中 国 畜 牧 兽 医 卷 ' '0 70%70%780-$%% %007%%87%9 0$* "07%%87%9$%% %!"#,( 7 '0 8 %',0 % 树闙 07%%87%9$ * 是一种生长在热带 亚热带地区 外形似松鼠的小型哺 乳动物 在分类上隶属于哺乳纲 攀闙目 根据遗传进化分析

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1 中国畜牧兽医! " # 树闙 基因 克隆 组织表达谱及生物信息学分析 李元吉 杨明华 刘 芳 朱方方 和绍禹 匡海鸥 李亚辉 云南农业大学动物科学技术学院 昆明 云南农业大学食品科学技术学院 昆明 摘 要 本研究旨在克隆出树闙 $ % 基因!"# 的全长序列 阐明其组织表达谱及基本生物信息学特征 以 $% &' 中收录的树闙 $ % 基因 "# 预测序列为参考设计特异性引物 对树闙 $ % 基因的!"# 全长序列进行克隆 用实时荧光定量 检测该基因在树闙不同组织中的表达情况 并对!"# 序列的! 区核苷酸序列与蛋白质结构进行了生物信息学分析 结果显示 树闙 $ % 基因!"# 的! 区序列长度为 ( 编码 个氨基酸 $ % 基因仅表达于树闙睾丸组织 对树闙和其他 种哺乳动物 $ % 基因!"# 的! 区核苷酸序列构建的系统进化树显示 树闙与人 黑猩猩 恒河猴 种灵长类动物亲缘关系较近 与小鼠 大鼠 金仓鼠 种啮齿类动物亲缘关系较远 本研究为进一步研究树闙 $ % 基因的功能奠定了基础 关键词 树闙 $ % 基因!"# 克隆 生物信息学 实时荧光定量 中图分类号 文献标识码 # 文章编号 **!""#$%&' $""$" ( *"" $$! $$,- $" ' #"$ ' ' 3' ' 3 '- #"$ 3' ' &'#!## $##! (! & '## $##! (! "%78%0880-9'80, %0%,,% 0!"# 07%%87%98$% % %0%, '0%08088%%7%88 7,%8' ' % 0',( 7 '0 ', '7' 0% %7%8% 080-0%,,% 0!"#07%%87%98$%% %9'8, %908% 7 %78 0%('887% 0% "#8%;%%07%%87%98$%% % $% &'0% "#%7%88 $%% %'7807%%87%98088%89'8%80'0%( %',0 % '0 0%( 7 '0 8,%0%8%;%%! 7% 88!"# 07%% 87%9'89%,'80'0 %70% %'(%% ' ',- %%7%8,0889%0'0%! 7% 07%%87%9888!"#0' % (% '' 8$%% %8% ',-%7%88% 07%%87%980%808&'8% 0%,%,'7-,% %0 07%%807 0% 90! 88!"#'07%%87%9' 0%7%0 '',' 8% %809'8 %77% 0'007%%87%9 9'8% %0 ',-,8%07 '0%8, % ' '%%' 7%88 %- 9,%09'8% %0 ',-'707% 08, % 8%7'0',% ' 80%7880-9,,'- 收稿日期 * 基金项目 国家自然科学基金 云南中科灵长类生物医学重点实验室开放基金 云中科字 号 国家自然科学基金专项基金 作者简介 李元吉 * * 男 河南叶县人 硕士生 研究方向 动物生殖生物学 ',-',%%0 ', 杨明华 * 女 云南陇川人 硕士 实验师 研究方向 动物分子营养与代谢调控 ',-' 0 ', 李元吉与杨明华对本文具有同等贡献 并列为第一作者 通信作者 李亚辉 * 男 云南武定人 博士 教授 研究方向 动物生殖与发育生物学 ',,-

2 中 国 畜 牧 兽 医 卷 ' '0 70%70%780-$%% %007%%87%9 0$* "07%%87%9$%% %!"#,( 7 '0 8 %',0 % 树闙 07%%87%9$ * 是一种生长在热带 亚热带地区 外形似松鼠的小型哺 乳动物 在分类上隶属于哺乳纲 攀闙目 根据遗传进化分析 树闙是一种比小鼠 大鼠等啮 齿类动物更接近于灵长类的小型哺乳动物 树闙具有较高的研究价值 由于树闙具有体型 小 易饲养 生长周期短 成本低廉等优点 已成为一种不可或缺的试验动物 并有望成为取代 大型珍贵灵长类动物的模型动物 目前 树闙 研究主要涉及树闙的遗传多样性 树闙的多种 * 人类疾病模型 树闙精子冷冻等 树闙 $ % 基因的研究将为进一步研究其功能及其对树闙的生殖调控机制奠定基础 88 是睾丸特异性丝氨酸 苏氨酸蛋白激酶家族 0%8088% 8%7 %07%% '8% 88 成员之一 它特异表达于精子和 或睾丸组织中 对精子的发生和精子功能的调节可能有极 其重要的作用 因此倍受研究者关注 88 也被称为 8 ',8%7 %07%%'8% 由 3' 等及 7 等通过对人类和小 鼠的基因组 & # 搜索发现 等的研究结果表明 $ % 基因表达于精子发生后期 并主要在染色质浓缩的精子细胞中表达 吴昊天 等研究发现 88 蛋白存在于人精子头部的 顶体内部及精子尾部 7 等研究发现定向敲除小鼠 $ % 基因将会使小鼠精子形成期的转型蛋白替代组蛋白过程中发生!"# 凝缩障碍 从而导致精子的形态和运动性受损而致雄性 小鼠不育 苏丹等研究结果表明 $ % 基因的突变与男性不育同样有密切关系 此外 8 等 研究结果表明 88 通过改变 蛋白的重新定位和调节肌动蛋白聚合作用来参与小鼠精卵融合过程 敲除 $ % 基因的小鼠其精子在顶体反应过程中 蛋白不会发生迁移 从而无法完成受精过程 由此可见 $ % 基因对哺乳动物的生殖有重要影响 然而 目前国内外关于树闙 $ % 基因的研究尚未见报道 本研究以性成熟的树闙为材料 对树闙 $ % 基因的!"# 全序列进行了克隆 并对其进行生物信息学分析 检测了该基因在树闙不同组织中的表达情况 材料与方法 材料 本试验所用试验动物为性成熟的树闙 由昆明医科大学实验动物中心提供 "#8,8 购自宝生物工程 大连 有限公司!"# '7 %7 反转录试剂盒 琼脂糖凝胶!"# 回收试剂盒 克隆试剂盒 大肠杆菌!3 感受态细胞均购自天根生化科技 北京 有限公司 3 %,0- '80%7 购自昆明硕擎生物科技有限公司 琼脂糖购自 07% 公司 & ' 实时荧光定量 仪 "# 提取所用的水为! 处理水 总 提取及反转录 按照 "#8,8 说明书操作 将用液氮处理过 保存的树闙睾丸取出 解冻后将其剪成小块 在加有液氮的研钵中研磨成粉末 然后用 "#8,8 提取睾丸组织中的总 "# 按照反转录试剂盒说明书进行!"# 链合成 合成的!"# 于 保存备用 引物设计与合成 根据 $% &' 收录的树闙 $% 基因的 "# 预测序列 登录号 * 使用 7 %7 7% %7 和 <, 软件设计一对 $% 基因的特异性引物 引物序列为 = # $ $$ ## # = =$ $ ## $ $ = 扩增产物包括 $ % 基因的整个! 区 用于实时荧光定量 的 #! 基因特异性引物 = ### $$$# $# #$ = =## #$$ $$$$$$# = $ % 基因特异性引物 = $# ### $#$ $##= =# # $#$##$# #$# = 引物均由昆明硕擎生物科技有限公司合成 目的基因扩增 克隆及测序 以合成的!"# 为模板进行 扩增 反应体系 3 %,0- '80%7, 上 下游引物各!"# 模板 3 < 反应条件 * 预变性 * 变性 8 退火 8 延伸 8 个循环 最后 延伸 反应结束后取 产物进行 > 琼脂糖凝胶电泳检测分析

3 期 李元吉等 树闙 $ % 基因!"# 克隆 组织表达谱及生物信息学分析 扩增产物用 > 的琼脂糖凝胶电泳纯化回收 具体操作按照琼脂糖凝胶!"# 回收试剂盒说明书进行 回收产物按照克隆试剂盒说明书进行连接转化 用含有 > 氨苄青霉素的 & 平板培养基进行筛选 然后挑取菌落使用含有 > 氨苄青霉素的 & 液体液体培养基扩大培养 用菌液 法进行检测 检测为阳性的菌液送至昆明硕擎生物科技有限公司进行序列测定 树闙 基因组织表达特异性分析以 #! 基因为内参 & 为荧光染料 采用实时荧光定量 检测树闙 $ % 基因在大脑 胸腺 心脏 肝脏 脾脏 肺脏 肾脏 肌肉 睾丸 卵巢 种组织 器官中的相对表达量 实时荧光定量 反应体系 模板!"# '80 7% ; 7% 上 下游引物, 各 加 3 < "'8%7%% 至总体积 实时荧光定量 反应条件 * 预变性 * 变性 8 退火 8 延伸 8 共 个循环 每个试验重复 次 生物信息学分析将得到的测序结果使用 %; ' 进行校正和拼接得到树闙 $% 基因!"# 的全长序列 使用 '8%7% % 软件对所得序列与预测的树闙 88 "# 序列进行同源性比对 人工校对获得开放阅读框 < 同时将所得序列使用 0 %; 翻译成 氨基酸序列 最后将所得的树闙 $% 基因!"# 的! 区全长序列提交到 $% &' 将获得的树闙 $% 基因!"# 的! 区全长与从 $% &' 中公布的人 黑猩猩 恒河猴 猪 狗 小鼠 大鼠 金仓鼠 个物种的 $% 基因 "# 的! 区全长进行比对分析 通过 %' 软件用 法 法和 "? 法构建系统进化树 置信度用 &0807' 检验 重复次数为 利用 # %'8-70,8 中的 70 '7' 推测序列的氨基酸组成 蛋白质分子质量 等电点 稳定性和亲水性等 使用 "% (80 8%7%8"%0 8 预测磷酸化位点 利用 ', 0999 (80 8%7%8', 预测信号肽 使用 3 %7 % (80 8%7%8 3 预测跨膜结构 利用 <# 08 8'7'(( 7 ( 8% 7% 8 ', 预测蛋白质二级结构 %,%'8-7 进行蛋白质三级结构预测 结 果 树闙 基因扩增结果 $% 基因 扩增产物经 > 的琼脂糖凝胶电泳检测 结果显示获得大小为 *( 的扩增产物 目的条带清晰 明亮 图 与预期结果相符!!"# '7 %788 扩增产物!!"# '7 %7' 图 基因 扩增结果电泳图 (' $"# " $$ 基因序列对比树闙 $% 基因!"# 的! 全长为 ( # $ 的碱基数分别是 个 分别占总碱基数的 > >> 和 > 与预测的树闙 88 "# 的! 区全长进行比对 比对结果显示二者的同源性为 ** > 预测的序列比克隆测序得到的序列多 ( 图

4 (00 中!国!畜!牧!兽!医 图!!3 N'*, 克隆序列与预测序列对比结果 0 < 0 >=0>9 > > O 0 <3 N'*, 卷!

5 !* 期 李元吉等$树闙 7( 基因,3 克隆(组织表达谱及生物信息学分析!I &!!" "#' 基 因 核 苷 酸 序 列 和 编 码 蛋 白 质 氨 基 酸 序列同源性比对结果 利用软件 J9 V 7 I7-7 对 树 闙(人(黑 猩 猩(恒 河 (0* 为??'?b &B%'?b!编 码 的 氨 基 酸 序 列 同 源 性 为 B(' b &B?' 0b ' 根 据 树 闙 7( 基 因,3 的 =3> 区 序 列 与 从 中 获 得 的? 个 物 种 的 猴(猪(狗(小 鼠(大 鼠(金 仓 鼠? 个 物 种 的 TV V( ; 的 =3> 区核苷酸及 其编码的 氨基 酸序 列使 7( 基因,3 的 =3> 区序 列 同 源 性 比 对 结 果! 使用 * 种 方 法 "c 法(MC 法(MJ 法 #构 建 核 苷 酸 用 =D FV 9 Dd 法 进 行 比 对!结 果 见 图 *( ' 树 闙 与 分子系统进化树!结 果 见 图 ' 由 图 可 知! *种方 人(黑 猩 猩(恒 河 猴(猪(狗(小 鼠(大 鼠(金 仓 鼠 的 法所构建的系统进 化 树 均 显 示 树 闙 与 人(恒 河 猴 等 7( 基 因,3 的 =3> 区 的 核 苷 酸 序 列 同 源 性 灵长类的亲缘关系更接近' 图 &! 树闙与其他物种!" "#' 的 -*D 区核苷酸序列同源性 M &! > = <-*D 0 <!" "#' 0 =@0 B 图 %! 树闙与其他物种!" "#' 的 -*D 区编码蛋白质的氨基酸序列同源性 M 0 = <-*D 0 <!" "#' 0 =@0 B

6 (0 中!国!畜!牧!兽!医 卷!!c法& 8!MC 法! =!MJ 法!c7 G#"& 8!MC 7 G#"& =!MJ 7 G#" 图 K! 分子系统进化树 MK!P = 9B 0!I %!!" "#' 基 因 在 树 闙 #" 种 组 织#器 官 的 差 异 表 达结果 基因在树闙不同 组 织 中 的 表 达 情 况!包 括 脑(胸 腺( 采用 $! % 3 # $ 基因作为 参 照 基 因! >8; 为 荧 光 染料!采 用 实时荧光定 量 <=; 法 分别检测 了 7( 组织%器 官!结 果 表 明! 7( 基 因 特 异 表 达 于 睾 丸 心脏(肝脏(脾脏(肺脏(肾脏(肌肉(睾丸(卵巢 %& 种 组织中!在其他组织中无表达"图 (#'

7 !* 期 李元吉等$树闙 7( 基因,3 克隆(组织表达谱及生物信息学分析 (0 图 '! 树闙!" "#' 基因的组织表达 89 0 <!" "#' 0 0 F!I K! 树闙!" "#' 基因编码蛋白质功能结构分析 用 CX<>< # <9 9 软件预测树闙 7( 基因 =3>区共编码的 0* 个氨基酸!由 0& 种氨基酸组成! 氨酸" T #磷酸化位 点" %0 和 0*#'> $ D <' % I-9 预测 TV 蛋白不 含 信 号 肽! 属 非 分 泌 蛋 白' V( TM! 分子质量为 *&' 0BF!理论等电点" K#为B' *&& TV V( QMM >7 Z7 预 测 TV V( 蛋 白 无 跨 膜 区 域' 二 级 结构预测结果显示 TV V( 蛋白二级结构中含 有"!螺 蛋白不稳定系数为 *' B*!属于 不 稳 定 蛋 白&脂 溶 指 旋(伸 展 链(!转 角 和 无 规 则 卷 曲!占 比 分 别 为 $ 数为 B%' &*!总 亲 水 性 平 均 系 数 " 9-"9Z7 9I7# R I 0' %%b ( 00' %b ( %' &0b 和 *' %(b!因 此 TV V( 蛋白属于 混 合 型 蛋 白' 将 获 得 的 树 闙 TV V( 的 氨 0*!属 于 亲 水 性 G" #9 G $, $!;e#为 ]&' 蛋白'7 <G# V0' & 预 测 TV V( 蛋 白 存 在 %* 个 磷 酸化位点!其中 %& 个丝氨 酸" >7 #磷 酸 化 位 点"?( 00( *%((0(%(%B(0%(0%(0* 和 0#! % 个苏氨酸" TG#磷 酸 化 位 点" *&#! 0个酪 基酸序列提交到 >dk>>!m`3cj!得 到 TV V( 的 三 级结构预测模型!其中 $!折叠区 有 B 个!!螺 旋区 有 " %* 个"图 #' 图 $! 树闙 3 N' 蛋白三级结构预测 M$!; > > = <3 N'9 0 B &! 讨! 论 迄今为止!已鉴定并克 隆 出 7 基因家族的 个成员!即 TV V%(TV V0(TV V*(TV V 和 TV V(' TV V( 作为一个与 生 殖 相 关 的 重 要 成 员!特 异 表 达 于睾丸组织和%或动物雄性生殖细胞中!并主要在精

8 中 国 畜 牧 兽 医 卷 子发生的减数分裂后期表达 可能参与精子发生的 调节过程 7 等研究结果也表明 88 是减数分裂后染色质重塑的必要条件 目前 只有小鼠 大鼠 猪 人等少数物种的 $% 基因被克隆报道 本研究克隆出了树闙 $% 基因!"# 全长序列 包含了 $% 基因 "# 的整个! 区 共有 ( 个碱基 编码 个氨基酸 #$ 和 #$ 碱基分别为! 区的起始和终止密码子 这表明在目的基因扩增和测序中碱基装配没有产生错义突变致使氨基酸序列编码中断 测序所得树闙 $% 基因!"# 的! 区全长和已发表物种的 $% 基因 "# 的! 区长度相同 且同源性高 具有很高的可信度 但克隆测序所得的树闙 $% 基因!"# 的! 区核苷酸序列与 $% &' 中预测的树闙 $% 基因 "# 的! 相比少 ( 其原因可能是由于预测序列中! 区多预测了一段内含子 88 在哺乳动物中高度保守 且在非哺乳类 动物的基因组中没有其同源物存在 树闙与人 黑猩猩 恒河猴 猪 狗 小鼠 大鼠 金仓鼠的 $% 基因!"# 的! 区的核苷酸序列同源性在 > 以上 编码的氨基酸序列同源性在 * > 以上 表明 $% 基因在这 种动物中的保守性很高 同源性在一定程度上反映物种之间亲缘关系的远近 使用邻接法 最小进化法和最大似然法 种方法构建 88 核苷酸序列系统进化树 种方法构建的系统进化树十分接近 树闙外形虽然接近小鼠 大鼠 松鼠等啮齿目动物 但根据系统进化树可判断出树闙与人 黑猩猩 恒河猴等灵长类的亲缘关系更 接近 这与前人研究结果一致 对树闙 $% 基因!"# 的! 区序列编码的氨基酸序列进行生物信息学分析 预测结果表明 88 蛋白由 种氨基酸组成 理论等电点 为 * 分子质量为 * 为不稳定蛋白 且具有亲水性 有 个磷酸化位点其中丝氨酸磷酸化位点 个 苏氨酸磷酸化位点 个 表明其在行使生理生化功能或与其他蛋白相互作用时可能需要磷酸化的活化 这与 88 蛋白是一种丝氨酸 苏氨酸蛋白激酶相吻合 且其无跨膜区域 这与 88 蛋白是细胞内蛋白 一致 有研究结果表明 88 特异表达于小鼠的睾丸组织中 在脑 心脏 胚胎 肾脏 肝脏 肺脏 肌肉 卵巢 脾脏 胸腺 种组织 器官的表达量极低 等使用半定量 法研究了猪的 88 家族基因在 种组织 器官中的表达情况 其中 88 在多种组织 器官中均有表达 但在睾丸组织中其表达量最高 远远高于甲状腺 盲肠 附睾 肺脏 脾脏等组织器官 本研究根据 &80 等和 0% 制定的荧光定量操作规则及判断标准对荧光定量结果进行处理分析 结果表明 88 特异表达于树闙的睾丸组织 在脑 胸腺 心脏 肝脏 脾脏 肺脏 肾脏 肌肉 卵巢 * 种组织 器官中的相对表达量为零 此结果与其他动物中的研究结果类似 但又稍有差异 88 作为一种睾丸特异性丝氨酸 苏氨酸蛋白激酶 其特异地表达于树闙睾丸组织表明其很可能对于精子发生 成熟有重要的作用 或对精子的受精功能有重要影响 本研究克隆并测序出树闙 $% 基因!"# 的! 全长序列 通过生物信息学手段对 88 序列进行了分析 获得了一些有关的 88 蛋白的理化特性 蛋白结构 系统进化等方面的基础数据 为进一步研究树闙 $% 基因的表达对树闙雄性不育的影响 88 蛋白的生物学功能及对生殖调控的机理奠定了基础 在 扩增试验中 相比前 个成员 88 使用一般的 $ 酶很难扩增出目的片段 必须使用高效的 $ 酶才能有效的扩能出目的片段 这可能是由于树闙睾丸内 $% 基因的表达 量低所导致 与 等研究发现在睾丸中 88 与 88 的表达量是 88 的 倍的结果相符 这有待于在后续研究中进行验证 结 论本研究首次对树闙的 $% 基因进行克隆 得到其! 全长序列 ( 编码 个氨基酸组成的蛋白 属于亲水性蛋白 蛋白无信号肽与跨膜结构 主要存在于细胞质中 且该基因特异表达于睾丸组织中 该结果为进一步研究树闙 88 的生物学功能奠定了理论基础 参考文献 沈培清 郑 红 刘汝文 等 中国树闙实验动物化研究进展和展望? 动物学研究 * '3' '%0',$%%0% %0',&'8',-8, ',' 7' %0%78 %80 '0%07%%87%98 $ * -

9 期 李元吉等 树闙 $ % 基因!"# 克隆 组织表达谱及生物信息学分析 #? ## * 李 贵 严 晔 常云艳 等 树闙实验室繁殖的新方法? 现代畜牧兽医 * 殷安国 匡德宣 李晓飞 等 树闙模型在人类病毒性疾病研究中的应用进展? 中国实验动物学报 * 杨香娣 曹 骥 杨 春 等 荧光标记微卫星分析广西树闙群体的遗传多态性? 中国畜牧兽医 * 徐 林 张 云 梁 斌 等 实验动物树闙和人类疾病的树闙模型研究概述? 动物学研究 ** 08 %0-, 8,%%0-,% %,-,7-,% %,-,',- %7,7-7%8%7 '0 9,07%%87%9 $ - * %8% ''%- ',8%7? ##* * 3@' %0',% 08 8 %%0% %78' '%8 8%7 7-7 %8%7 '007%%87%98 $ *? ##* 黄 实 苏金珠 李亚辉 睾丸特异性丝 苏氨酸蛋白激酶家族研究进展? 云南农业大学学报 自然科学 * 3'?' " 3%0',7%88 ' ',- 880% ' 0%8088% 8%7 %07%% '8%,%8# % (%787%8 % 0 0%%;'07',8% % 0 ' 8%7? " # *#! 7" #@%7'8 %0', % 0 '0 ''7' 0%7 '0 '8%7 %07% %70% '8%%88% 0',7 ',%%70,0-? # 0 3 8?&7'88'7 %0',7%88 ', ', '0 % % (%780%0%8088% 8%7 %'8%88 ',-8%' ' 8%7 ' 0%808? " # *#! 吴昊天 梁 磊 人类 和 88 在精子顶体反应前后的定位检测? 中国现代医学杂志 苏 丹 张思仲 $ 基因的突变筛查与男性不育的相关研究 # 中华医学会医学遗传学分会 中国遗传学会人类和医学遗传学委员会 第八次全国医学遗传学学术会议 中华医学会 * 年医学遗传学年会 论文摘要汇编 中华医学会医学遗传学分会 中国遗传学会人类和医学遗传学委员会 * 8? 7' ' 7 " #%0', 88 87%;7%7 7%, ', '0 ' ' %0% 80% 8%? ## * * 徐亦力 内含子类型与捻接机制? 自然杂志 * '-0%%, %%7'0' %0', %7%(7',7 '8,'7'7 0% 07% 0% 07%%87%9 $ *7% %',% (-,'80 778'808? "# # * # $#- %0',,8% ;%% '7' 0%7 '0 ' %7%88 '0%7 8 % (%780%7%',-?!" * ** &80#&% %8$'78?#%0',%B %, %8 7 '0 7(, '0 ;' 00'0 % %',0 % %%7 % 08? * 0%!'? # ',- %',0 % '0'(-0%'7'0 % %0?,!! # &3'?' %0',','0 '0%808 8% 8%7 %07%%'8% ',-' 0%8(807'0% C '807' %0 % 0'7%08? #! *#! '!! **! 责任编辑 董晓云

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