第 11 期 王玉君, 等 :mir 582 5p 靶向调控 AKT3 对甲状腺乳头状癌细胞增殖和凋亡的影响 955 EfectofmiR 582 5ptargetingAKT3onproliferationandapoptosisofpapilarythyroidcarcinoma cels WA

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1 954 第 35 卷第 11 期 2018 年 11 月 新乡医学院学报 JournalofXinxiangMedicalUniversity Vol.35 No.11 Nov.2018 欁欁 本文引用 : 王玉君, 林秀艳, 王涛.miR 582 5p 靶向调控 AKT3 对甲状腺乳头状癌细胞增殖和凋亡的影响 [J]. 新乡医学院学报,2018,35(11): DOI: /xxyxyxb mir 582 5p 靶向调控 AKT3 对甲状腺乳头状癌细胞增殖和凋亡的影响 王玉君 1, 林秀艳 1 2, 王涛 (1. 海南省肿瘤医院核医学科, 海南 海口 ;2. 齐齐哈尔医学院医药科学研究院, 黑龙江 齐齐哈尔 ) 欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁 基础研究 摘要 : 目的探讨 mir 582 5p 在人甲状腺乳头状癌 (PTC) 组织中的表达及其靶向调控 AKT3 对 PTC 细胞增殖和凋亡的影响 方法选取 2017 年 1 月至 2017 年 10 月海南省肿瘤医院手术切除的 PTC 组织及癌旁组织 ( 距离肿瘤边缘 1~2cm) 标本各 10 例, 采用实时定量聚合酶链反应 (PCR) 检测 PTC 组织和癌旁组织中 mir 582 5p 表达 ; 培养人 PTCK1 细胞, 待细胞生长融合度达到 50% ~60% 时分为 mir 582 5pmimics 组 mir 582 5p 反义 mirna 寡核苷酸 (AMO) 组 mimics 对照组和 AMO 对照组, 进行细胞转染 ; 细胞转染后, 采用实时荧光定量 PCR 检测 4 组 K1 细胞中 mir 582 5p 表达, 四甲基偶氮唑盐法检测 4 组 K1 细胞活性, 平板克隆形成实验检测 4 组 K1 细胞克隆能力, 锥虫蓝染色检测 4 组 K1 细胞存活率, 末端脱氧核苷酰基转移酶介导性 dutp 切口末端标记法检测 4 组 K1 细胞凋亡情况, Westernblot 法检测 4 组 K1 细胞中 mir 582 5p 靶基因 AKT3 蛋白表达 结果 PTC 组织和癌旁组织中 mir 582 5p 相对表达量分别为 0.372± ±0.083,PTC 组织中 mir 582 5p 相对表达量显著低于癌旁组织 (P<0.05) mir 582 5pmimics 组 mimics 对照组 AMO 对照组和 mir 582 5pAMO 组 K1 细胞中 mir 582 5p 相对表达量分别为 ± ± ± ±0.145;miR 582 5pmimics 组 K1 细胞中 mir 582 5p 相对表达量显著高于 mimics 对照组 mir 582 5pAMO 组和 AMO 对照组 (P<0.05),miR 582 5pAMO 组 K1 细胞中 mir 582 5p 相对表达量显著低于 AMO 对照组和 mimics 对照组 (P<0.05),mimics 对照组与 AMO 对照组 K1 细胞中 mir 582 5p 相对表达量比较差异无统计学意义 (P>0.05) 细胞培养 0h 时 4 组 K1 细胞活性比较差异无统计学意义 (P>0.05) 细胞培养 h 时,miR 582 5pmimics 组 K1 细胞活性显著低于 mir 582 5pAMO 组 mimics 对照组和 AMO 对照组 (P<0.05),miR 582 5pAMO 组 K1 细胞活性显著高于 mimics 对照组和 AMO 对照组 (P<0.05),mimics 对照组与 AMO 对照组 K1 细胞活性比较差异无统计学意义 (P>0.05) mimics 对照组 mir 582 5pmimics 组 AMO 对照组 mir 582 5pAMO 组 K1 细胞克隆数量分别为 18.47± ± ± ±7.74;miR 582 5p mimics 组 K1 细胞克隆数量显著少于 mimics 对照组 AMO 对照组和 mir 582 5pAMO 组 (P<0.05),miR 582 5pAMO 组 K1 细胞克隆数量显著多于 AMO 对照组和 mimics 对照组 (P<0.05),mimics 对照组与 AMO 对照组 K1 细胞克隆数量比较差异无统计学意义 (P>0.05) mimics 对照组 mir 582 5pmimics 组 AMO 对照组和 mir 582 5pAMO 组 K1 细胞存活率分别为 (76.46±13.53)% (42.64±10.85)% (77.82±10.35)% (83.63±13.53)%;miR 582 5pmimics 组 K1 细胞存活率显著低于 mimics 对照组 AMO 对照组和 mir 582 5pAMO 组 (P<0.05),miR 582 5pAMO 组 K1 细胞存活率显著高于 AMO 对照组和 mimics 对照组 (P<0.05);mimics 对照组与 AMO 对照组 K1 细胞存活率比较差异无统计学意义 (P>0.05) mimics 对照组 mir 582 5pmimics 组 AMO 对照组和 mir 582 5pAMO 组 K1 细胞凋亡率分别为 (23.35±9.64)% (42.63±13.38)% (22.85±9.74)% (10.84±3.64)%;miR 582 5pmimics 组 K1 细胞凋亡率显著高于 mimics 对照组 AMO 对照组和 mir 582 5pAMO 组 (P<0.05),miR 582 5pAMO 组细胞凋亡率显著低于 AMO 对照组和 mimics 对照组 (P<0.05),mimics 对照组与 AMO 对照组 K1 细胞凋亡率比较差异无统计学意义 (P>0.05) mimics 对照组 mir 582 5pmimics 组 AMO 对照组和 mir 582 5pAMO 组 K1 细胞中 AKT3 蛋白相对表达量分别为 1.000± ± ± ±0.141;miR 582 5pmimics 组 K1 细胞中 AKT3 蛋白相对表达量显著低于 mimics 对照组 AMO 对照组和 mir 582 5pAMO 组 (P<0.05),miR 582 5pAMO 组 K1 细胞 AKT3 蛋白相对表达量显著高于 AMO 对照组和 mimics 对照组 (P<0.05),mimics 对照组与 AMO 对照组 K1 细胞 AKT3 蛋白相对表达量比较差异无统计学意义 (P>0.05) 结论 mir 582 5p 在 PTC 组织中表达下调 ;mir 582 5p 可通过靶向调控 AKT3 的表达而抑制人 PTC 细胞的增殖, 并促进其凋亡 关键词 : mir 582 5p; 甲状腺乳头状癌 ; 细胞增殖 ; 细胞凋亡 ;AKT3 中图分类号 :R736.1 文献标志码 :A 文章编号 : (2018) DOI: /xxyxyxb 收稿日期 : 基金项目 : 海南省医药卫生科研项目 ( 编号 :18A200089) 作者简介 : 王玉君 (1979-), 男, 黑龙江勃利人, 硕士, 主治医师, 研究方向 : 肿瘤阳性显像及核素治疗

2 第 11 期 王玉君, 等 :mir 582 5p 靶向调控 AKT3 对甲状腺乳头状癌细胞增殖和凋亡的影响 955 EfectofmiR 582 5ptargetingAKT3onproliferationandapoptosisofpapilarythyroidcarcinoma cels WANGYu jun 1,LINXiu yan 1,WANGTao 2 (1.DepartmentofNuclearMedicine,HainanCancerHospital,Haikou570311,HainanProvince,China;2.AcademyofMedical Sciences,QiqiharMedicalUniversity,Qiqihar161006,HeilongjiangProvince,China) Abstract: Objective ToinvestigatetheexpresionofmiR 582 5pinhumanpapilarythyroidcarcinoma(PTC)and theefectofmir 582 5ptargetingAKT3ontheproliferationandapoptosisofPTCcels.Methods TenPTCtisuespecimens andtenparacanceroustisuespecimens(1 2cmawayfromtheedgeofthetumor)werecolectedinHainanCancerHospital fromjanuary2017tooctober2017.theexpresionofmir 582 5pinPTCandparacanceroustisueswasdetectedbyreal time quantitativepolymerasechainreaction(pcr).humanptck1celswereculturedanddividedintomir 582 5pmimics group,mir 582 5panti mirnaoligonucleotide(amo)group,mimicscontrolgroupandamocontrolgroupwhenthecelfu sionratereached50% -60%.Afterceltransfection,theexpresionofmiR 582 5pinK1celsofthefourgroupswasdetected byreal timefluorescencequantitativepcr,theactivityofk1celswasdetectedbymethylthiazolyltetrazolium method,the colonyformationabilityofk1celswasdetectedbyflatplatecloneformationtest.thesurvivalrateofk1celswasdetectedby trypanosomabluestaining,theapoptosisofk1celswasdetectedbyterminaldeoxynucleotidyltransferase mediateddutpnick endlabelingmethod,andtheexpresionofmir 582 5ptargetgeneAKT3proteinofK1celswasdetectedbywesternblot method.results TherelativeexpresionofmiR 582 5pinPTCtisuesandparacanceroustisueswas0.372±0.237and 1 010±0.083,respectively.TherelativeexpresionofmiR 582 5pinPTCtisueswassignificantlylowerthanthatinthepara canceroustisues(p<0.05).therelativeexpresionofmir 582 5pinK1celsofmiR 582 5pmimicsgroup,mimicscontrol group,amocontrolgroupandmir 582 5pAMOgroupwas14.143±2.318,1.063±0.214,1.041±0.372and0.435± 0 145,respectively.TherelativeexpresionofmiR 582 5pinK1celsofmiR 582 5pmimicsgroupwassignificantlyhigher thanthatinthemimicscontrolgroup,mir 582 5pAMOgroupandAMOcontrolgroup(P<0.05).Therelativeexpresionof mir 582 5pinK1celsofthemiR 582 5pAMOgroupwassignificantlylowerthanthatintheAMOcontrolgroupandmimics controlgroup(p<0.05).therewasnosignificantdiferenceintherelativeexpresionofmir 582 5pbetweenthemimics controlgroupandamocontrolgroup(p>0.05).therewasnosignificantdiferenceintheactivityofk1celsbetweenthe fourgroupswhenthek1celswereculturedfor0hour(p>0.05).whenthek1celswereculturedfor12,24,36,and48 hours,theactivityofk1celsinthemir 582 5pmimicsgroupwassignificantlylowerthanthatinthemiR 582 5pAMO group,mimicscontrolgroupandamocontrolgroup(p<0.05);theactivityofk1celsinthemir 582 5pAMOgroupwas significantlyhigherthanthatinthemimicscontrolgroupandamocontrolgroup(p<0.05);therewasnosignificantdifer enceintheactivityofk1celsbetweenthemimicscontrolgroupandamocontrolgroup(p>0.05).thenumberofk1cel clonesinthemimicscontrolgroup,mir 582 5pmimicsgroup,AMOcontrolgroupandmiR 582 5pAMOgroupwas18.47± 5.25,5.10±4.97,19.53±6.45and32.63±7.74,respectively.ThenumberofK1celclonesinthemiR 582 5pmimics groupwassignificantlylesthanthatinthemimicscontrolgroup,amocontrolgroupandmir 582 5pAMO group(p< 0 05).ThenumberofK1celclonesinthemiR 582 5pAMOgroupwassignificantlyhigherthanthatintheAMOcontrol groupandmimicscontrolgroup(p<0.05).therewasnosignificantdiferenceinthenumberofk1celclonesbetweenthe mimicscontrolgroupandamocontrolgroup(p>0.05).thesurvivalrateofk1celsinthemimicscontrolgroup,mir 582 5pmimicsgroup,AMOcontrolgroupandmiR 582 5pAMOgroupwas(76.46±13.53)%,(42.64±10.85)%,(77.82± 10.35)% and(83.63±13.53)%,respectively.thesurvivalrateofk1celsinthemir 582 5pmimicsgroupwassignifi cantlylowerthanthatinthemimicscontrolgroup,amocontrolgroupandmir 582 5pAMOgroup(P<0.05).Thesurvival rateofk1celsinthemir 582 5pAMOgroupwassignificantlyhigherthanthatintheAMOcontrolgroupandmimicscontrol group(p<0.05).therewasnosignificantdiferenceinthesurvivalrateofk1celsbetweenthemimicscontrolgroupand AMOcontrolgroup(P>0.05).TheapoptosisrateofK1celsinthemimicscontrolgroup,miR 582 5pmimicsgroup,AMO controlgroupandmir 582 5pAMOgroupwas(23.35±9.64)%,(42.63±13.38)%,(22.85±9.74)% and(10.84± 3 64)%,respectively.TheapoptosisrateofK1celsinthemiR 582 5pmimicsgroupwassignificantlyhigherthanthatinthe mimicscontrolgroup,amocontrolgroupandmir 582 5pAMOgroup(P<0.05).TheapoptosisrateofmiR 582 5pAMO groupwassignificantlylowerthanthatintheamocontrolgroupandmimicscontrolgroup(p<0.05).therewasnosignifi cantdiferenceintheapoptosisrateofk1celsbetweenthemimicscontrolgroupandamocontrolgroup(p>0.05).therel ativeexpresionofakt3proteinink1celsofthemimicscontrolgroup,mir 582 5pmimicsgroup,AMOcontrolgroupand mir 582 5pAMOgroupwas1.000±0.005,0.531±0.162,1.010±0.071and1.432±0.141,respectively.Therelativeex presionofakt3proteinink1celsofthemir 582 5pmimicsgroupwassignificantlylowerthanthatinthemimicscontrol

3 956 新乡医学院学报 htp:// 年第 35 卷 group,amocontrolgroupandmir 582 5pAMOgroup(P<0.05).TherelativeexpresionofAKT3proteininK1celsofthe mir 582 5pAMOgroupwassignificantlyhigherthanthatintheAMO controlgroupandthemimicscontrolgroup(p< 0 05).TherewasnosignificantdiferenceintherelativeexpresionofAKT3proteinbetweenthemimicscontrolgroupand AMOcontrolgroup(P>0.05).Conclusion TheexpresionofmiR 582 5p sdown regulatedinptctisues.mir 582 5p caninhibittheproliferationofhumanptccelsandpromoteitsapoptosisthroughtargetingakt3expresion. Keywords: mir 582 5p;papilarythyroidcarcinoma;celproliferation;apoptosis;AKT3 甲状腺癌是常见的内分泌系统肿瘤, 其发病率较高, 约占恶性肿瘤的 1.5% 甲状腺癌按照组织形态学可分为乳头状癌 滤泡状癌 髓样癌和未分化癌 [1 2] 甲状腺乳头状癌(papilarythyroidcarcino ma,ptc) 占甲状腺癌的 60% ~80%, 年龄分布较广, 且呈现年轻化趋势 [3 4] PTC 常出现淋巴结转移现象, 属于分化型甲状腺癌, 分化程度较高 [5] PTC 起病隐匿, 不易被发现, 但是, 相对于未分化甲状腺癌,PTC 预后较好 [6 7] 目前,PTC 的治疗主要包括手术切除和碘 131(131I) 治疗 [8 9] PTC 对化学治疗药物不敏感, 临床缺乏有效的化学治疗药物 [10 11] 微小 RNA(microRNA,miRNA 或 mir) 是一种存在于真核生物中的非编码 RNA, 约由 20~25 个核苷酸组成, 具有多种生物学功能 [12] 研究表明,miRNA 参与胃癌 骨肉瘤 肺癌 膀胱癌 胰腺癌 唾液腺样囊癌及结肠癌等多种肿瘤的发生和发展 [13 20] 本研究旨在探讨 mir 582 5p 在人 PTC 组织中的表达及其靶向调控 AKT3 对 PTC 细胞增殖和凋亡的影响, 以期为 PTC 的诊断和治疗提供新的靶点 1 材料与方法 1.1 标本来源选取 2017 年 1 月至 2017 年 10 月海南省肿瘤医院甲状腺外科手术切除的 PTC 组织及癌旁组织 ( 距离肿瘤边缘 1~2cm) 标本各 10 例, 男 4 例, 女 6 例, 年龄 20~50(29.7±7.6) 岁 所有患者术前未接受放射治疗和化学治疗, 术后经病理学检查确诊 组织标本经甲醛固定, 石蜡包埋保存 本研究通过医院医学伦理委员会批准, 所有患者签署知情同意书, 自愿参与本研究 1.2 细胞 试剂与仪器人 PTCK1 细胞 ( 广州吉妮欧生物科技有限公司 ), 高糖达尔伯克改良伊格尔培养基 (Dulbecco smodifiedeagle smedium, DMEM) 胎牛血清 (fetalbovineserum,fbs) 无血清 Opti 培养基 ( 美国 Hyclone 公司 ), 胰蛋白酶 ( 美国 Sigma 公司 ), 青霉素 链霉素混合液 ( 双抗 ) 磷酸盐缓冲液 (phosphatebuferedsaline,pbs) 四甲基偶氮 唑盐 (methylthiazolyltetrazolium,mtt) 试剂盒 二喹啉甲酸 (bicinchoninicacid,bca) 蛋白定量试剂盒 ( 上海碧云天生物技术有限公司 ), 末端脱氧核苷酰基转移酶介导性 dutp 切口末端标记 (terminalde oxynucleotidyltransferase mediateddutpnickendla beling,tunel) 试剂盒 ( 德国 Roche 公司 ), 转染试剂 Lipofectamine2000( 美国 SantaCruz 公司 ), 40g L -1 多聚甲醛 ( 北京索莱宝科技有限公司 ), TRIzol 试剂 细胞培养箱 Nanodrop 仪 ( 美国 Thermo 公司 ),RNA 提取试剂盒 ( 北京天根生化科技有限公司 ), 聚合酶链反应 (polymerasechainreaction,pcr) 试剂盒 反转录试剂盒 ( 南京诺唯赞生物科技有限公司 ), 细胞培养板 ( 美国 Corning 公司 ),RIPA 细胞裂解液 ( 北京百泰克生物科技有限公司 ),AKT3 抗体 β actin 抗体 ( 美国 Abcam 公司 ),mir 582 5p mimics(mir 582 5p 类似物 ) mir 582 5p 抑制剂 mir 582 5p 反义 mirna 寡核苷酸 (anti mirnaoli gonucleotide,amo) 及阴性对照物序列引物等均由上海吉玛生物科技有限公司设计并合成, 低温高速离心机 ( 湖南恒诺医用设备有限公司 ), 酶标仪 ( 德国 Tecan 公司 ), 显微镜 ( 日本 Nikon 公司 ), 细胞计数仪 ( 上海睿钰生物科技有限公司 ) 1.3 方法 实时荧光定量 PCR 检测 PTC 组织和癌旁组织中 mir 582 5p 表达应用 TRIzol 试剂盒提取组织总 RNA, 并检测总 RNA 纯度 将总 RNA 反转录为 cdna, 以 cdna 为模板进行扩增, 以磷酸甘油醛脱氢酶 (glyceraldehydephosphatedehydrogenase, GAPDH) 为内参 引物序列 :mir 582 5p 上游引物序列为 5 GCACACATTGAAGAGGACAGAC 3, 下游引物序列为 5 TATTGAAGGGGGTTCTGGTG 3 ; GAPDH 上游引物序列为 5 TCCACTGGCGTCT TCACC 3, 下游引物序列为 5 GGCAGAGATGAT GACCCTTTT 3 PCR 反应体系 :10 μl SYBR Green 7μL 高压灭菌蒸馏水 1μLcDNA 和 2μL 相应引物 PCR 反应条件 :95 30s,95 5s,60

4 第 11 期 王玉君, 等 :mir 582 5p 靶向调控 AKT3 对甲状腺乳头状癌细胞增殖和凋亡的影响 s, 连续进行 40 个循环 ; 每个样本重复 4 次, 采用 2 - Ct 法获得 mir 582 5p 的相对表达量 细胞培养 转染及分组从液氮罐中取出 PTCK1 细胞, 置于 37 水浴锅中快速晃动,1min 内融化冷存液, 并转移至 37 培养液中, 轻轻吹匀 ; 1000r min -1 离心 10min, 弃上清液 用适量培养液吹匀细胞沉淀, 转移至细胞培养瓶中, 置于 37 含体积分数 5%CO 2 的细胞培养箱中继续培养 取对数生长期细胞, 胰蛋白酶消化, 接种于 6 孔板中继续培养, 待细胞生长融合度达到 50% ~60% 时分为 mir 582 5pmimics 组 mir 582 5pAMO 组 mimics 对照组和 AMO 对照组, 采用转染试剂脂质体 Lipo fectamine2000 和无血清 Opti 培养基进行细胞转染 转染前, 弃去原培养液, 加入无血清 Opti 培养基饥饿细胞 2h 转染 6h 后更换新鲜培养液, 继续培养细胞,24h 后收集 4 组 K1 细胞, 进行后续实验 实时荧光定量 PCR 法检测 4 组 K1 细胞中 mir 582 5p 表达应用 TRIzol 试剂盒提取细胞总 RNA, 并检测总 RNA 纯度 将 RNA 反转录为 cd NA 以 cdna 为模板进行扩增, 以 U6 为内参 引物序列 :mir 582 5p 上游引物序列为 5 GCACACATT GAAGAGGACAGAC 3, 下游引物序列为 5 TATT GAAGGGGGTTCTGGTG 3 ;U6 上游引物序列为 5 GCTTCGGCAGCACATATACT 3, 下游引物序列为 5 TTCACGAATTTGCGTGTCAT 3 PCR 反应体系 : 10μLSYBR Green 7μL 高压灭菌蒸馏水 1μL cdna 和 2μL 相应引物 PCR 反应条件 :95 30s, 95 5s,60 30s, 连续进行 40 个循环 ; 每个样本重复 4 次, 采用 2 - Ct 法获得 mir 582 5p 的相对表达量 MTT 法检测 4 组 K1 细胞活性取各组转染后细胞, 胰蛋白酶消化, 接种于 96 孔板, 调整细胞密度为每孔 个, 每组设置 6 个复孔, 分别于培养 h 后弃去培养液, 每孔加入 500μL0.5g L -1 MTT 溶液,37 孵育 4h, 每孔加入 100μL 二甲基亚砜, 避光条件下摇床轻轻摇晃 1min, 继续孵育 10min, 应用酶标仪于波长 490nm 处测定各孔吸光度 平板克隆形成实验检测 4 组 K1 细胞克隆能力取各组转染后培养 24h 的细胞, 胰蛋白酶消化, 接种于 35mm 小皿中, 每皿 300 个细胞, 每组设 置 3 个复皿, 每 3d 更换新鲜培养液, 培养 10d 后 PBS 清洗细胞 3 次,40g L -1 多聚甲醛固定, 1g L -1 结晶紫溶液染色 ; 以 50 个细胞作为 1 个克隆, 计数各组细胞克隆数量 锥虫蓝染色检测 4 组 K1 细胞存活率取各组转染后细胞, 接种于 6 孔板,24h 后用胰蛋白酶消化细胞,1000r min -1 离心 10min, 弃上清液 向细胞沉淀中加入锥虫蓝染色液 应用细胞计数板在细胞计数仪上观察细胞, 蓝染代表死亡细胞, 计算细胞存活率 每组细胞重复 3 次, 取均值 TUNEL 法检测 4 组 K1 细胞凋亡情况取各组转染后细胞, 接种于小皿中, 接种密度为 cm -2,24h 后弃去小皿中的培养液,PBS 洗涤, 40g L -1 多聚甲醛固定, 山羊血清孵育 1h 进行封闭, 并用体积分数 0.5%Triton 溶液进行穿透, 按照试剂盒说明书将 Vial1 和 Vial2 按照 1 9 的比例混合, 用混合物避光孵育细胞 1h PBS 洗净后使用 Hoechst 染色液孵育细胞, 并于倒置荧光显微镜下观察染色情况, 拍照并计算细胞凋亡率 mir 582 5p 靶基因预测利用 TargetScan Human7.2 在线软件 (htp:// vert_72/) 预测人 mir 582 5p 的靶基因 从 mir 582 5p 的靶点基因中发现 AKT3 与人类多种肿瘤相关, 如乳腺癌 胃癌 卵巢癌 甲状腺癌 黑色素瘤 前列腺癌和结肠癌等 因此, 推测 mir 582 5p 可能通过靶向调控 AKT3 的表达而发挥抑制 PTC 细胞增殖及促进其凋亡的作用 Westernblot 法检测 4 组 K1 细胞中 AKT3 蛋白表达取各组转染后培养 24h 的细胞, 接种于 6 孔板, 提取细胞中总蛋白, 超声震碎并裂解蛋白, 应用 BCA 试剂盒检测总蛋白浓度, 加入蛋白样品 蛋白上样缓冲液和蒸馏水, 混匀, 在金属浴中煮沸, 使蛋白质变性 将蛋白样本和 Marker 进行凝胶电泳分离, 电泳结束后进行转膜 封闭和洗膜, 加入 AKT3 抗体一抗 ( 稀释 ),4 过夜孵育, PBS 洗涤 3 次, 每次 5min, 加入二抗 ( 稀释 ), 并进行扫膜 以 β actin 为内参, 检测 AKT3 蛋白相对表达量 1.4 统计学处理应用 Graphpadprism7.0 软件进行统计分析, 计量资料以均数 ± 标准差 ( x±s) 珋表示, 两两比较采用 t 检验,P<0.05 为差异有统计学意义

5 958 新乡医学院学报 htp:// 年第 35 卷 2 结果 2.1 PTC 组织和癌旁组织中 mir 582 5p 表达比较 PTC 组织和癌旁组织中 mir 582 5p 相对表达量分别为 0.372± ±0.083,PTC 组织中 mir 582 5p 相对表达量显著低于癌旁组织, 差异有统计学意义 (t=5.003,p<0.05) 组 K1 细胞中 mir 582 5p 表达比较 mir 582 5pmimics 组 mimics 对照组 AMO 对照组和 mir 582 5pAMO 组 K1 细胞中 mir 582 5p 相对表达量分别为 ± ± ± ±0.145;miR 582 5pmimics 组细胞 K1 中 mir 582 5p 相对表达量显著高于 mimics 对照组 mir 582 5pAMO 组和 AMO 对照组, 差异均有统计学意义 (t= ,P<0.05) mir 表 1 4 组 K1 细胞活性比较 Tab.1 ComparisonofK1celsactivityamongthefourgroups 582 5pAMO 组 K1 中 mir 582 5p 相对表达量显著低于 AMO 对照组和 mimics 对照组, 差异有统计学意义 (t= ,P<0.05);mimics 对照组与 AMO 对照组 K1 中 mir 582 5p 相对表达量比较差异无统计学意义 (t==30.715,p>0.05) 组 K1 细胞活性比较结果见表 1 和图 1 细胞培养 0h 时 4 组 K1 细胞活性比较差异无统计学意义 (P>0.05) 细胞培养 h 时, mir 582 5pmimics 组 K1 细胞活性显著低于 mir 582 5pAMO 组 mimics 对照组和 AMO 对照组, 差异均有统计学意义 (P<0.05);miR 582 5pAMO 组 K1 细胞活性显著高于 mimics 对照组和 AMO 对照组, 差异均有统计学意义 (P<0.05);mimics 对照组与 AMO 对照组 K1 细胞活性比较差异无统计学意义 (P>0.05) 组别 n 细胞活性 ( 吸光度 ) 培养 0h 培养 12h 培养 24h 培养 36h 培养 48h mimics 对照组 ± ± ± ± ±0.17 mir 582 5pmimics 组 ± ±0.08 a 1.50±0.14 a 1.80±0.08 a 2.03±0.10 a AMO 对照组 ± ± ± ± ±0.26 mir 582 5pAMO 组 ± ±0.07 b 2.08±0.08 b 2.40±0.07 b 2.80±0.10 b 注 : 与 mir 582 5pAMO 组 mimics 对照组和 AMO 对照组比较 a P<0.05; 与 mimics 对照组和 AMO 对照组比较 b P<0.05 图 1 4 组 K1 细胞活性比较 Fig.1 Comparison ofk1 celactivityamongthefour groups 组 K1 细胞克隆形成能力比较 mimics 对照组 mir 582 5pmimics 组 AMO 对照组 mir 582 5p AMO 组 K1 细胞克隆数量分别为 18.47± ± ± ±7.74;miR 582 5p mimics 组 K1 细胞克隆数量显著少于 mimics 对照组 AMO 对照组和 mir 582 5pAMO 组, 差异有统计学意义 (t= ,P<0 05);miR 582 5p AMO 组 K1 细胞克隆数量显著多于 AMO 对照组和 mimics 对照组, 差异有统计学意义 (t= ,P<0.05);mimics 对照组与 AMO 对照组 K1 ( 珔 x±s) 细胞克隆数量比较差异无统计学意义 (t=32.851, P>0.05) 组 K1 细胞存活率比较 mimics 对照组 mir 582 5pmimics 组 AMO 对照组和 mir 582 5p AMO 组 K1 细胞存活率分别为 (76.46±13.53)% (42.64±10.85)% (77.82±10.35)% (83.63± 13.53)%;miR 582 5pmimics 组 K1 细胞存活率显著低于 mimics 对照组 AMO 对照组和 mir 582 5p AMO 组, 差异有统计学意义 (t= ,P<0.05);miR 582 5pAMO 组 K1 细胞存活率显著高于 AMO 对照组和 mimics 对照组, 差异有统计学意义 (t= ,P<0.05);mimics 对照组与 AMO 对照组 K1 细胞存活率比较差异无统计学意义 (t=31.640,p>0.05) 组 K1 细胞凋亡率比较结果见图 2 mim ics 对照组 mir 582 5pmimics 组 AMO 对照组和 mir 582 5p AMO 组 K1 细胞凋亡率分别为 (23.35±9.64)% (42.63±13.38)% (22.85± 9 74)% (10.84±3.64)%;miR 582 5pmimics 组 K1 细胞凋亡率显著高于 mimics 对照组 AMO 对照

6 第 11 期 王玉君, 等 :mir 582 5p 靶向调控 AKT3 对甲状腺乳头状癌细胞增殖和凋亡的影响 959 组和 mir 582 5pAMO 组, 差异有统计学意义 (t= 5 956, ,P<0.05);miR 582 5pAMO 组细胞凋亡率显著低于 AMO 对照组和 mimics 对照组, 差异有统计学意义 (t= ,P<0.05); mimics 对照组与 AMO 对照组 K1 细胞凋亡率比较差异无统计学意义 (t=41.850,p>0.05) 图 2 4 组 K1 细胞凋亡情况 Fig.2 ApoptosisofK1celsinthefourgroups 组 K1 细胞中 AKT3 蛋白表达比较结果见图 3 mimics 对照组 mir 582 5pmimics 组 AMO 对照组和 mir 582 5pAMO 组 K1 细胞中 AKT3 蛋白相对表达量分别为 1.000± ± ± ±0.141;miR 582 5p mimics 组 K1 细胞中 AKT3 蛋白相对表达量显著低于 mimics 对照组 AMO 对照组和 mir 582 5pAMO 组, 差异有统计学意义 (t= , P<0 05);miR 582 5pAMO 组 K1 细胞 AKT3 蛋白相对表达量显著高于 AMO 对照组和 mimics 对照组, 差异有统计学意义 (t= ,P< 0 05);mimics 对照组与 AMO 对照组 K1 细胞 AKT3 蛋白相对表达量比较差异无统计学意义 (t= ,P>0.05) 图 3 4 组 K1 细胞中 AKT3 蛋白表达 (Westernblot) Fig.3 ExpresionofAKT3proteininK1celsinthefour groups(westernblot) 3 讨论 mirna 是一类高度保守的内源性非编码 RNA, 长度约 22 个核苷酸, 广泛存在于病毒和高等生物, 其能够通过碱基互补原理与靶基因的 mrna 结合, 降解靶基因的 mrna 或抑制其翻译, 在细胞的存活 分化 增殖和凋亡等过程中起着重要作用, 并参与肿瘤等多种疾病的发生和发展 [21 22] 本研究的目的是探究 mir 582 5p 在甲状腺癌组织和细胞中的表达以及 mir 582 5p 对甲状腺癌细胞增殖和凋亡的作用, 并分析其具体机制 本研究结果显示, mir 582 5p 在甲状腺癌组织和细胞中表达显著下调 ; 提示 mir 582 5p 可能参与甲状腺癌的发生和发展过程, 且在甲状腺癌中是抑癌基因 但是, 本研究样本量较小, 尚不足以证明 mir 582 5p 可以作为甲状腺癌的生物标志物, 有待增加样本量进一步证实, 为甲状腺癌的诊断和治疗提供新的 重要的生物标志物, 为甲状腺癌的治疗提供实验基础和新思路 AKT3 基因是一种与细胞周期 G 2 期有关的丝氨酸 / 苏氨酸蛋白激酶, 能够维持细胞周期, 且抑制细胞发生凋亡, 从而参与多种肿瘤的发生和发展 [23 24] 本研究结果显示,miR 582 5p 能够降低人 PTCK1 细胞的活性, 抑制人 PTCK1 细胞增殖, 促进人 PTCK1 细胞凋亡, 其机制可能与 mir 582 5p 调控 AKT3 基因表达有关 近几年来,miRNA 在不同肿瘤中的作用和角色的研究已经成为热点 MiRNA 在肿瘤的发生 发展 增殖 凋亡 侵袭 转移和耐药等过程中起着十分重要的调控作用, 其通过靶向作用多种癌基因或抑癌基因, 在肿瘤细胞分化 血管生成 上皮间叶细胞分化 转移及耐药性等方面起一定的作用 mirna 丢失或功能调节异常均有可能导致肿瘤的发生 mirna 的作用主要通过 2 种方式实现 :mirna 减少和 mirna 替代 mirna 减少适用于在肿瘤组织中表达上调的 mirna, 而 mirna 适用于在肿瘤组织中表达下调或缺失的 mirna 此外, 研究显示,miRNA 参与了甲状腺癌的发生和发展过程,miR 144 3p 能够通过靶向调控其靶基因 ROCK1 的表达, 进而抑制 PTC 细胞增殖 迁移和侵袭, 为临床治疗甲状腺癌提供新的靶点 [23] mir 125a 5p 能够通过抑制其靶基因 CD147 的表达而调控甲状腺癌细胞糖代谢和肿瘤细胞的恶性程度, 在甲状腺癌中发挥抑癌基因的作用, 这为甲状腺癌的

7 960 新乡医学院学报 htp:// 年第 35 卷 治疗提供了新的方法和靶点 [24] 本研究观察了 mir 582 5p 对人 PTCK1 细胞增殖和凋亡的影响, 而未探究其对人 PTCK1 细胞迁移和侵袭的影响, 在后续的研究中将会继续探究 mir 582 5p 对人 PTCK1 细胞迁移和侵袭等其他生物学特征的影响 综上所述, 人 PTC 组织和细胞中 mir 582 5p 表达显著下调,miR 582 5p 可能通过靶向作用于 AKT3 而抑制 PTC 细胞的增殖, 促进其发生凋亡, 该研究为研究 PTC 的发病机制及临床治疗提供新的方法和思路 参考文献 : [1] ZHUC,LIS,GAOX,etal.Retrospectiveanalysisofthyroidnod ules:thyroidcancerriskfactorsinsuzhou,china[j].clinlab, 2018,64(3): [2] 王苏, 姜孝奎, 武文杰, 等. 精细被膜解剖技术在分化型甲状腺癌手术中的应用 [J]. 新乡医学院学报,2017,34(7): , 696. [3] 种静, 孙咏梅, 张俊鹏, 等. 超声造影对甲状腺乳头状癌的诊断价值 [J]. 中国医学影像学杂志,2017,25(4): [4] GOUQ,GAOL,NIEX,etal.LongnoncodingRNAAB074169in hibitscelproliferationviamodulationofkhsrp mediatedcd KN1aexpresioninpapilarythyroidcarcinoma[J].CancerRes, 2018,78(15): [5] 殷德涛, 韩, 张亚原, 等. 多灶性甲状腺乳头状癌的临床病理及颈淋巴结转移特征 [J]. 中国普通外科杂志,2017,26(5): [6] CHENB,LIJ,YIC,etal.Longnon codingrnapolr2ers isasociatedwiththeriskofpapilarythyroidcarcinomainchinese population[j].patholrespract,2018,214(7): [7] 丁颖丽, 霍艳雷, 王丹阳, 等. 儿童及青少年分化型甲状腺癌放射性碘治疗进展 [J]. 中华实用儿科临床杂志,2018,33(8): [8] 任庆余, 王琳杰, 赵进沛. 碘 131 治疗分化型甲状腺癌外照射辐射剂量研究 [J]. 中国职业医学,2017,44(5): [9] AMDURRJ,DAGANR.TheUniversityofFloridaDepartmentof RadiationOncologyGuidelinesfortreatmentofdiferentiatedthy roidcancerwithi 131orexternal beam radiotherapy[j].am J ClinOncol,2018,[Epubaheadofprint]. [10] PACINIF,BASOLOF,BELLANTONER,etal.Italianconsensus ondiagnosisandtreatmentofdiferentiatedthyroidcancer:joint statementsofsixitaliansocieties[j].jendocrinolinvest,2018, 41(7): [11] 黎颖昕, 弓健, 郭斌, 等. 分化型甲状腺癌患者 131I 治疗后胸腺显影伴甲状腺球蛋白升高的临床分析 [J]. 中国医学影像技术,2017,33(7): [12] LIR,DONGB,WANGZ,etal.MicroRNA 361 5pinhibitspapil larythyroidcarcinomaprogresionbytargetingrock1[j].bi omedpharmacother,2018,102: [13] STEFANESCUH,MUNTEAND,PILUTC,etal.Usingbloodand plasmamicrornasasanon invasivebiomarkerinpatientswith colorectalcancer[j].clinlab,2018,64(3): [14] LUANT,ZOUR,HUANGL,etal.Hsa mir 3658promotescel proliferation,migrationandinvasionbyefectinglass2inblad dercancer[j].clinlab,2018,64(4): [15] CHENZ,ZHAOL,SHIK,etal.Mechanismcomparisonofgem citabineanddasatinib resistantpancreaticcancerbyintegrating mrnaandmirna expresionprofiles[j].clinlab,2018,64 (5): [16] 姜炜博.miRNA 495 通过 HMGN5 对骨肉瘤生物学行为影响的研究 [D]. 长春 : 吉林大学,2017. [17] JINY,TAOLP,YAOSC,etal.MicroRNA 582 5psuppresed gastriccancercelproliferationviatargetingakt3[j].eurrev MedPharmacolSci,2017,21(22): [18] JINX,GUANY,SHENGH,etal.Crostalkincompetingendoge nousrnanetworkrevealsthecomplexmolecularmechanismun derlyinglungcancer[j].oncotarget,2017,8(53): [19] WANGW W,CHENB,LEICB,etal.miR 582 5pinhibitsinva sionandmigrationofsalivaryadenoidcysticcarcinomacelsby targetingfoxc1[j].jpnjclinoncol,2017,47(8): [20] SHUZ,CHENL,DINGD.miR 582 5Pinducescolorectalcancer celproliferationbytargetingadenomatouspolyposiscoli[j]. WorldJSurgOncol,2016,14(1): [21] 郝义, 孙笑, 刘玉秋, 等.miRNA 146a 在视网膜色素上皮细胞老化及老年性黄斑变性中的功能研究 [J]. 眼科新进展, 2017,37(2): [22] LIJ,XUJ,YANX,etal.microRNA 485playstumour suppres siverolesincolorectalcancerbydirectlytargetinggab2[j].on colrep,2018,40(1): [23] LIUC,SU C,CHEN Y,etal.MiR 144 3ppromotesthetumor growthandmetastasisofpapilarythyroidcarcinomabytargeting pairedboxgene8[j].cancercelint,2018,18: [24] HUANGP,MAOLF,ZHANGZP,etal.Down regulatedmir 125a 5ppromotesthereprogrammingofglucosemetabolism and celmalignancybyincreasinglevelsofcd147inthyroidcancer [J].Thyroid,2018,28(5): ( 本文编辑 : 徐自超英文编辑 : 徐自超 )

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