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三鲍
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1 第 34 卷第 2 期西南大学学报 ( 自然科学版 ) 2012 年 2 月 Vol.34 No.2 JournalofSouthwestUniversity (NaturalScienceEdition) Feb 文章编号 : (2012) 山羊 CD4 基因的克隆及组织表达分析郑双艳 1,2, 赵永聚 2, 许宝华 1, 王子龙 3, 李娟 4 1. 南昌大学实验动物科学部, 南昌 ;2. 西南大学动物科技学院, 重庆 ; 3. 江西农业大学动物科学技术学院, 南昌 ;4. 西南大学生命科学学院, 重庆摘要 :CD4 基因是质膜上的转运系统之一, 为动物辅助性 T 细胞 (TH) 和部分胸腺细胞的共受体与信号传导分子, 参与 TCR 介导的 TH 细胞活化和胸腺细胞分化过程. 该研究首次克隆了山羊 CD4 基因 (GenBank 登录号 : EU913093), 并分析了该基因的组织表达情况. 结果表明 : 所克隆的山羊 CD4 全长 cdna 序列为 1555bp, 开放阅读框 (ORF) 为 1368bp, 编码 455 个氨基酸的蛋白, 相对分子质量为 , 等电点为山羊 CD4 蛋白前体由信号肽胞外区跨膜区和胞浆区 4 个部分构成. 胞外区含有 4 个 Ig 样结构域,2 个二硫键 (C 41 C 109 和 C 143 C 180 ) 及 3 个 N 糖基化位点 (N 231,N 263 和 N 343 ). 氨基酸序列比对表明山羊 CD4 与绵羊 CD4 的氨基酸相似性为 98%, 与猪人兔狗猫蝙蝠以及小鼠的氨基酸相似性分别为 81%,74%,73%,72%,70%,70% 和 66%. 系统发育树表明山羊 CD4 与绵羊和猪的 CD4 蛋白聚成一支, 表明它们有较近的亲缘关系, 其中山羊与绵羊的亲缘关系最近, 而与狗蝙蝠兔人和小鼠的亲缘关系相对较远. 实时荧光定量 PCR 分析发现,CD4 在山羊淋巴中的表达量最高, 在睾丸中表达量较低, 表明山羊 CD4 是一种免疫分子. 关键词 : 山羊 ;CD4 基因 ; 克隆 ; 结构域 ; 实时荧光定量 PCR 中图分类号 :S827 文献标志码 :A CD4 分子是一类单链跨膜蛋白, 表达于胸腺及成熟的 T 细胞表面. 作为主要组织相容性复合体 MHC I(MajorHistocompatibilityComplex I) 分子, 限制 TH 细胞和部分胸腺细胞重要的表面受体与信号传导分子, 且 CD4 分子参与 T 细胞抗原识别受体 TCR(Tcelreceptor) 介导的 TH 细胞增殖活化和胸腺细胞发 [1-3] 育过程. 同时,CD4 分子还可以作为一些病毒感染细胞的受体, 如 HIV 感染细胞时以 CD4 作为其主要 [4] 受体.CD4 分子在氨基酸一级结构上可分为长的 N 端胞外区疏水性跨膜区和短的胞浆区 3 个部分, CD4 分子的胞外区包含有 4 个 Ig 样结构域, 分别命名为 D1,D2,D3 和 D4. 胞外区的 D1 和 D2 结构域与 MHC I 分子的结合, 可稳定 TCR-CD3 复合体与 MHC I 抗原肽复合物的相互作用,CD4 分子胞浆区的 KKTCQC 基序与 Src 家族蛋白酪氨酸激酶 p 56kk 的结合 [5-6], 使之催化 CD3 分子胞浆区的 ITAM 基序发生高度磷酸化, 进而活化 Syk 家族蛋白酪氨酸激酶 ZAP-70. 活化的 ZAP-70 激酶催化下游底物 LAT,SLP-76 和 Vav 等接头分子发生磷酸化, 从而引发一系列磷酸化级联反应, 最终激活一些转录因子, 促进 TH 细胞 [7-8] 的多种基因表达开放, 最终增殖分化为效应细胞. 现有的序列分析表明 CD4 在真核生物进化中高度保守, 具有作为系统发育研究分子标记的可能性. 目 1 收稿日期 : 基金项目 : 国家自然科学基金资助项目 ( ). 作者简介 : 郑双艳 (1982 ), 女, 湖北襄樊人, 助理实验师, 主要从事动物遗传育种与繁殖学研究. 通信作者 : 赵永聚, 副教授, 医学博士.

2 2 西南大学学报 ( 自然科学版 ) htp://xbbjb.swu.cn 第 34 卷 [9-13] 前, 学者们已经克隆鉴定了人猪猴鼠兔牛猫和狗等哺乳动物的 CD4cDNA 序列. 通过 Geṉ Bank 数据库检索没有发现山羊 CD4 基因序列. 本研究通过同源序列搜索和 PCR 方法, 首次克隆了山羊 CD4 基因, 构建了物种间的系统发育树. 此外, 还进一步检测了 CD4 基因在山羊体内各组织器官中的分布, 为进一步研究哺乳动物中 CD4 基因的结构与功能关系, 寻找物种间的系统发育奠定了基础. 1 材料与方法 1.1 材料试验动物重庆黑山羊, 由重庆北碚农户提供, 屠宰后立即取组织, 放在液氮中速冻主要试剂与仪器反转录试剂盒和通用引物等购自上海生工生物技术有限公司 ;E.coliDH5α 菌株由本实验保存 ; pmd18-t Vector 和 TaqDNA 聚合酶购自日本 TaKaRa 公司 ;Trizol 试剂购自美国 Invitrogen 公司. 主要仪器包括 BIO-RADPCR 仪 (BIO-RAD 公司美国 );DYY-8C 型电泳仪 ( 六一厂北京 ); 凝胶成像系统 (Viḻ berinfinity 公司法国 ); 荧光定量 PCR 仪 ABIPRISM TM 7000(ABI 公司美国 ). 1.2 方法组织总 RNA 提取与 cdna 的合成 [14-15] 取黑山羊组织约 0.1g, 依照参考文献中的方法提取总 RNA. 移取 RNA 溶液 5μL 于 0.5 ml EP 管中, 加 OligodT2μL, 补水至 10μL,70 5 min, 冰浴 10 min; 再于反应液中依次加入 5μL5x Bufer,2μLdNTP,1μL M-MLV 和 1μL RNA 酶抑制剂, 补水至 25μL. 反应条件为 :42 60 min, 95 10min, 即为 cdna 模板. 最后加入 75μL 灭菌水, 分装保存引物设计及 PCR 扩增参考 GenBank 发表的绵羊 CD4 的 mrna 序列 EST 序列以及其他动物的 CD4 mrna 序列, 在高度保守位置设计特异性引物. 引物均由上海生工生物技术公司合成. P1:5 -AGGAAGAGAGACCCAGGCTGG-3 ; P2:5 -GCCTGCTCCCCCTCCTTCAC-3 ; P3:5 -CAGAAGGCCCCCGAAACAGTC-3 ; P4:5 -CCGGCTACATTCATCTGGTC-3. 以卵巢 cdna 为模板, 分别用引物对 P1/P2 和 P3/P4 进行 PCR 扩增. 反应参数为 :94 3 min; 94 30s,55 50s,72 90s,30 个循环 ;72 延伸 10min. 扩增结束后, 取 7μL 在 1% 琼脂糖凝胶中进行初步电泳鉴定, 观察结果 PCR 产物回收克隆与测序分析将扩增产物用 DNA 片段纯化, 回收试剂盒进行回收, 回收产物连接到 pdm18-tvector, 转化 DH5α 感受态细胞, 筛选出阳性克隆送上海英俊生物技术有限公司测序序列分析用 DNAstar 软件包的 Seqman 软件对测序结果进行拼接以获得完整的序列, 在 Expasy 网站进行 ORF 的预测与翻译分子量和等电点的分析 ; 在 SMART 网站进行结构域的预测 ; 在 SingalP 网站进行信号肽的预测. 用 CLASTALW 软件对山羊 CD4 与其他动物 CD4 氨基酸序列进行序列比对. 用 mega4.0 软件, [16] 采用 NeighboṟJoining(NJ) 法 2000 次自展重抽样构建系统树 CD4 基因实时定量 PCR 分析实时定量使用 PCR Platinum SYBR GreenqPCR SuperMix-UDG(Invitrogen,US) 染料, 在 ABI PRISM TM 7000 定量 PCR 仪上进行. 每一个反应进行 3 个重复, 以山羊 beta-actin 基因作为内参. 引物设计为 CD4-F:5 TCTTGCCGTCAGAGTTCATCCA3,CD4-R:5 GCCTGCGGTGCCAGCATTTA3 ;ActiṉF:5 GAACCCCAAAGCCAACCG3,ActiṉR:5 CCCGTCCCCAGAGTCCAT3.25μL 的反应体系包

第 2 期郑双艳, 等 : 山羊 CD4 基因的克隆及组织表达分析 3 含 10 reactionbufer2.5μl,2.5mmol/l MgCl22μL,2.5mmol/LdNTP2μL,2.5mmol/LdNTP, 上下游引物各 0.5μL,Taq 酶 0.3μL,cDNA 模板 1μL,SYBR Green1μL,ddH2O15.3μL. 反应体系为 :95 预变性 5min,95 变性 30s,60 退火 30s,72 延伸 50s,40 个循环.

同时, 1% 琼脂糖凝胶电泳显示出清晰的 3 条带 (28S,18S 和 5S, S 表示沉降系数 ), 表明所提取的总 RNA 具有很好的完整性, 可保证后续实验的顺利进行 ( 图 1). 2.

3 第 2 期郑双艳, 等 : 山羊 CD4 基因的克隆及组织表达分析 3 含 10 reactionbufer2.5μl,2.5mmol/l MgCl22μL,2.5mmol/LdNTP2μL,2.5mmol/LdNTP, 上下游引物各 0.5μL,Taq 酶 0.3μL,cDNA 模板 1μL,SYBR Green1μL,ddH2O15.3μL. 反应体系为 :95 预变性 5min,95 变性 30s,60 退火 30s,72 延伸 50s,40 个循环. 循环结束后, 进行溶解曲线分析. 目的基因的相对量用方程 2 - Ct 计算, 其中 - Ct=Ct(CD4)-Ct(actin). 2 结果 2.1 山羊总 RNA 的提取分别提取淋巴脾脏睾丸和卵巢的总 RNA, 检测所提取的各总 RNA 的纯度与完整性. 本研究所提取的不同组织器官总 RNA 的 OD260/280 均在 1.9~2.1 之间. 同时, 1% 琼脂糖凝胶电泳显示出清晰的 3 条带 (28S,18S 和 5S, S 表示沉降系数 ), 表明所提取的总 RNA 具有很好的完整性, 可保证后续实验的顺利进行 ( 图 1). 2.2 山羊 CD4 的 cdna 克隆分别以山羊淋巴 cdna 为模板将引物对 P1/P2 和 P3/P4 进行 PCR 扩增, 得到约 720bp 和 880bp 的片段 ( 图 2 图 3), 再将 PCR 扩增产物进行克隆并测序. 2.3 山羊 CD4 核苷酸序列和氨基酸序列分析用 DNAstar 软件对测序结果进行拼接, 获得了 1 条包含完整的开放阅读框 (ORF) 的 cdna 序列 (GenBank 登录号 : 1. 卵巢 ;2. 淋巴 ;3. 脾脏 ;4. 睾丸. 图 1 提取的各组织的 RNA EU913093), 其全长为 1555bp, 编码 455 个氨基酸的蛋白, 相对分子质量为 , 等电点为 9.52( 图 4). M. DNA marker ;1.P1/P2RT-PCR 扩增产物. 图 2 山羊 CD4 基因 RT-PCR 产物的电泳分析 M. DNA marker ;1.P3/P4RT-PCR 扩增产物. 图 3 山羊 CD4 基因 RT-PCR 产物的电泳分析氨基酸序列分析表明, 山羊 CD4 蛋白前体是一种跨膜蛋白分子, 由信号肽胞外区跨膜区和胞浆区 4 个部分构成, 分别由 25,352,23 和 36 个氨基酸残基组成. 在胞外区含有 4 个 Ig 样结构域,2 个二硫键 (C 41 C 109 和 C 143 C 180 ) 及 3 个 N 糖基化位点 (N 231,N 263 和 N 343 ). 2.4 山羊 CD4 与其他动物 CD4 的同源性及系统发育分析将山羊 CD4 与绵羊 (Genbank 登录号 :NP_ ) 猪 (NP_ ) 人 (AAH ) 兔 (NP _ ) 狗 (NP _ ) 猫 (AAB ) 蝙蝠 (BAE ) 和小鼠 (AAC ) 的 CD4 氨基酸序列进行比较, 得出的氨基酸相似性分别为 98%,81%,74%,73%,72%, 70%,70% 和 66%. 多序列比对分析表明, 山羊 CD4 与其他各种哺乳动物 CD4 蛋白在胞外区和跨膜区的氨基酸序列变异较大, 而在胞浆区高度保守, 尤其是位于胞浆区的 Src 家族蛋白酪氨基酸激酶 p 56kk 识别序列 KKTCQC 以及与 CD4 分子内化相关的双亮氨基酸基序在各个物种中高度保守 ( 图 5).

4 4 西南大学学报(自然科学版) //xbb h t t b.swu.cn p: j 长箭头表示引物位置,信号肽胞外区跨膜区和胞浆区分别用不同的阴影表示,N 糖基化位点用三角形标出. 图 4 山羊 CD4 基因编码区核苷酸序列与推导的氨基酸序列第 34 卷

5 第2期郑双艳,等:山羊 CD4 基因的克隆及组织表达分析 5 KKTCQC 基序和双亮氨基酸基序分别用矩形框和三角形标出. 图 5 山羊 CD4 与其他哺乳动物 CD4 氨基酸序列的多序列比对根据山羊和其他动物 CD4 氨基酸序列绘制系统发育树 (图 6).由图 6 可知,山羊 CD4 与绵羊和猪的 CD4 蛋白聚成一支,表明它们有较近的亲缘关系,其中山羊与绵羊的亲缘关系最近,而与狗蝙蝠兔人和小鼠的亲缘关系相对较远. 2.5 山羊 CD4 的组织表达定量分析对山羊 CD4 基因在卵巢淋巴脾脏和睾丸4 个组织器官中的表达量进行实时荧光定量 PCR 分析,结

6 西南大学学报 ( 自然科学版 ) htp://xbbjb.swu.cn 第 34 卷果表明 CD4 基因在山羊卵巢淋巴和脾脏中的表达量较高, 其中在淋巴中的表达量最高, 但在睾丸中表达量较低 ( 图 7). 图 6 山羊 CD4 与其他哺乳动物 CD4 分子系统进化树 3 讨论许多研究表明 CD4 分子是 T 细胞表面跨膜糖蛋白, 也是 T 淋巴细胞重要的表面标志.

6 6 西南大学学报 ( 自然科学版 ) htp://xbbjb.swu.cn 第 34 卷果表明 CD4 基因在山羊卵巢淋巴和脾脏中的表达量较高, 其中在淋巴中的表达量最高, 但在睾丸中表达量较低 ( 图 7). 图 6 山羊 CD4 与其他哺乳动物 CD4 分子系统进化树 3 讨论许多研究表明 CD4 分子是 T 细胞表面跨膜糖蛋白, 也是 T 淋巴细胞重要的表面标志. 在免疫应答中,CD4 的功能主要表现在 2 个方面 :1 CD4 分子对 MHCⅡ 类分子有特异的亲和力, 所以它作为细胞黏附分子发挥作用 ;2 它是 1 个传递信号的分子, [17] 促使 T 细胞激活. 目前研究最多的就是人的 CD4, 该分子由 458 个氨基酸残基组成, 包括信号肽图 7 CD4 基因在山羊不同组织中的相对表达量 23 个氨基酸残基, 胞外区 374 个氨基酸残基, 含 2 个糖基化点, 具有 4 个 IgV 样结构域, 属免疫球蛋白超家族成员 ; 穿膜区 21 个氨基酸残基 ; 胞浆区含有 40 个氨基酸残基. 其中胞外区是 CD4 与 MHC I 分子结合的区域, 也是 HIV-7 感染宿主细胞时吸附的区域. 本研究确定了山羊 CD4 分子的 cdna 序列, 且序列分析表明山羊 CD4 分子是一种由 455 个氨基酸残基组成的单链跨膜蛋白分子, 由信号肽胞外区跨膜区和胞浆区 4 个部分构成, 分别由 25, 352,23 和 36 个氨基酸残基组成. 在胞外区含有 2 个二硫键 (C 41 C 109 和 C 143 C 180 ),3 个 N 糖基化位点 (N 231,N 263 和 N 343 ) 及 4 个 Ig 样结构域, 表明山羊 CD4 分子与人和其他哺乳动物的 CD4 分子具有相似的氨基酸结构. 氨基酸同源性比较发现, 山羊和各种动物 CD4 分子氨基酸序列的差异主要在胞外区和跨膜区, 而胞浆区相对保守. 山羊 CD4 分子胞浆区由 36 个氨基酸残基组成, 存在高度保守的 Src 家族蛋白酪氨酸激酶 p56 kk 识别序列 KKTCQC 以及与 CD4 分子内化相关的双亮氨基酸基序. 前人的研究表明, 在人的静止 T 细胞中,CD4 分子与 p56 kk 连接抑制 CD4 内化的发生, 一旦抗原和抗体引发 T 细胞激活时,CD4 分子与 p56 kk [18-19] 分离发生内化, 而 CD4 分子的内化过程需要自身双亮氨酸基序的存在, 这表明山羊 CD4 分子具有信号传导功能的结构基础, 同时 CD4 胞浆区高度的保守性表明这一区域的功能是重要的. 本研究表明, 虽然 CD4 基因在山羊体内各组织器官中均有表达, 但在淋巴中表达量较高, 在睾丸中表达量较低. 由此推测这种在不同组织中表达的差异性可能与其免疫功能有一定的关系, 例如 CD4 基因在淋巴中大量表达, 相应的 CD4 是一个传递信号的分子, 促使 T 细胞的激活, 从而发生相应的免疫反应. 总

7 第 2 期郑双艳, 等 : 山羊 CD4 基因的克隆及组织表达分析 7 之, 要想了解 CD4 基因在体内的功能, 还需通过合成或者表达重组蛋白质, 进一步研究其蛋白质的生物学功能, 以揭示其在机体内的各种作用. 参考文献 : [1] ITANO A,SALMON P,KIOUSSISD,etal.TheCytopLasmicDomainofCD4PromotestheDevelopmentofCD4 LineageTcels[J].JExp Med,1996,183(3): [2] JAMESONSC,HOGQUIST K R,BEVAN M J.PositiveSelectionofThymocytes [J].AnnuRevImmunol,1994 (13): [3] GLAICHENHAUSN,SHASTRIN,LITTMANDR,etal.RequirementforAssociationofp 56kk withcd4inantigeṉ SpecificSignalTrans-DuctioninT-Cels[J].Cel,1991,64(3): [4] FOUTST,GODFREY K,BOBBK,etal.CrosslinkedHIV-IEnvelope-CD4ReceptorComplexesElicitBroadlyCross- ReactiveNeutralizingAntibodiesinRhesusMacaques[J].ProcNatlAcadSciUSA,2002,99(18): [5] RYUSE,KWONG PD,TRUNEH A,etal.CrystalStructureofaHIV-BindingRecombinantFragmentofHuman CD4 [J].Nature,1990,348(29): [6] WANGJia-hua,MEIJERSR,XIONG Yi,etal.CrystalStructureoftheHumanCD4N-TerminalTwo-DomainFragmentComplexedtoaClass IMHC Molecule[J].ProcNatlAcadSciUSA,2001,98(19): [7] LEO A,SCHRAVENB.A DaptersinLymphocyteSignaling [J].CurrOpinImmunol,2001,13(3): [8] KANELP,LINJ,WEISSA.SignalTransductionbytheTCRforAntigen [J].CurrOpinImmunol,2000,12(3): [9] GORMANSD,FREWIN M R,COBBOLDD,etal.IsolationandExpressionofcDNA EncodingtheCanineCD4and CD8AlphaAntigens[J].TissueAntigens,1994,43(3): [10]MADDONPJ,LITTMAN DR,GODFREY M,etal.TheIsolationandNucleotideSequenceofacDNAEncodingthe T-CelSurfaceProteinT4:A New MemberoftheImmunoglobulinGeneFamily[J].Cel,1985,42(1): [11]MILDEKF,CONNER GE,MINTZD H,etal.PrimaryStructureoftheCanineCD4Antigen [J].Biochim Biophys Acta,1993,1172(3): [12]NORIMINEJ,MIYAZAWA T,KAWAGUCHIY,etal.AcDNAEncodingFelineCD4HasaUniqueRepeatSequence DownstreamoftheV-LikeRegion [J].Immunology,1992,75(1): [13] 王建华, 杨汉春, 郭靖, 等. 猪 CD4 分子全长 cdna 克隆与序列分析 [J]. 中国兽医学报,2005,25(6): [14] 李翠萍, 夏蓓蓓, 翟军鹏, 等. 番茄 GGPS2 基因的克隆与表达载体的构建 [J]. 西南大学学报 : 自然科学版,2010, 32(10): [15] 彭江, 李鹏, 宋锋, 等. 非洲菊 f3h 基因的克隆及反义表达载体的构建 [J]. 西南大学学报 : 自然科学版,2010, 32(6): [16] 蒋钦杨, 韦英明, 黄艳娜, 等. 德保矮马生长激素基因的克隆与序列分析 [J]. 西南大学学报 : 自然科学版,2009, 31(12): [17] 周光炎. 免疫学原理 [M]. 上海 : 上海科学技术文献出版社,2007: [18]SHINJ,DOYLEC,YANGZhi,etal.StructuralFeaturesoftheCytoplasmicRegionofCD4RequiredforInternalization [J].EMBOJ,1990,9(2): [19]PELCHEN-MATTHEWSA,BOULETI,LITTMAND,etal.TheProteinTyrosineKinasep56 kk InhibitsCD4EndocytosisbyPreventingEntryofCD4IntoCoatedPits[J].CelBiol,1992,117(2):

8 8 西南大学学报 ( 自然科学版 ) htp://xbbjb.swu.cn 第 34 卷 CloningofGoatCD4GeneandItsTissueExpression ZHENGShuang-yan 1,2, ZHAO Yong-ju 2, XU Baoẖua 1, WANGZiḻong 3, LI Juan 4 1. DepartmentofLaboratoryAnimalScience,NanchangUniversity,Nanchang330031,China; 2.SchoolofAnimalScienceandTechnology,SouthwestUniversity,Chongqing400716,China; 3. ColegeofAnimalScienceandTechnology,JiangxiAgriculturalUniversity,Nanchang330045,China; 4.SchoolofLifeScience,SouthwestUniversity,Chongqing400716,China Abstract:CD4isoneofthetransportfactorsonthecelmembranefunctioningasanimportantcoṟeceptorand signalmoleculeexpressedonthesurfaceofthelpcels(th)andthymocytes.cd4isinvolvedintheactivationofperipheralthelpcelsandthediferentiationofthymocytes.inthisstudy,weclonedthegoatcd4 gene(genbankid:eu913093)andanalyzeditsexpressionindiferenttissues.sequenceanalysisshowed thatthefuḻlengthcd4cdna was1555nt,containinganopenreadingframe(orf)of1368nt.iteṉ codesapolypeptideof455aminoacids,whichis50.50kdinthemolecularweightandis9.52astheisoelectricpoint.thegoatcd4precursorproteincomposesofsignalpeptide,extracelularregion,transmembrane domainandcytoplasmicdomain.theextracelularregioncontainsfourimmunoglobuliṉlikedomains,twodisulfidebonds(c 41 C 109 andc 143 C 180 )andthreenḡlycosylationsites(n 231,N 263 andn 343 ).Alignmentof thededucedaminoacidsequencesshowedthatgoatcd4hasahighsimilarity(98%)withthatofsheep,and has81%,74%,73%,72%,70%,70% and66% similaritywithpig,human,rabbit,dog,cat,batand mousecd4,respectively.phylogeneticanalysisshowedthatgoatcd4formsaclusterwithsheepandpig CD4,suggestingafairlycloserelationshipbetweenthem.Therelationshipbetweengoatandsheepistheclosest,whiletherelationshipofgoatwithdog,bat,rabbit,humanand mouseisrelativelydistant.realtime PCRrevealedtheexpressionlevelofCD4isthehighestinlymphandrelativelylowintestisis,suggestingthat goatcd4isanimmunemolecule. Keywords:goat;CD4;cloning;domain;realtimePCR 责任编辑夏娟

材料方法

材料方法生物技术通报张发洲杨慧兰为了构建单纯疱疹病毒型感染细胞多肽真核表达质粒应用技术从株的基因组中扩增基因并连接至真核表达载体对阳性克隆进行菌落酶切和测序鉴定后成功构建了重组质粒用转染试剂盒将重组质粒转染至细胞中并用及检测其表达情况结果显示基因在细胞中得到正确表达真核表达质粒的构建成功为进一步研究对宿主细胞的影响奠定了基础单纯疱疹病毒型感染细胞多肽