第 期 陈 姗等 日本鳗鲡 干扰素诱导的溶酶体巯基还原酶基因的克隆鉴定与表达分析 关的基因 但鳗鲡中对其特征和功能却未有报道 * 本研究克隆了日本鳗鲡 基因 的基因组和启动子序列 并通过生物信息学方法分析了其编码蛋白的序列特征 在此基础上 进一步研究了其在日本鳗鲡不同组织中的表达情况 以及 聚肌胞苷

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1 第 卷 第 期厦门大学学报 自然科学版 <+)+ 年 月 + &1)+9 1 -& & - 3,; 1, 1) / -&/- ).+8 33& 日本鳗鲡. 干扰素诱导的溶酶体巯基还原酶 基因的克隆鉴定与表达分析 陈 姗 张芳芳 黄 贝 黄文树 集美大学水产学院 鳗鲡现代产业技术教育部工程研究中心 集美大学 福建省海洋生物资源开发利用协同创新中心 福建厦门 摘要 在日本鳗鲡 中克隆获得 个 干扰素诱导的溶酶体巯基还原酶 基因 和 并对其序列进行生物信息学分析 进而利用实时荧光定量 * 分别检测 个基因在不同组织器官中的表达水平 及其在脂多糖 聚肌胞苷酸 +);5 刺激和迟缓爱德华氏菌 $ # 感染后的表达变化 结果显示 个基因编码的蛋白序列中均含有 5 " 家族的特征序列 >6 # 活性位点 个糖基化位点和 个保守的半胱氨酸残基 基因组序列均含 个外显子和 个内含子 个基因启动子中都存在多个转录因子结合位点 如 干扰素活化位点以及特化蛋白 结合位点 不同的是 启动子区存在多个核因子 激活蛋白 结合位点及干扰素刺激反应元件 而在 启动子区未发现 在鳃和肠中表达量最高 而 在性腺 头肾和脾脏中表达量最高 除肠道外 同一组织中 的表达量均高于 +);5 刺激和 # 感染后 与 的表达在鳃中仅有少数变化 而在头肾和中肾中则变化较明显 综上所述 和 基因可能参与了日本鳗鲡受病毒和细菌感染后的免疫应答 关键词 日本鳗鲡 干扰素诱导的溶酶体巯基还原酶 基因表达中图分类号 > 文献标志码 文章编号 干扰素诱导的溶酶体巯基还原酶 &,- 9- +& &. / )-);3+3+ 1), +) -. /,13-5 " 最初在人的单核细胞系 中被发现 它首先被合成为一个 0 的蛋白前体 然后通过甘露糖 磷酸受体 1&& ,- -/-2,+ 运输到胞吞通路中 被溶酶体中的蛋白酶将其 端和 端前肽切除 形成一个 0 的成熟肽 5 " 的前体和成熟肽都具有还原二硫键的作用 且在 26 的酸性条件下可发挥最佳效果 脊椎动物 5 " 蛋白的典型特征包括 个 >6 # 特征序列 个 活化位点 个以上天冬氨酸残基连接的糖基化位点 3&) &0-.();/+3;)1, +&3,- 和 个保守的半胱氨酸残基 5 " 在大多数的抗原递呈细胞 如单核 巨噬细胞 细胞 骨髓树突状细胞 中呈组成型表达 而在其 收稿日期 录用日期 基金项目 福建省自然科学基金 他细胞 如成纤维细胞 表皮细胞 角化细胞 中可被 干扰素诱导 除了与抗原递呈有关 5 " 也与负调控 " 细胞活化 中和胞外病原和清除细菌感染所造成的细胞碎片有关 此外 还有研究发现除了 干扰素 在 2 + +) ; 3,1,-1/-,1,- 和脂多糖 的诱导作用下可促使 "6 细胞分泌促炎症细胞因子和趋化因子 其中包括 5 " 目前 基因在无脊椎动物和脊椎动物中均有报道 有研究显示 在鱼类中 基因主要在脾脏和肾脏中表达量最高 且经 或细菌刺激后其 * 表达水平上调 这表明 5 " 可能在对细菌感染后宿主的免疫应答中有重要作用 日本鳗鲡 + 是世界性的经济养殖鱼类 但在其养殖过程中 细菌 寄生虫 真菌和病毒性疾病的发生会给鳗鲡养殖业带来巨大的损失 是与免疫相 通信作者 3 1&(8-. /& 引文格式 陈姗 张芳芳 黄贝 等 日本鳗鲡 干扰素诱导的溶酶体巯基还原酶 基因的克隆鉴定与表达分析 厦门大学学报 自然科学版 ", (,# 6# %6 $$6 -,1) )+& &(1& &1&1);3 3+9 &,- 9- +& &. / )-);3+3+ 1), +) -. /,13-(-&- & 1 -& & 1, / & &-3-

2 第 期 陈 姗等 日本鳗鲡 干扰素诱导的溶酶体巯基还原酶基因的克隆鉴定与表达分析 关的基因 但鳗鲡中对其特征和功能却未有报道 * 本研究克隆了日本鳗鲡 基因 的基因组和启动子序列 并通过生物信息学方法分析了其编码蛋白的序列特征 在此基础上 进一步研究了其在日本鳗鲡不同组织中的表达情况 以及 聚肌胞苷酸 +);5 刺激和迟缓爱德华氏菌 $ # 感染不同时间后在不同组织中的表达变化 以期为了解 的功能奠定基础 材料与方法 % 材 料日本鳗鲡 体质量为 ( 来源于福建省厦门市集美大学水产养殖基地 迟缓爱德华菌为集美大学水产学院实验室保存菌种 % 基因的 *2 序列克隆 用 "+) * 提取试剂提取总 * 经无 *13- 的 413- 处理后 用反转录试剂盒 + / 2, " *- - 3-" 1&3/ 2, +& ;3,- + -(1 美国 制备 /4 模板 用 *" * # 试剂盒 )+&,-/ 美国 制备 = 和 =/4 末端快速克隆 * # 模板 设计 * #* 引物 表 分别扩增 和 的 = 和 = 端序列 * 扩增条件为 预变性 变性 退火 延伸 & 延伸 & 预变性 变性 退火 延伸 & 延伸 & 用引物 9)$ 9)* 和 9)$ 9)* 表 进行 * 扩增 分别验证 和 的开放阅读框 +2-& -1. &(9 1 -'*$ 序列 * 预变性 & 变性 退火 延伸 & 个循环 延伸 & 扩增所得的 * 产物经 A 质量分数 琼脂糖凝胶电泳检测 # % 凝胶回收试剂盒 ' -(1 美国 回收目的条带 然后连接到 2 4" 载体 "1?1 *1 日本 上 并通过热激转化到大肠杆菌 $ 46 感受态细胞中 最后筛选阳性克隆并通过测序验证 % 的基因组和启动子序列克隆取日本鳗鲡肌肉组织 ( 经酚 三氯甲烷 异戊醇法提取基因组 4 以基因组 4 为模板 用引物 9)$ 9)* 和 9)$ 9)* 表 分别扩增 和 的基因组序列 * 预变性 变性 退火 & 延伸 & 以日本鳗鲡基因组 4 为模板 用引物 2$ 2* 和 2$ 2* 表 分别扩增 和 的启动子序列 * 预变性 变性 退火 延伸 & 延伸 & % 基因的表达分析样品采集 日本鳗鲡经丁香酚及冰水麻醉后 断尾取血于加有肝素钠的离心管中 混匀 离心 & 收集下层细胞 保存备用 然后解剖采集肝脏 脾脏 肠 皮肤 胃 头肾 中肾 鳔和鳃等组织 器官 分别于液氮冷冻后 保存 诱导表达实验 分别设置磷酸盐缓冲液 对照组 ( 1 美国 刺激组 剂量为 ( (+);5 ( 1 美国 刺激组 剂量为 ( ( 迟缓爱德华氏菌感染组 剂量为 /9 (/9 表示菌落形成单位 腹腔注射 注射 和 后采样 每组每个时间点各采集 尾 实时荧光定量 * *"* 根据已获得的 和 的 /4 序列和基因组序列比对结果 设计跨内含子区域的 和 扩增引物 分别为 $ * 和 $ * 表 同时以 + # -& 1&0 为内参基因 设计引物 # 2$ 和 # 2* 表 以日本鳗鲡 /4 为模板 * 扩增 以及 + # 基因片段 回收目的片段进行连接 转化和克隆鉴定后测序 再将测序正确的菌液扩大培养提取质粒 测定质粒浓度并以其为原液用灭菌水进行 倍稀释 用 (,;/)- 7 * --& 试剂盒 *+/ - 德国 扩增 绘制标准曲线 然后在每块 孔板中加入 个已知拷贝数的质粒样品 剩余孔加入未知样品 * 3 共 个循环 和 的采集点温度分别为 反应结束后计算未知样品的拷贝数 % 序列分析和数据统计分析在 5 网站,2 )13,&/ &) & (+ 进行序列比对分析 用 #; 工具,2

3 厦门大学学报 自然科学版 年 表 本研究中使用的引物 " &, 33,.; 引物名称 序列 = = 用途 " "" " "" " " " * # "" "" " " "" $ """" " " + 的 =* # $ " " """ " " " * " "" + 的 =* # * " "" "" " 9)$ " "" " + 序列验证 9)* " " $ " " " "" + 的 =* # $ "" """ * """"" " 的 =* # * " "" """ 9)$ " "" " 序列验证 9)* " " " " "" "" 2$ " "" "" 启动子序列扩增 2* 2$ 2* "" " " """ "" " "" " """" "" $ *"* * $ * # 2$ " " " " "" " """ "" " " " " " # 2* "" "" ;+ ( 翻译氨基酸序列和分析蛋白质功能域 用 (&1) - -,2/ 3.,.0 3-/-3 (&1) 分析信号肽序列 用 -, );/ - -,2 / 3.,.03-/-3-, );/ 分析糖基化位点 用 工具,2 9,9);+ (3-,++)32 + +,-, ) 预测基因调控区域 用 + +,-,2/ 3.,.0 3-/-3 + +,- 预测转录起始位点 用调控元件结合位点分析网站,2 (-&- -( )1, +&/ ( 1 31) 1 1 &.-, ) 分析基因启动子序列中潜在的转录因子结合位点 用 ) 3,1): 和 # 软件比较氨基酸序列同源性和构建系统进化树 数据用 # /-) 进行计算 用单因素方差分析法 +&- 1; '< 进行统计分析 并用 4 &&-,# 检 验 双尾 进行多重比较 所有数据均用平均值 标准差的方式表示 表示差异显著 表示差异极显著 用 软件作图 结果与分析 % 基因的鉴定及特征分析如图 所示 和 的 /4 序列全长分别为 2 和 2 编码蛋白分别含 和 个氨基酸残基 预测其分子质量大小分别为 和 0 等电点分别为 和 其中 含有保守的终止信号 " 和 2+); 序列 氨基酸序列分析结果显示 和

4 第,期 陈 # 姗等 日本鳗鲡%干扰素诱导的溶酶体巯基还原酶基因的克隆鉴定与表达分析 /,-( / 虚线表示预测的信号肽序列 (椭圆框表示活性位点 ZZ(阴影表示保守的半胱氨酸残基 (方框表示糖基化位点 ( 单下划线表示特征序列 bt>z 5Z "Z (双下划线表示终止信号 %++4+++&_ 图 &#%,"#$C&%I&和 %,"#$C3%*&的 GR"+ 及预测的氨基酸序列 3 3, 6 < 2& GR"+I8FP = EF < G D EFIO< 8CI G < FQ E E QC W%,"#$% &% I&I8F%,"#$% 3% \KE8G 均含有特征序列 bt>z 5Z "Z (分 " 端分别含有 3& 和 33 个氨基酸残基组成的信号肽 _ 别位于 &3,#&#) 位和 &&(#&#3 位氨基酸残基,活性 克隆获得 %,"#$%& 和 %,"#$%3 的基因组序 位点 ZZ(分别位于 ()#-3 和 (3#($ 位氨基酸残 列全长分别为,:$(*P 和,,$3*P_与 %,"#$%& 和 基,3 个糖基化位点 (分别为 "$-)":- 和 "$&)"&#$, %,"#$%3 的 GR"+ 序列进行比对 (发现 %,"#$%& 和 %,"#$%3 基因组序列均含有 ( 个外显子和 : 个 && 个保守的半胱氨酸残基 (预测可形成 $ 个二硫键, %,"#$% 3 3 3, " " %&'( %&'( )*'( +, #$

5 内含子 图 与其他脊椎动物 人 鼠 斑马鱼 大黄 鱼等 的 基因结构相似 %9 : 分析 氨基酸序列比对和系统进化树 将 5 " 和 5 " 与其他物种 5 "3 的氨基酸序列进行多重比对 结果表明它们在蛋白特征结构上高度保守 附录图,28 -. /& 2)+1., ), )5 " 与所比对的其他物种 5 "3 的氨基酸序列相似性为 A A 其中与大西洋鲑 ( " $ 的相似性最高 而 5 " 与所比对的其他物种 5 "3 的氨基酸序列相似性为 A A 其中与虹鳟 3+ ) $") $$ 的相似性最高 系统进化树分析显示 所选的 5 " 家族蛋白被分为脊椎动物和无脊椎动物两大类 且在进化过程中来源于一个共同的祖先 其中 5 " 与 5 " 聚为一支 两者又与大西洋鲑和虹鳟的 5 "3 聚为一支 表明亲缘关系较近 图 % 启动子序列分析 与 启动子分析结果表明两者均存在多个转录因子结合位点 包括 干扰素活化序列 &,- 9- +&1/, 1, +&3,- 特化蛋白 32-/ 9 /,;2 +,- & 2 转录因子 " 增强子结合蛋白 " -& 1&/-&. &(2 +,- & # 等 不同的是 启动子区存在多个核因子 & /)-1 91/,+ $ 激活蛋白 1/, 1,+ 2 +,- & 结合位点及干扰素刺激反应元件 &,- 9- +&3,)1, +& -1/, +&-)- -&,5 *# 而在 启动子区未发现 图 % 基因在不同组织 器官中的表达利用 *"* 检测 和 在健康日本鳗鲡的肝脏 脾脏 胃 血液 头肾 中肾 鳃 厦门大学学报 自然科学版 年 肠 心脏 尾鳍 性腺 鳔 肌肉和皮肤共 个组织 器官中的表达情况 结果显示 图 和 在所检测的组织 器官中均有表达 在鳃和肠中表达量最高 其次为头肾 中肾 鳔 皮肤 血液 性腺及肌肉 在肝脏 尾鳍和胃中的表达量极低 而 在性腺 头肾和脾脏中表达量最高 其次为鳃 中肾 肌肉和心脏 在尾鳍和胃中表达量最低 此外 在性腺 脾脏 鳃 中肾 肝脏和胃中 的表达量都显著高于 %:--#$4 " 刺激及 感染后 基因的表达变化 通过 *"* 检测 +);5 刺激以及 # 感染 和 后 和 在日本鳗鲡的鳃 头肾和中肾中的表达情况 结果如图 所示 在 刺激后 鳃中 的表达量在刺激 后有一定程度上调 之后恢复 但均无显著性差异 的表达量在刺激 后有一定程度上调 但在 后又显著下调 头肾中 和 的表达量在刺激 后均显著下调 之后维持在较低水平 中肾中 的表达量在刺激 后显著下调 之后逐渐恢复 而 的表达量在刺激 后无显著变化 但在 后显著下调 之后维持在较低水平 在 +);5 刺激后 鳃中 的表达量仅在刺激 后显著下调 而 的表达量仅在刺激 后显著上调 头肾中 的表达量在刺激 后显著下调 但在 后又有一定程度上调 而 表达量在刺激 后有一定程度上调 但在 后显著下调 中肾中 和 的表达量均在刺激 后显著下调 之后恢复 在 *# 感染后 鳃中 的表达量在 线条表示内含子 方框表示外显子 数字表示各外显子起止碱基的位置 图 1 和 的基因组序列结构 $ ( " -(-&+ /3- -&/-3, /, &.

6 第 期 陈 姗等 日本鳗鲡 干扰素诱导的溶酶体巯基还原酶基因的克隆鉴定与表达分析 5 " 和 5 " 用 标记 物种名后为各 5 " 对应的 -& 1&0 登录号 图 采用邻接法构建的 5 " 5 " 与其他物种 5 "3 的系统进化树 $ ( ;)+(-&-, /, " 5 "1&.+, - 5 "3 3 &(&- ( + 8+ & &( -, +. 图 1 和 的启动子序列分析 $ ( &1); ,- 3- -&/ &. 感染 后有一定程度下调 后有一定程度上调 之后恢复 但均无显著性差异 而 的表达量仅在感染 后显著上调 头肾中 的表达量在感染 后显著下调 之后维持在较低水平 而 的表达量在感染 后有一定程度上调 但在 后又显著下调 中肾中 的表达量在感染 后显著下调 的表达量在感染 后显著下调 之后均维持在较低水平 讨论与结论 本研究在日本鳗鲡中克隆获得 和 基因 /4 序列全长分别为 2 和 2 编码蛋白均含有 5 " 家族的特征序列 >6 # 活性位点 个糖基化位点及 个保守的半胱氨酸残基 其中活性位点

7 厦门大学学报 自然科学版 年 同一组织 器官中两基因比较 下同 图 和 在日本鳗鲡不同组织 器官中的表达谱 $ ( # &2 +9 )-+9 1&. + &. 9- -&,, (1&3+9* 是使巯基还原酶有活性和维持 5 " 结构和功能所必需的 且 中任何一个半胱氨酸残基的突变均可使 5 " 的巯基还原酶失活 5 " 的 个 连接糖基化位点可能由甘露糖 磷酸衍生而来 其在酸性条件下对 5 " 前体转运到溶酶体中是必需的 此外 保守的半胱氨酸残基可形成二硫键 +) &3 等 提出在含有高浓度半胱氨酸的条件下 可最大程度催化溶酶体中二硫化物的还原 因此 5 " 的功能可能涉及高浓度半胱氨酸的二硫键还原 进而在调节抗原递呈和表位选择中发挥作用 干扰素发挥作用是在? " " 信号通路中形成 " " 磷酸化同源二聚体 然后进入细胞核并通过结合目的基因启动子区的 来激活目的基因的转录 目前研究表明人类黑素瘤中 干扰素诱导的 基因表达取决于 " " 的活化 活化的 " " 通过结合 启动子中的 进而调节 基因表达 在斑节对虾 基因的研究中 发现其通过? " " 信号通路参与调节病毒感染后的一部分免疫应答 本研究结果显示 和 启动子区均含有 因此推测 和 在病毒感染后的免疫应答中也可能通过? " " 信号通路发挥作用 目前在大黄鱼 斜带石斑鱼 斑马鱼 加州鲈 暗纹东方 虹鳟 金鱼 鳜鱼 中检测 基因的组织表达 结果显示其均在脾脏和肾脏中表达最高 在文昌鱼中 基因在消化系统中表达最高 在皱纹盘鲍中 基因在鳃 外壳 膜和消化道组织中呈组成型表达 在合浦珠母贝中 基因在鳃和消化腺中表达最高 本研究中 和 在检测的 个组织中均有表达 在鳃和肠中表达量最高 而 在性腺 头肾和脾脏中表达量最高 这表明 基因在不同物种中的组织表达水平上存在差异 本研究结果显示 刺激后 鳃中 的表达量无显著变化 而 在刺激 后显著下调 头肾和中肾中 和 的表达量均显著下调 +);5 刺激后 鳃中 和 表达量在刺激 后有一定程度上调 头肾中 的表达量在刺激 后显著下调 的表达量在刺激 后显著下调 中肾中 和 的表达量均在刺激 后显著下调 # 感染后 鳃中 和 的表达量在 后上调 头肾中 的表达量在 后显著下调 的表达量在 后显著下调 中肾中 的表达量在 后显著下调 的表达量在 后显著下调 从结果来看 整体上 和 在鳃中表达仅有少数变化 而在头肾和中肾中整体表达变化更明显 这可能是因为肾脏是先天性和适应性免疫的主要反应位点 也是淋巴细胞和巨噬细胞存在的主要组织 活化的淋巴细胞和直接刺激的巨噬细胞可诱导 干扰素 从而引起 基因表达的上调 而鳃是非淋巴组织 虽然巨噬细胞在鳃中

8 第 期 陈 姗等 日本鳗鲡 干扰素诱导的溶酶体巯基还原酶基因的克隆鉴定与表达分析 图 +);5 刺激及 # 感染后鳃 头肾和中肾中 1 和 的表达变化 $ ( " &/ 1&( &. + 19,-+);53,)1, +& 1&. # &9-/, +& &( ) -1.0.&-;1&...)-0.&-;

9 也可以被 干扰素刺激 但 表达在鳃中变化不明显 暗示巨噬细胞在非淋巴组织中可能是参与先天性免疫而非适应性免疫 综上 本研究克隆了 和 两个基因及其启动子序列 对其进行了序列和结构分析 *"* 结果表明 在鳃和肠中表达量最高 而 在性腺 头肾和脾脏中表达量最高 此外 和 在病毒和细菌感染后的免疫应答中可能有重要作用 这为日本鳗鲡的病害防治提供了一定的理论基础 参考文献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厦门大学学报 自然科学版 年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郭松林 鳗鲡细菌性疾病的研究概况 科学养鱼 张芳芳 熊静 段明珠 等 日本鳗鲡 536 基因的克隆 鉴定及表达分析 集美大学学报 自然科学版 ' :-, 1) 5.-&, 9 /1, +& +9 &,- 9- +& &. / )-);3+3+ 1), +) -. /,13-4#%'7 ##+)-/ )1 /)+& &(1& & 1&1);3 3+9 &,- 9- +& &. / )-);3+3+ 1), +) -. /,13-5 ") 0-/ )+&- 7#$ $ $ $ $5& -,- 1, +) (-& (, %$ $1&.,3 &- -32+&3-,+ / 1)-&( &+) '=4'# :6 > #? # % -,1), &(-.(- &. /, +&+9, -1&, (-&2 +/-33 &(-& ; - 5$ &. / )-);3+3+ 1), +) -. /,13- & -)1&+ 1 /-)3 3 " ".-2-&.-&,,5" &.-2-&.-&, 5&+)?' "'?6' 4 * "'"

10 第 期 陈 姗等 日本鳗鲡 干扰素诱导的溶酶体巯基还原酶基因的克隆鉴定与表达分析 *5"6 :'* -,1) +)-/ )1 /)+& &(1& & 1&1);3 3 +9, - &,- 9- +& &. / )- );3+3+ 1), +) -. /,13-(-&-9 +, $" +) +)*-2 4 : *# $%6 -,1) +)-/ )1 /)+& &( 1& &1&1);3 3+9 &,- 9- +& &. / )-);3+3+ 1), +) -. /,13-(-&- &+ 1&(-32+,-.( $$ $ 3-)9 3 5&+) 5 : 5 ' -,1) +)-/ )1 1&. +)+( /1)/ 1 1/,-1, +&+9 &,- 9- +& &. / )-);3+3+ 1), +) -. /,13-(-&- & $ 3 -)9 3 5&+) ,1) 1 1/,-1, +&1& &+9 &,- 9- +& &. / )-);3+3+ 1), +) -. /,13- (-&- & 1 & +, +, 3 ) $ ") $,2) /1, +&39+ 5 " & &&1,- &- -32+&3-5&+(-&-, /3 '5 6-,1) +)-/ )1 /)+& &( &1&.9 &/, +&1)/ 1 1/,-1, +&+9 &,- 9- +& &. / )-);3+3+ 1), +) -. /,13- (-&-9 + 1&.1 &9 3 ( #$ $ 3-)9 3 5 &+) % ,1) +)-/ )1 / 1 1/,-1, +&1& &1&1);3 3+9 &,- 9- +& &. / )-); ), +) -. /,13-(-& )+;3,- 4 #, # &+) "$#, 8(; ),#($4, #7 )7 )#.., &*,0$ :4 # # ($ +,#$&* ( 9, " 6# 1& %6 $1&(91&( 6-6 :-&3 $ 3 - ;+)-(-- & - 3,; #&( &-- &(*-3-1 / -&,- +9, &"-/ &+)+(;9+ #-)5&. 3, ; & 3, ;+9#. /1, +&- & - 3,; $ 8 1&+)1 + 1, -5&&+ 1, +& -&,- 9+ # 2)+,1, +&1&., ) 1, +&+9 1 &- +)+( /1)*-3+ /-3 1 -& &1 0 )(* " + &,- 9- +& &. / )-);3+3+ 1), +) -. /,13- (-&-3&1 -. 1&. - -/)+&-.1&..-&, " -.-. /-. 1&. /+. &(3- -&/-3/+&,1 &-., / 1 1/,- 3, /9-1, -3+9, - 5 "2 +,- &91 );, - 5 "3 (&1, -3- -&/->6 #, -1/, -3,-, +2+,-&, 1)) &0-. ();/+3;)1, +&3,-31&.-)- -&/+&3- -./;3,- &-3 " - 1&. /+&,1 &-.3- -&- +& ,-. ;3&, +& & &;, 1&3/ 2, +&91/,+&. &(3,-3 &, ,- -( +&3 / 13 &,- 9- +&1/, 1, +&3,-1& &3-91/,+&. &(3,-3 " &/- -, --&, - 3, 1, 13& /)-1 91/,+ 1/, 1,+ 2 +,- & &. &(3,-31&. &,- 9- +&3,)1, +& -1/, +&-)- -&,)-.+-3&+, > 1&,,1, - -1), -*1&1); )-., 1,, &)- -)+9 13 ( -3, &( )1&. &,-3, &-)-, &)- -)+9 13 ( -3, & 3- (+& &-;1&.32)--& " &)- -) ( -, 1&, 1,+9 + & +3,, /-2,9+, - &,-3, &- 9,-, -3,)1, +&, ) 2+2+);31// ); &+3 &2+);/;,.;) /1/. +);5+ &9-/, +&, + $ #, &); &/ 1&( &. + &, -( )3)-, &/ 1&(-3 &, &...)-0.&-; &31 ; 1&. 1; - & +) -. & &- -32+&3-3,+ & 9-/, +&+91)1&. 1/,- 1)21, +(-&3 3 45#) &,- 9- +& &. / )-);3+3+ 1), +) -. /,13- (-& &

材料 方法

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