烟草叶 [] 片的直接注射法的外源基因的瞬间转化实验和浸花法 [] 转化拟南芥的实验, 通过多种转基因技术手段不同基因转化效果 ( 稳定转化和瞬间转化 ) 和不同转基因部位 ( 叶片花 ) 等多层次立体化的实践教学模式同时融入了同一个实验模块中第二模块转基因植物的筛选和鉴定, 从三个不同水平开展 : 表型直接观察鉴定外源基因的表达活性 ( 蛋白质水平 ) 植物组织 RNA 的提取及 RT-PCR 鉴定外源

95 宋宏涛等: 植物转基因技术在高校本科生实验课程中的应用及方案设计基因的表达(转录水平) 基因组DNA的分离及PCR 鉴定外源基因的存在和Southern杂交法鉴定转基因插入拷贝数(基因组水平) 这样安排体现了由表及里从宏观到微观的逐步探究逐层深入的科学研究思路, 培养和锻炼了学生严谨的科研思维为.

3 95 宋宏涛等: 植物转基因技术在高校本科生实验课程中的应用及方案设计基因的表达(转录水平) 基因组DNA的分离及PCR 鉴定外源基因的存在和Southern杂交法鉴定转基因插入拷贝数(基因组水平) 这样安排体现了由表及里从宏观到微观的逐步探究逐层深入的科学研究思路, 培养和锻炼了学生严谨的科研思维为. 教学重点与难点本实验的教学重点是系统掌握多种转基因技术的原理及多层次鉴定基因转化效果的方法教学难点在于多种分子生物学技术手段的应用和结果分析写设计报告并不展开实验, 以小组汇报的形式进行. 实验材料与设备.. 主要材料烟草幼苗拟南芥植株含 T-DNA载体质粒pcambia00的EHA05农杆菌菌株 gfp特异性扩增引物序列(上游引物: 5 -TCT TGT TGA ATT AGA TGG CG-, 下游引物: 5 -GTT GAT AAT GGT CTG CTA AT- ) 内参引物序列[根据烟草组成表达基因actin(EU98079.)设计, 上游引物: 5 -AGG GTT TGC TGG AGA TGA TG-, 下游引物: 考查 5 -CGG GTT AAG AGG TGC TTC AG- ] silwet-77 了进一步加强和巩固已学实验内容, 让学生综合和归纳学过的内容, 设置课后作业综合设计实验, 题目为将某特定基因[如小麦抗倒伏基因咖啡酸甲基转移酶基因(caffeic acid--o-methyltransferase, COMT)]转入某模式植物中(如拟南芥) 的实验, 目的是让学生巩固与归纳已学的实验方法, 锻炼学生实验设计的水平和应用已学知识的能力设计实验只表面活性剂乙酰丁香酮(acetosyringone, AS) -(N- 教学设计与安排吗啡啉)乙磺酸(N-morpholino-ethanesulfonic acid,. 教学目的通过本实验让学生掌握农杆菌介导的转基因方法以及双载体系统的基本原理掌握叶盘法注射法浸花法基因转化的基本原理和相关的 MES) 植物组织培养实验相关试剂常规植物基实验技术掌握以gfp作为报告基因的转基因植物式恒温培养箱全天候光照培养箱体视荧光显微的检测原理和方法同时, 实验过程中学习荧光显镜及采相系统 ml医用注射器 PCR仪核酸杂微镜的使用方法, 并巩固应用分子生物学技术手段交炉琼脂糖凝胶成像系统琼脂糖凝胶电泳仪及进行转基因植物的鉴定其他常用实验设备等因组提取相关试剂 RT-PCR实验相关试剂 Southern杂交实验相关试剂及其他常规生化试剂等.. 主要设备 ݰ ᴚ㦠㤝㢅 Ⲭ ᇘ 䳝 ᡫᗻ 䗝 ᬊ䲚Fҷ ᄤ ~6 䗝 ᡫᗻỡ 㦋ᕫ ᡫᗻỡ 㦋ᕫ 㓐ড়䆒䅵ᅲ偠 ᬊ䲚Fҷ ᄤ ⶀ䯈䕀〇ᅮ䕀 ᢳफ㡹超净工作台恒温摇床隔水㸼ⲂЈᯊ㺙㲟ⱑ ᑇ 㾖ᆳ㤻 ܝ Ḍ䝌ᦤপ 䕀ᔩ ᑇ RT-PCR 㒘 ᑇ Southern blot 图实验方案及流程展示 Fig. Experimental program and ﬂow display ϡৠሖ 䗝䡈ᅮ 㒘 ᑇ PCR

4 教学研究 96 表建议课时及内容安排 Table Suggestions about class hours and content arrangement 实验实验准备叶盘法转化烟草周次课时数内容安排实验总论介绍本实验总体安排主要实验内容及农杆菌介导的植物转基因的原理和方法分组配制MS培养基的母液植物激素母液, 准备叶盘法基因转化所需的外植体消毒的器皿和工具, 配置所需的MS诱导与分化培养基并分装, 配置YEB培养基对以上实验用品和试剂进行灭菌进行农杆菌的活化讲解叶盘法基因转化中的注意事项, 检查预习情况进行叶盘法基因转化的实验操作(外植体的消毒等) 配制注射法和浸花法基因转化和所需的试剂: YEB培养基预培养液A 重悬培养基等准备MS培养基更换所需要的器材灭菌活化农杆菌考查预习情况, 集中讲解注射法和浸花法基因转化的理论知识和实验注意事项分别使用注射法转化烟草; 浸花法转化拟南芥注射法转化烟草和浸花法转化拟南芥测表型观察 (蛋白质水平) 测植物总RNA 的提取和RT-PCR (转录水平) 测植物总DNA 的提取 PCR鉴定 (基因组水平) 测 Southern杂交 (转膜)(基因组水平) 7 测 Southern杂交 (洗膜检测) (基因组水平) 8 设计汇报 9 8 考查预习情况, 讲解转基因植物筛选的常用方法和原理, 讨论gfp作为报告基因在植物转基因技术中的应用在无菌操作台摘取小块实验组和对照组的烟草愈伤组织于荧光显微镜下观察并采相记录结果, 准备植物组织RNA提取需要的试剂和实验用品考查预习情况, 集中讲解从转录水平检测转基因植物和RT-PCR的原理和方法提取实验组和对照组烟草愈伤组织的RNA, 并进行电泳检测测定所提取的RNA的浓度并进行第一链cDNA的合成进行以cDNA为模板的目的基因PCR和电泳检测(PCR期间更换MS筛选培养基并准备下次更换培养基的用具, 准备提取植物基因组DNA所需的试剂和用具) 考查预习情况, 集中讲解基因组提取 PCR和Southern杂交的实验原理进行烟草愈伤组织基因组DNA的提取和大肠杆菌中pCAMBIA00重组质粒的提取实验配制PCR反应体系, 并进行PCR(PCR完成后, 将回收产物存放在 C即可), 配制Southern杂交需要的变性液和中和缓冲液, 配制基因组酶切沉淀DNA需要的NaAc溶液进行上次课PCR产物的凝胶电泳检测进行基因组DNA的酶切和酶切产物的琼脂糖凝胶电泳制作Southern杂交转膜的装置转膜后进行预杂交5~6 h, 助教收集膜, 存放于 C冰箱中实验前一天将杂交管中的预杂交液倒出, 加入含有适量探针的杂交液, 杂交过夜进行Southern杂交的洗膜和检测, 布置实验设计课题设计实验: 利用gfp作为报告基因, 将小麦抗倒伏基因咖啡酸甲基转移酶基因(COMT)转入拟南芥实验设计的小组汇报. 教学安排.. 学时安排本实验共分成三个阶段(表): () 转基因植物的获得: 叶盘法(8学时) 注射法和浸花法并行(8学时); ()转基因植株的筛选鉴定: 蛋白水平表型观察(8学时) 基因组水平PCR法鉴定外源基因(8学时) 基因组水平Southern杂交鉴定外源基因转入拷贝数(8学时) 转录水平RT-PCR鉴定外源基因表达(8学时); ()综合实验设计方案讨论及展示( 学时).. 课前准备烟草幼苗(提前个月播种)及拟南芥植株(提前周播种)培养农杆菌活化(提前周) 相关引物合成等.. 课后安排第周需要实验前一天下午接种农杆菌培养从第周至第7周, 学生自主安排转化植株的抗性培养基更换(每次 h)及其他机动安排事项.. 分组实验建议人为一小组任务与要求: 协调分工, 通力合作, 包括不同实验流程实验结果

5 97 宋宏涛等: 植物转基因技术在高校本科生实验课程中的应用及方案设计观察实验数据分析和实验报告整理植物的原理概述, 叶盘法详细操作步骤参考曾庆平.5 实验原理实验课上教师讲解基本实验原理和实验设计理论, 要求学生提前预习并扩展阅读, 完成如下预习内容阅读参考文献[5-7,], 简述植物转基因技术和转基因植物筛选鉴定的发展历史参考要点: 早在 0世纪70年代, 人们就开始对植物转基因开展研究近十几年来, 高等植物的组织分化和再生细胞培养等基因重组技术发展日趋成熟, 植物转基因技术也逐渐发展起来[7] 0世纪80年代初, 转基因矮牵牛[5] 等的论文[8] 注射法转化烟草叶片, 实验步骤参考 [6] 黎茵等的论文[] 浸花法转化拟南芥的实验步骤参考文献[].6. 转基因植株的筛选鉴定 ()潮霉素抗性筛选烟草实验: 将共培养处理的烟草叶片转移到凝固后的筛选培养基上(含00 mg/l羧苄青霉素和5 mg/l潮霉素B, 其中羧苄青霉素起到抑制农杆菌生长的作用过多的农杆菌会抑制叶外植体的生长) 每隔~ d 继代次(一周次), 培养条件为: 光照 000 lx 温度 6 C 日照6 h 周后, 转基因细胞分裂生长形成大量愈伤组织并有根芽分化拟南芥浸花法实和转基因烟草获得成功参考阅读文献[5-7], 简述植物转基因及其筛验: 将浸花后的拟南芥培养并收种子, 用含有潮霉素选技术的原理参考要点: 根癌农杆菌对植物释放 (5 mg/l)的ms平板对种子进行筛选连续收集F 的化学物质产生趋化反应, 向植物受伤组织集中代和F代种子进行抗性筛选 ()表型直接观察法经共培养后, 受伤部位的化学诱导物透过农杆菌的 (蛋白水平鉴定) 在无菌操作台取出烟草愈伤组织细胞膜使Ti质粒上的vir基因活化 vir基因产物使小块置于载玻片上打开荧光显微镜, 调焦后在蓝 Ti质粒上的T-DNA进入植物细胞, 并整合到植物核光激发的状态下观察样品的颜色并采相 ()基因基因组中插入在T-DNA左右边界区内的目的基组水平(PCR法)鉴定植物基因组DNA的提取采用因也随之整合到植物染色体上, 从而使目的基因在 CTAB法[7] PCR及琼脂糖凝胶电泳步骤[] ()转植物细胞中得到表达[5] 外源基因导入植物细胞录水平(RT-PCR法)鉴定外源基因的转录水平采用的频率是很低的, 往往只有少部分的受体细胞获得 Trizol法[9]提取转基因植株的总RNA; 琼脂糖凝胶电外源DNA 因此, 在对受体植物进行相应的基因转泳分析总RNA的提取质量, 并采用紫外分光光度计化处理之后, 就必须利用标记基因(marker gene)或对RNA样品进行D60/80的检测 RT-PCR方法依照采者报告基因(reporter gene)对其进行筛选和鉴定常用经典步骤[0]对外源基因gfp的表达进行检测 (5) 用的报告基因主要有β-葡萄糖醛酸乙酰转移酶基因基因组水平(Southern杂交检测)检测外源基因转入 (β-glucuronidase, gus) 胭脂碱合成酶基因(nopaline 拷贝数植物基因组提取方法同()所述步骤植物 synthase gene, nos) 荧光素酶基因(luciferase gene, Southern杂交实验操作步骤详见文献[-] luc)和绿色荧光蛋白基因(gfp)等由于gfp荧光较.6. 为稳定, 较抗光漂白, 在植物中能够稳定存在, 在近加强和巩固已学实验内容, 让学生综合实验学过的年来被广泛利用, 能够代替gus起到监测基因表达和内容, 设置课后作业自主设计综合实验, 题目为 [6] 学生自主综合实验方案设计为了进一步将某特定基因[如小麦抗倒伏基因咖啡酸甲基转移 [7] 高分辨蛋白定位的作用列举几种不同的植物转基因方法及其筛选鉴 [5-7,5] 酶基因(COMT)]转入某模式植物中(如拟南芥) 的实抗性筛选验, 目的是对学生已经学过的实验方法进行巩固和 (如潮霉素) 表型直接观察(蛋白水平: gfp是否有荧综合, 锻炼学生实验设计的水平和对已学知识的应光)标记基因的表达基因组水平(以基因组为模版用能力设计实验只写设计报告并不实施实验, 以 PCR是否有特异条带) 转录水平(RT-PCR是否有特小组汇报的形式进行考查异条带) 基因组水平鉴定外源基因拷贝数(Southern.7 实验中需要注意的部分问题.7. 叶盘法实验农杆菌对外植体生长的抑制作用很强, 建议控制农杆菌菌液在0.<D600<0.的时候进行浸染; 剪取叶片时, 带有较粗叶脉的外植体在共培养后易以叶脉为轴翘起, 翘起的部分叶片由于定方法参考要点见本文引言部分杂交检测)等.6 实验步骤实验总体包括三个阶段(图).6. 转基因植株的获得文献[]描述了转基因

教学研究 98 没有接触到MS固体培养基而很难生长出愈伤组织, 要进行严格的除RNase处理另外, 在选材时应当尽故建议在剪取外植体的过程当中, 除了要避免叶片量选择新鲜幼嫩的组织, 研磨之前研钵要预冷, 研磨边缘之外, 还应当尽量避免主脉和较粗的叶脉组织时动作要快速, 并在组织粉末化冻前加入Trizol.7.

6 基因组水平鉴定实验注射, 阻力较小, 且菌液浸入并扩散的面积大提取植物基因组的DNA, 所需的试剂和操作步骤都.7.

6 教学研究 98 没有接触到MS固体培养基而很难生长出愈伤组织, 要进行严格的除RNase处理另外, 在选材时应当尽故建议在剪取外植体的过程当中, 除了要避免叶片量选择新鲜幼嫩的组织, 研磨之前研钵要预冷, 研磨边缘之外, 还应当尽量避免主脉和较粗的叶脉组织时动作要快速, 并在组织粉末化冻前加入Trizol.7. 试剂, 转移粉末用的钥匙和盛放粉末的小指管都要注射法实验将菌液在叶片背面的主脉注射时, 阻力较大, 菌液易从针口溢出, 菌液在叶背面在液氮中遇冷扩散的现象不明显建议选择稍大叶片背面的侧脉.7.6 基因组水平鉴定实验注射, 阻力较小, 且菌液浸入并扩散的面积大提取植物基因组的DNA, 所需的试剂和操作步骤都.7. 浸花法实验由于silwet-77以及农杆菌对拟比较简单, 但是由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤南芥花有较强的伤害作用, 因此, 浸花时间应控制在其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响, 在抽 5~0 s之间, 在浸花后要将植株放倒进行避光处理提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙.7. 表型直接观察(蛋白水平) 醇)以降低这些酶类的活性在实验组外植体采用经典的CTAB法培养~周, 愈伤组织生长较大且质地相对疏松的时候, 即可直接夹取愈伤组织在荧光显微镜下观察, 操作比较简单建议穿插在实验课中进行, 亦可以在时间完成.7.5 转录水平鉴定试验植物组织RNA的提取操作比较繁杂, 而且操作过程当中如有不当很容易造成RNA的降解首先, 所有用于提取RNA的器具 A B 实验结果(部分). 转基因植株的获得通过潮霉素抗性筛选的方法逐步筛选获得gfp 转基因烟草植株(叶盘法, 图), 用于后续不同层次水平的鉴定. 随机选取对照组的烟草愈伤组织和实验组 (潮霉素筛选阳性)的烟草愈伤组织分离小块置于荧光显微镜下观察在蓝光激发下, 筛选阳性的愈伤组织呈现明亮的绿色荧光(图A A B C D C D A: 培养7 d; B: 培养 d; C: 培养5 d; D: 培养9 d A: screening culture for 7 days; B: screening culture for days; C: screening culture for 5 days; D: screening culture for 9 days. 图叶盘法转化烟草植株培养外植体 Fig. The explants from transgenic tobacco via leaf disc A: 潮霉素筛选为阳性烟草愈伤组织在可见光下; B: 潮霉素筛选为阳性烟草愈伤组织在蓝色荧光激发下; C: 对照组烟草愈伤组织在可见光下; D: 对照组烟草愈伤组织在蓝色荧光激发下 A: positive tobacco callus under visible light; B: positive tobacco callus under blue ﬂuorescence; C: control tobacco callus under visible light; D: control tobacco callus under blue ﬂuorescence. 图蛋白水平表型直接观察的实验结果(50 ) Fig. Results of direct phenotype observation on protein expression level (50 )

99 宋宏涛等: 植物转基因技术在高校本科生实验课程中的应用及方案设计 A 500 bp位置处出现了明显的pcr条带, 而对照组在相 B 应的位置没有出现条带(图5A), 可见gfp基因成功转入实验组烟草中并获得了表达利用提取的实验组基因组DNA和对照组基因组DNA进行PCR检测图5B为扩增gfp基因(采用了大小为508 bp片段的一对引物和gfp全长的引物), 实

Gfp expression in transgenic tobacco leaf via injection (00 ) 和图B), 而对照组的愈伤组织则呈红色(图C和图 D).

PCR检测呈阳性的转基因烟草基因组(箭头所指为gfp杂交条带); ck: 对照组烟草基因组; ac: 含有T-DNA载体pCAMBIA00质粒(箭头所指为gfp杂交条带) : positive transgenic tobacco (array is the gfp hybridization bands); ck: control tobacco; ac: T-DNA vector

7 99 宋宏涛等: 植物转基因技术在高校本科生实验课程中的应用及方案设计 A 500 bp位置处出现了明显的pcr条带, 而对照组在相 B 应的位置没有出现条带(图5A), 可见gfp基因成功转入实验组烟草中并获得了表达利用提取的实验组基因组DNA和对照组基因组DNA进行PCR检测图5B为扩增gfp基因(采用了大小为508 bp片段的一对引物和gfp全长的引物), 实验组PCR产物在约500 bp位置处出现了明显的pcr A: 可见光下; B:蓝色荧光激发下 A: under visible light; B: under blue ﬂuorescence. ck ac 图注射法转染后gfp基因在叶片细胞中表达情况(00 ) Fig. Gfp expression in transgenic tobacco leaf via injection (00 ) 和图B), 而对照组的愈伤组织则呈红色(图C和图 D). 注射法进行外源基因的瞬时表达实验含有T-DNA载体pCAMBIA00的农杆菌EHA05 经 YEB扩大培养及预培养液 A培养后, 由含有 MES 和AS的MS液体基本培养基重悬, 继而注射到烟草叶片背面 d后发现, 有菌液浸入的叶片发黄褐色, 轻轻撕取菌液浸没部位的叶背面表皮, 置于荧光显微镜下观察, 发现有部分细胞在蓝光激发下呈现绿色荧光(图), 表明gfp基因在这些细胞中瞬时表达 : PCR检测呈阳性的转基因烟草基因组(箭头所指为gfp杂交条带); ck: 对照组烟草基因组; ac: 含有T-DNA载体pCAMBIA00质粒(箭头所指为gfp杂交条带) : positive transgenic tobacco (array is the gfp hybridization bands); ck: control tobacco; ac: T-DNA vector pcambia00 plasmid (array is the gfp hybridization bands).. 转基因植株的鉴定(基因组水平和转录水平) 用Trizol试剂微量提取实验组和对照组烟草愈伤组织的RNA, 进行RT-PCR, 实验组PCR产物在约 (A) bp M ck ck (B) 图6 转基因烟草的Southern blot杂交结果 Fig.6 Southern blot results for transgenic tobacco M ck ck 7 8 bp A: 转基因烟草转录水平RT-PCR检测; M: DL000标准相对分子质量Marker; : 转基因烟草的RNA进行的508 bp gfp基因的rt-pcr扩增; : 使用内参引物对转基因烟草的actin(EU98079.)进行的RT-PCR扩增; ck: 对照组烟草的RNA进行的508 bp gfp基因的rt-pcr扩增; ck: 使用内参引物对对照组烟草actin(EU98079.)进行的RT-PCR扩增 B: 基因组水平对转基因烟草的PCR检测(508 bp gfp和全长gfp); M: DL000标准相对分子质量Marker; : 均为转基因烟草的基因组进行的508 bp gfp的pcr扩增; : 为转基因烟草的基因组进行的全长gfp的PCR扩增; ck ck: 为对照组烟草的基因组进行的508 bp gfp和全长gfp基因的pcr扩增; 7 8: 为含有T-DNA载体pCAMBIA00质粒进行的508 bp gfp和全长gfp基因的PCR扩增 A: RT-PCR results; M: DL000 marker; : transgenic tobacco results (product length: 508 bp); : internal reference gene actin RT-PCR results for transgenic tobacco; ck: gfp RT-PCR for control tobacco results (product length: 508 bp); ck: internal reference gene actin RT-PCR results for control tobacco. B: PCR identification on genome level (508 bp and full length products); M: DL000 marker;,: PCR results for transgenic tobacco (508 bp product);,: PCR results for transgenic tobacco (full length product); ck,ck: separately, PCR results (508 bp and full length products) for control tobacco; 7,8: separately, PCR results (508 bp and full length products) for T-DNA vector pcambia00 plasmid. 图5 转录水平及基因组水平鉴定外源gfp基因 Fig.5 Gfp expression identiﬁcation on transcription and genome levels

8 00 教学研究条带对照组没有相应的条带, 初步证明 gfp 基因已整合到烟草基因组中将 PCR 呈阳性的烟草愈伤组织基因组 DNA 进行 Southern 杂交分析, 结果显示, PCR 扩增呈阳性的烟草基因组 DNA 可与 gfp 的探针产生杂交信号, 而对照组烟草无杂交信号, 如图 6 所示可见, 分子杂交鉴定 gfp 基因转入烟草基因组, 根据结果推断外源基因插入为单拷贝讨论从三种转基因实验方法的结果来看, 叶盘法由于需要不断地传代培养实验周期较长, 但是转化稳定, 且可以得到转基因植株, 学生对于叶盘法实验结果成功率较高印象深刻注射法相对来说操作简单且周期短 (~ d 内 ), 可以观察到 gfp 基因在叶片细胞内的瞬时表达效果, 转化成功率高, 不足之处在于无法稳定转化, 无法获得转基因植株浸花法采用拟南芥植株为实验材料, 实验周期较长可以实现稳定转化从而获得转基因植株, 同时也可以让学生了解拟南芥这一模式生物的培养过程从目前的实验结果看, 不足之处在于实验操作较为复杂难度大转化成功率较低本实验课程设置在参考国内外关于植物转基因技术的相关文献的基础上, 结合我院多年来本科生实验教学的情况, 确定了转基因技术在植物中的应用的实验课程内容, 其中涉及到植物组织培养技术三种转基因方法的实施 PCR 技术 Southern 杂交技术 DNA 凝胶电泳技术等多项基本的科研技能 ; 同时, 整个实验的内容具有较强的整体性, 内容衔接紧密, 从转基因植物获得初步抗性筛选基本表型筛选, 到后来的分子水平最终确定外源基因转化成功, 分别从蛋白质水平转录水平和基因组水平对其进行检测和鉴定, 有助于学生科研思路的训练 ; 在转基因植物的获得中, 采用了三种不同的转基因方法对烟草和拟南芥的不同组织部位分别进行基因转化, 有利于学生深入地了解转基因技术, 开拓视野在实验课程的最后阶段, 让学生独立进行实验设计, 巩固并应用已学的实验方法, 符合励耘理科实验班中培养学生设计实验的能力的目标本实验课程适合在拔尖学生实验班或高年级本科生中开设, 从前期的预实验结果及在北京师范大学生命科学学院实施年 (00 级 ~0 级励耘理科实验班生物方向 ) 的实际效果来看, 实验结果明显学生反应良好建议安排在学生已经修完分子生物学实验和植物细胞工程相关理论课程后开设特别感谢 009 届本科生聂频文同学在本实验方案设置过程中的辛勤付出, 提供了文中很多的预实验结果及图片参考文献 (References) 国家中长期教育改革和发展规划纲要工作小组办公室. 国家中长期教育改革和发展规划纲要 (00 00 年 ). 人民日报 (National middle and long term education reform and development plan outline working group office. National medium-and long-term plan for education reform and development (00 00). People s Daily), 中组部要讯. 大学生优选计划以特殊措施培养特优学生. 党建研究 (Zhongzubu Yaoxun. Preferred College Students project is used to train students with special measures. Dangjian Yanjiu) 0; 8: 0. 李万杰, 宋宏涛, 向本琼. 励耘拔尖学生生物学综合实验的课程设置与探讨. 高等生物学教学研究 ( 电子版 )(Li Wanjie, Song Hongtao, Xiang Benqiong. Design and discussion of biology comprehensive experiment for Liyun top innovative talent classes. Biology Teaching in University, Electronic Edition) 0; (): -. 宋卫平, 耿明华. 中国高校生物实验教学体系与模式探讨. 实验技术与管理 (Song Weiping, Geng Minghua. Exploration on the university experimental teaching system and mode of biology in China. Experimental Technology and Management) 009; 6(6): Draper J, Davey MR, Freeman JP, Cocking EC, Cox BJ. Ti plasmid homologous sequences present in tissues from Agrobacterium plasmid-transformed petunia protoplasts. Plant and Cell Physiology 98; (): Herrera-Estrella L, van den Broeck G, Maenhaut R, van Montagu M, Schell J, Timko M, et al. Light-inducible and chloroplast-associated expression of a chimaeric gene introduced into Nicotiana tabacum using a Ti plasmid vector. Nature 98; 0(597): 高俊山, 林毅, 叶兴国, 马传喜. 植物转基因技术和方法概述. 安徽农业科学 (Gao Junshan, Lin Yi, Ye Xingguo, Ma Chuanxi. Summary of the techniques and methods of plant gene transformation. Journal of Anhui Agricultural Sciences) 00; (5): 叶健明, 唐克轩, 沈大棱. 植物转基因方法概述. 生命科学 (Ye Jianming, Tang Kexuan, Shen Daleng. The methods for transferring genes into plants. Chinese Bulletin of Life Sciences) 999; (): 王丽, 司怀军, 张俊莲. 植物基因工程实践教学改革探索与实践. 高教论坛 (Wang Li, Si Huaijun, Zhang Junlian. Exploration and practice of practical teaching reform in plant genetic engineering. Higher Education Forum) 0; (): 林晓飞, 征荣, 莫日根. 本科植物细胞与基因工程研究型实验课程的构建与实践. 遗传 (Lin Xiaofei, Zheng Rong, Mo Rigen. Research-oriented experimental course of plant cell and gene engineering for undergraduates. Hereditas) 05; 7(): 0-6.

9 宋宏涛等 : 植物转基因技术在高校本科生实验课程中的应用及方案设计 0 Horsch RB. A simple and general method for transferring genes into plants. Science 985; 7(69): 9-. 黎茵, 张已顺. 农杆菌注射渗透法转化烟草实验研究. 实验技术与管理 (Li Yin, Zhang Yishun. Study on agrobacterium tumefaciens-mediated transient transformation of tobacco by infiltration. Experimental Technology and Management) 00; 7(): 50-. Steven JC, Andrew FB. Floral dip: A simplified method for agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana. Plant J 998; 6(6): 75-. Shimonmra O, Johnson FH, Saiga Y. Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, Aequorea. J Cell Comp Physiol 96; 59: Byebier BF, Deboeck F, Greve HD, Montagu MV, Hernalsteens JP. T-DNA organization in tumor cultures and transgenic plants of the monocotyledon Asparagus officinalis. Proc Natl Acad Sci USA 987; 8(5): 马三梅, 王永飞. 标记基因和报告基因的辨析. 农业与技术 (Ma Sanmei, Wang Yongfei. The difference of marker gene and reporter gene. Agriculture & Technology) 005; 5(): Jim H, Brad A. GFP in plants. Trends Genet 995; (8): 曾庆平, 李保健. 叶盘共培养法介导的基因转移与两种转基因植物的鉴定. 中山大学学报论丛 (Zeng Qingping, Li Baojian. Leaf-disc coculture mediated gene transfer and the expression and identification of foreign genes in transgenic plants. Supplement to the Acta Scientiarum Naturalium Universitatis Sunyatseni) 989; 8(): 丁福章, 李继新, 袁有波, 雷波. 烟草不同组织总 RNA 的提取方法初探. 中国农学通报 (Ding Fuzhang, Li Jixin, Yuan Youbo, Lei Bo. Effectve isolation of total RNA from tobacco tissues. Chinese Agricultural Science Bulletin) 007; (): 鲁燕, 徐兆师, 张瑞越, 刘丽, 李连成, 陈明, 等. W6 基因的过表达提高转基因烟草的耐盐性. 作物学报 (Lu Yan, Xu Zhaoshi, Zhang Ruiyue, Liu Li, Li Liancheng, Chen Ming, et al. Overexpression of W6 gene increases salt tolerance in transgenic tobacco plants. Acta Agronomica Sinica) 008; (6): 向本琼. 现代生物学实验技术指导. 北京 : 北京师范大学出版社 (Xiang Benqiong. Xiandai Shengwuxue Shiyan Zhidao. Beijing: Beijing Normal University Publication Group) 009, -9. Southern EM. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. J Mol Biol 975; 98(): 杨维才. 植物转基因技术回顾与前瞻. 植物学报 (Yang Weicai. Plant transgenic technology: Past and current development. Chinese Bulletin of Botany) 0; 8(): 6-9. 吴英杰, 姜波, 张岩, 李彦邦, 贺琳, 王玉成. 农杆菌介导的烟草瞬时表达试验条件优化. 东北林业大学学报 (Wu Yingjie, Jiang Bo, Zhang Yan, Li Yanbang, Wang Yucheng. Transient expression in tobacco by agrobacterium-mediated transformation. Journal of Northeast Forest University) 00; 8(9): 罗熹, 王涛, 卢彪. 植物体瞬时表达 ChlFN-γ 蛋白研究. 广东农业科学 (Luo Xi, Wang Tao, Lu Biao. Analysis of transient expression in plants by ChIFN-γ. Guangdong Nongye Kexue) 0; : 党智笙, 肖成斌, 马燕林, 马建忠. 农杆菌介导的浸花法 (Floral-dip) 存在的问题及对策. 中国食品工业 (Dang Zhisheng, Xiao Chengbin, Ma Yanlin, Ma Jianzhong. The problems and countermeasures of floral-dip by agrobacterium-mediated. Food and Beverage Industry) 0; 6: 陈昆松, 李方, 许昌杰, 张上隆, 傅承新. 改良 CTAB 法用于多年生植物组织基因组 DNA 的大量提取. 遗传 (Chen Kunsong, Li Fang, Xu Changjie, Zhang Shanglong, Fu Chengxin. An efficient macro-method of genomic DNA isolation from actinidia chinensis leaves. Hereditas) 00; 6(): 59-.

材料方法载体构建转基因植株的获得

材料方法载体构建转基因植株的获得生物技术通报唐宏琨曾洪梅杨秀芬邱德文通过根癌农杆菌介导转化法将含有激发子基因的植物表达载体转化三生烟获得了转基因烟草植株用检测确认了阳性转化株用杂交和杂交进一步证实了基因的整合转录和表达对代转基因阳性株进行接种试验结果显示与非转基因对照相比表达的烟草叶片枯斑数量减少表明蛋白激发子基因的表达提高了转基因烟草对的抗性激发子基因烟草转化材料