3728 中草药 n on n b u 第 46 卷第 24 期 2015 年 12 月穿心莲 no nu (Bu ) 为爵床科一年生草本植物, 有清热解毒抗炎消肿止痛作用穿心莲内酯是穿心莲的主要活性成分, 属于二萜类化合物, 国内已经利用穿心莲内酯开发出多种中药产品, 包括天津天士力制药股

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1 中草药 n on n b u 第 46 卷第 24 期 2015 年 12 月 3727 穿心莲香叶基香叶基焦磷酸合成酶基因的克隆与表达药材与资源 1, 王晓云 2, 陈蓉 3, 张恩慧 1, 钟国跃 1 江西中医药大学江西民族传统药现代科技与产业发展协同创新中心, 江西南昌江西省中药种质资源工程技术研究中心, 江西南昌桂林医学院, 广西桂林 , 2* 摘要 : 目的从穿心莲中克隆穿心莲内酯合成途径中的香叶基香叶基焦磷酸合成酶 (nn o n,) 基因, 并进行组织表达等特征研究方法采用 B- 法从穿心莲茎和叶中提取总, 简并引物扩增获得保守区段, 法获得基因全长,o 等软件分析基因特征, 实时荧光法检测不同发育时期穿心莲茎和叶中基因的表达结果获得了一个长 b 的基因, 编码一条由 348 个氨基酸组成的蛋白质序列, 与长春花的蛋白亲缘关系较近, 端含有一个由 47 个氨基酸构成的质体信号肽在穿心莲的茎和叶中, 基因在花蕾期表达量较高, 初花期降低 ; 到了花果混合期表达量升高, 青果期下降表明穿心莲花蕾期和花果混合期相关代谢成分的合成可能更活跃结论从穿心莲中克隆了基因, 为开展穿心莲内酯合成途径的调控奠定了基础关键词 : 穿心莲 ; 穿心莲内酯 ; 生物合成途径 ; 基因 ; 克隆 ; 表达中图分类号 :28212 文献标志码 : 文章编号 : (2015) O: /jn onn n u xon o nn o n n o no nu Xo-un 1, 2, on 3, Z n-u 1, ZO uo-u 1, 2 1 obo nnoon n o on noo n nu on o Jnx no on n, nn , n 2 n n ou nnn noo n o Jnx on, nn , n 3 un Un, un 1004, n b: Obj noo n bo ubn n no nu, n ou u u nn () on n non nn o n o nu n z u xon n o o w x w B- xon o; on n w n on w n, n u n O non nn o n w obn w o n nz b bono ow, o u xon n w w u on b n non qun w 348 no no qun onn -n n n w on o nu ou n x n n n n o nu xon bu, n own, n own n n n, n n n onn bo xon, bon o bo u b w u o bu n own n n onuon nz n bon o noo on n o nu, n o oo n n nnn o noo bon w wo: no nu (Bu ) ; noo; bon w; n; onn; xon 收稿日期 : 基金项目 : 基于遗传与环境的穿心莲品质保障技术示范研究 (2012B29B02) 作者简介 : 王晓云 (1971 ), 女, 副教授, 主要从事中药资源与分子生药学研究 : (0791) : wx200002@uno * 通信作者钟国跃, 研究员, 主要从事中药资源质量评价与民族药研究 : (0791) : z1037@163o

2 3728 中草药 n on n b u 第 46 卷第 24 期 2015 年 12 月穿心莲 no nu (Bu ) 为爵床科一年生草本植物, 有清热解毒抗炎消肿止痛作用穿心莲内酯是穿心莲的主要活性成分, 属于二萜类化合物, 国内已经利用穿心莲内酯开发出多种中药产品, 包括天津天士力制药股份有限公司研制开发的穿心莲内酯滴丸哈药集团三精制药股份有限公司生产的穿琥宁注射液等, 这些中药制剂在避免滥用抗生素方面发挥了一定的作用 [1] 穿心莲属于热带植物, 原产于印度半岛和斯里兰卡, 由于其野生资源匮乏和重要的药用价值, 在印度斯里兰卡等被列为严禁出口的保护物种我国的穿心莲系外来引种栽培物种, 药用首见于岭南采药录 (1932 年 ), 以春莲秋柳之名记载 [2], 引种栽培至少已有 80 余年的历史, 现广西广东福建海南安徽四川陕西等省份均有种植, 除作药材外, 也用作穿心莲内酯的生产原料然而, 有研究表明, 不同产地穿心莲药材质量差异显著, 穿心莲内酯的量相差 5~6 倍 [3] 另一方面, 由于各地引种穿心莲的种源单一, 穿心莲严格的自花授粉特性也阻碍了其遗传物质交流, 使得我国穿心莲的种质遗传多样性水平很低 [4], 种群适应性较弱另外, 上述各穿心莲种植地的生态环境也存在较大的差异, 提示穿心莲中穿心莲内酯的量系受到穿心莲内酯体内生物合成水平和产地生态因子的双重影响因此, 探讨穿心莲内酯的生物合成途径, 具有重要意义穿心莲内酯在穿心莲的茎叶片和根系培养物中均可合成 [5-8] 研究表明, 穿心莲内酯的生物合成有 2 条途径, 一条为甲羟戊酸 (on,) 途径, 定位在细胞质中 ; 另一条为 2-- 甲基 -- 赤藓糖醇 -4- 磷酸 (2----o-4-o,) 途径, 发生于质体中在这 2 条途径中, 香叶基香叶基焦磷酸 (nn o,) 是穿心莲内酯合成的前体, 它是在香叶基香叶基焦磷酸合成酶 (nn o n, ) 的作用下, 由法尼基焦磷酸 (n o, ) 加上一个异戊烯基焦磷酸 (onn o,) 基团后产生的有学者克隆了基因的片段, 进一步检测结果表明, 基因的表达量与穿心莲内酯的合成量呈现高度正相关 [9] 本研究利用技术, 从穿心莲中克隆了基因的全长序列, 并研究其在穿心莲茎叶发育不同阶段的表达情况, 为穿心莲内酯合成途径的调控奠定基础 1 材料与仪器 11 材料 2015 年购买穿心莲种子,6 月份种植在江西中医药大学神农园中, 长成植株后, 经江西中医药大学钟国跃研究员鉴定为爵床科植物穿心莲 no nu (Bu ) 12 仪器扩增在 Bo 仪 (1000 ou) 上进行, 在 Bo 化学发光成像系统 (ox + ) 上检测扩增条带连接产物的电击转化在 BX 电穿孔仪 (n u X) 上进行基因表达分析在 Bo 7 - 上进行 13 试剂 B 25 - β- 巯基乙醇氯仿异戊醇等总提取所用化学试剂以及核酸电泳所用试剂均为分析纯, 购自生工生物工程 ( 上海 ) 股份有限公司胶回收试剂盒购自上海捷瑞生物工程有限公司 o 逆转录试剂盒 (no n 2) o Un B n 购自南昌东湖强生生物试剂经营部 B n 染料扩增试剂盒克隆载体连接酶大肠杆菌菌株 x 聚合酶等其他分子生物学试剂均购自宝生物工程 ( 大连 ) 有限公司产物和阳性单克隆测序由北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司完成所有引物均由苏州泓迅生物科技有限公司合成 ( 表 1) 2 方法 21 总的提取 [10] 取穿心莲植株地上部分, 按文献方法提取总, 用 1% 琼脂糖凝胶电泳检测提取产物, 用于克隆全长基因采用 o 逆转录试剂盒 (no n 2) 获得, 每个样品的总体积 20 μ 首先在 12 μ 总中加入 1 μ no-oo()18, 轻轻混匀后, 在 65 反应 10 n; 然后再加入 4 μ Bu,05 μ nbo,2 μ x,05 μ 反转录酶, 轻轻混匀, 在 55 放置 30 n 后, 转为 85 反应 5 n,4 终止反应

3 中草药 n on n b u 第 46 卷第 24 期 2015 年 12 月 3729 表 1 克隆基因所用的引物 b 1 u n n onn 引物用途引物名称引物序列 (5 3 ) [8] 扩增保守区段扩增 3 和 5 端 U on U o B 22 克隆保守区段 [11] 按照文献方法进行 2 轮扩增, 反应总体积 200 μ, 包括产物 10 μ,10 x q bu 20 μ, x(10 o/)16 μ, 上下游引物 ( 第 1 轮为 -2 和 -2, 第 2 轮为 -1 和 -1,10 μo/) 各 5 μ, xq 03 μ 和 51 μ 2 O 第 1 轮扩增条件为 95 5 n;94 1 n,30 3 n, 72 1 n,20 个循环 ;72 10 n 第 2 轮扩增条件为 95 5 n;94 1 n,30 3 n,72 50,35 个循环 ;72 10 n 反应结束后, 用 1% 琼脂糖凝胶电泳检测产物切胶回收清晰的条带后, 进行测序 23 反转录获得按照扩增试剂盒说明书, 制备 5 和 3, 分别用于 5 和 3 反应在配制反转录体系 [12] 时, 根据文献方法使用了海藻糖 (o) 和甜菜碱 (bn), 因而对说明书中的反转录体系略加改动 24 配制引物工作液 U 引物需要配制成 10 倍混合液先把 U on 和 U o 引物稀释成 10 μo/, 取 U on 引物 4 μ,u o 引物 20 μ, 最后加入 76 μ 灭菌水, 混合即成 10 U 引物工作液其他引物均配制成 10 μo/ 工作液 25 3 反应采用巢式扩增 3 端序列在第 1 轮扩增反应中, 首先配制总体积为 405 μ 的 x, 由 345 μ 2 O 50 μ 10 n 2 bu 10 μ 50 n 2 o x 组成然后在 x 中分别加入 25 μ 3 和 50 μ 10 U 引物, 使得总体积达到 500 μ 扩增条件为 94 30,72 3 n,5 个循环 ; 94 30,70 30,72 3 n,5 个循环 ; 94 30,68 30,72 3 n,25 个循环 ;72 10 n 将第 1 轮产物用稀释 50 倍, 取 25 μ 用作模板, 分别加入 415 μ x,10 μ 5 引物 (10 μo/) 和 --3 引物 (10 μo/), 总体积 500 μ, 进行第 2 轮扩增条件为 ;68 30,72 3 n,20 个循环 ;72 10 n 反应结束后, 用 1% 琼脂糖凝胶电泳检测产物切胶回收清晰的条带后, 进行克隆, 筛选阳性单克隆后测序 26 5 反应使用 x 聚合酶进行 2 轮巢式扩增第 1 轮扩增的反应总体积为 500 μ, 包括 25 μ 5,250 μ 2 x bu( 2+, u),10 μ x o(125 U/μ),05 μ 10 U 引物,10 μ 引物 (10 μo/) 和 155 μ 2 O; 第 2 轮扩增的反应总体积为 500 μ, 包括 10 μ 第 1 轮反应液,250 μ 2 x bu( 2+, u),10 μ x o(125 un/μ),10 μ 5 引物和引物 (10 μo/),210 μ 2 O 2 轮扩增条件均为 94 1 n;98 10,55 15, 68 1 n,30 个循环反应结束后, 用 1% 琼脂糖凝胶电泳检测产物

4 3730 中草药 n on n b u 第 46 卷第 24 期 2015 年 12 月切胶回收清晰的条带后, 进行克隆, 筛选阳性单克隆后测序 27 基因的拼接扩增和生物信息学分析利用 oono n 软件进行序列拼接根据拼接后的序列, 设计两侧引物, 从穿心莲中进行全长序列的扩增用 1% 琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物切胶回收清晰的条带后, 进行克隆, 筛选阳性单克隆后测序 Bo 软件进行开放阅读框 (on n,o) 编码氨基酸序列的翻译,B 网站上的 on on 程序 (://www nbnno/uu//wb) 进行保守结构域分析,B 程序 (://wwwnbn n o/b/) 做同源性搜索采用 o 软件 (://uxo/oo/o) 计算蛋白质的相对分子质量和等电点, 预测一级结构采用软件进行蛋白质的多序列比对, 606 软件构建系统进化树用 oo 11 软件 (://wwwbu//oo/) 鉴定蛋白质的叶绿体定位信号序列 28 基因表达分析在花蕾期初花期花果混合期青果期, 分别取穿心莲植株的地上部分, 分离茎和叶, 分别提取总, 用于基因表达分析每个时期各取 3 株总提取和反转录方法同上采用 B n 染料法, 进行实时荧光定量 - 反应, 总体积为 10 μ, 基因的扩增引物为和 5 --3, 预期产物大小为 207 b; 根据穿心莲 18 核糖体基因序列 (nbn:j ) 设计内参引物和 , 预期产物大小为 125 b 扩增程序是 n;95 15,60 30,72 30,40 个循环 ; 熔解曲线是 95 15,60 1 n,95 15 每个模板每次扩增 3 个复孔实验重复 3 次, [13] 采用比较值法在 x 软件上分析相对表达量, 通过单因素方差分析检验数据的差异显著性 3 结果与分析 31 总提取利用无液氮法, 提取获得了质量较好的穿心莲总 ( 图 1) b b 750 b 500 b 250 b 100 b 总 1-o 图 1 穿心莲总 1 o x o nu 32 保守区段扩增和保守区段扩增后, 经琼脂糖凝胶电泳检测产物, 略小于 500 b 处有一条带回收后, 直接进行测序, 获得 408 b 保守区段采用巢式进行 3 扩增, 在 500 b 左右各有一条带 ; 采用巢式进行 5 扩增, 在约 1 b 处有条带根据结果, 利用两侧引物进行扩增后, 获得一条长 b 的序列, 包含一个由个核苷酸组成的基因的完整开放阅读框, 编码 1 条由 348 个氨基酸组成的蛋白质序列 ( 图 2) 33 基因生物信息学分析 o 软件分析结果表明, 蛋白的肽链由 20 种氨基酸组成, 分子式为 O , 理论相对分子质量为 , 等电点 () 为 518, 其中 (124%) 和 u(%) 量较高,(03%) (14%) 和 n(17%) 量较低分别为 43 个 (124%) 和 1 个 (03%) 带负电荷的氨基酸 (+u) 共 49 个, 带正电荷的氨基酸 (+) 有 36 个不稳定指数 4391, 表明属于不稳定蛋白质总平均疏水指数为 0078 保守结构域分析结果表明 ( 图 3), 蛋白序列中包含 1 个反式 - 类异戊烯基焦磷酸合成酶 (n-on o n) 超家族的保守结构域亚细胞定位分析结果表明, 基因所编码氨基酸序列的端包含 1 个由 47 个氨基酸构成的信号肽序列, 可能定位于叶绿体或其他质体中序列比对结果表明, 蛋白序列的端保守性较低, 中间部分和端保守性高 ;133~149 位和 266~278 位分别是 2 个多聚异戊二烯基合成酶的特异序列 n 和 - ( 图 4)

5 中草药 n on n b u 第 46 卷第 24 期 2015 年 12 月 3731 图 2 基因编码的氨基酸序列 2 no qun o n 图 3 基因所编码氨基酸序列的保守结构域 3 u on on o n non no qun 用最大似然法 (xu oo) 构建系统发育树, 结果表明, 穿心莲中的蛋白与已报道的长春花 (nu ou) 的蛋白亲缘关系较近 ( 图 5) 34 基因表达分析实时荧光检测结果表明 ( 图 6 7), 基因在穿心莲茎和叶片中的表达量有相似的趋势花蕾期表达量较高, 初花期降低 ; 到了花果混合期表达量升高, 青果期下降表明花蕾期和花果混合期相关代谢成分的合成可能更活跃单因素方差分析结果表明, 无论是在茎还是在叶片中, 基因在各发育阶段的表达量差异均不显著 4 讨论穿心莲内酯大量用作医药原料药提高穿心莲中的穿心莲内酯的量能够节省成本, 提高药效研究表明, 进行穿心莲的细胞培养时, 在施加 5 μo/ 茉莉酸甲酯 (J) 的培养物中, 等 3 个基因的表达量大幅度提高, 穿心莲内酯的生物合成量也提高了 5 倍, 表明这 3 个基因高度影响了穿心莲内酯的生物合成, 是合成途径中的关键基因 [7] 因此, 本研究克隆的基因, 对于今后采取基因工程手段生产穿心莲内酯, 具有一定的利用价值人们已经从辣椒番茄西瓜丹参烟草和银杏等植物中, 分离到了基因, 它们在萜类合成途径中起重要的作用, 能够催化合成 [14] 有些植物的基因还具有双功能, 例如, 挪威云杉中的基因, 它可以催化合成香叶基焦磷酸 (n o,) 和 2 种产物 [15]

6 中草药 n on n b u 第 46 卷第 24 期 2015 年 12 月 3732 长春花 (951) 金鱼草 (828601) 丹参 (Z556811) 巴西橡胶树 (9471) 蛇麻 (906821) 欧榛 (B069601) 欧薄荷 (087931) 芒果 (J7221) 长春花 (951) 金鱼草 (828601) 丹参 (Z556811) 巴西橡胶树 (9471) 蛇麻 (906821) 欧榛 (B069601) 欧薄荷 (087931) 芒果 (J7221) 长春花 (951) 金鱼草 (828601) 丹参 (Z556811) 巴西橡胶树 (9471) 蛇麻 (906821) 欧榛 (B069601) 欧薄荷 (087931) 芒果 (J7221) 长春花 (951) 金鱼草 (828601) 丹参 (Z556811) 巴西橡胶树 (9471) 蛇麻 (906821) 欧榛 (B069601) 欧薄荷 (087931) 芒果 (J7221) 长春花 (951) 金鱼草 (828601) 丹参 (Z556811) 巴西橡胶树 (9471) 蛇麻 (906821) 欧榛 (B069601) 欧薄荷 (087931) 芒果 (J7221) 长春花 (951) 金鱼草 (828601) 丹参 (Z556811) 巴西橡胶树 (9471) 蛇麻 (906821) 欧榛 (B069601) 欧薄荷 (087931) 芒果 (J7221) 长春花 (951) 金鱼草 (828601) 丹参 (Z556811) 巴西橡胶树 (9471) 蛇麻 (906821) 欧榛 (B069601) 欧薄荷 (087931) 芒果 (J7221) 下划线部分表示多聚异戊二烯基合成酶的特异序列 o on on o o n o n unn 图 4 穿心莲基因编码氨基酸的序列比对 4 oon on no qun no b o nu 在动物体内, 是合成大量生物活性分子的前体, 基因参与了多种蛋白质翻译后的修饰过程, 是癌症神经退行性疾病和心脑血管疾病等疾病的潜在治疗靶点 [16-17] 进一步对植物基因的功能进行精细研究, 发掘该基因在植物体内潜在的作用很有意义 n n n q q

7 中草药 n on n b u 第 46 卷第 24 期 2015 年 12 月 3733 图 5 穿心莲与其他植物蛋白的系统进化树 5 on o on n nu n o n 图 6 基因在穿心莲茎片中的表达 6 n xon n o nu 相对表达量相对表达量花蕾期长春花金鱼草丹参欧薄荷穿心莲巴西橡胶树蛇麻欧榛芒果初花期花果混合期青果期花蕾期初花期花果混合期青果期图 7 基因在穿心莲叶片中的表达 7 n xon n o nu 本研究从穿心莲中克隆了基因, 长 b, 编码 1 条由 348 个氨基酸组成的蛋白质序列, 与长春花的蛋白亲缘关系较近它的端包含 1 个由 47 个氨基酸构成的信号肽序列, 可能定位于叶绿体等质体中与叶片相比, 基因在穿心莲的茎中表达更稳定茎和叶片中, 花蕾期表达量较高, 初花期降低 ; 到了花果混合期表达量升高, 青果期下降表明花蕾期和花果混合期相关代谢成分的合成可能更活跃上述研究为进一步开展穿心莲内酯合成途径的调控奠定了基础志谢 : 样品采集工作由中国中医科学院中药资源中心道地药材国家重点实验室完成参考文献 [1] 畅娜, 王学民天然抗生素穿心莲内酯 [J] 自我药疗, 2014(10): [2] 谢宗万常用中药名与别名手册 [] 北京 : 人民卫生出版社, 2001 [3] 陈蓉基于遗传与环境的穿心莲品质研究 [] 北京 : 北京中医药大学, 2015 [4] 陈蓉, 王晓云, 宋毓宁, 等基于和分子标记的国内穿心莲遗传多样性分析 [J] 中国中药杂志, 2014, 39(23): [5], J Z, n bn o n o nou oo uu n n o noo n no nu [J] o oun, 2013, 8(8): [6] o, n B oon n non o bo ooun n no nu (unxnn) [J] n, 2010, 5(1): [7] 陈娟, 谷巍, 段金廒, 等不同生长期穿心莲活性成分及关键酶基因差异表达研究 [J] 中草药, 2014, 45(21): [8] 靳鑫, 时圣明, 张东方, 等穿心莲化学成分的研究 [J] 中草药, 2012, 43(1): [9], J Z, n, Jon-nu bon o noo n no nu [J] o n, 2015, 153(2): [10] 沈文飚, 汪仁, 王益华, 等从水稻种胚中提取的新方法 [J] 遗传, 2003, 25(2): [11] 张蕾, 戴住波, 崔光红, 等丹参牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶基因的克隆与分析 [J] 中国中药杂志, 2009, 34(21): [12] no, nb u o n-ou n o -w-b 5 on o n [J] n Bo, 2010, 397(2): [13] J, n n o n xon un - qun n 2 ( ()) o [J] o, 2001, 25(4): [14] 吕品, 李娜, 谷辉辉, 等西瓜牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因的克隆及表达分析 [J] 生物技术, 2014, 24(2): [15], ä B, U, bunon n n nn o n no n n oon oon n b [J] n o, 2010, 1(2): [16] J,, Bu, un ono n nz u [J] on, 2014, 2: [17] J,, o J nn o n: n n u [J] n o, 2011, 90(6):

材料! 方法! # 基因的扩增及其序列分析

材料! 方法! # 基因的扩增及其序列分析生物技术通报黄艳燕黄靖华卢福芝孙靓彭立新周兴黄日波利用的方法从鼠李糖乳杆菌基因组中扩增到乳酸脱氢酶基因并连接到载体上构建表达质粒将重组质粒转化大肠杆菌重组菌株经诱导表达电泳分析表明在大肠杆菌中实现了表达表达产物的分子量约为同时采用紫外分光光度法测定乳酸脱氢酶的酶活测得重组菌株的乳酸脱氢酶活力为最适反应温度为最适乳酸脱氢酶克隆表达鼠李糖乳杆菌