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1 第 37 卷第 2 期海洋学报 Vol.37,No 年 2 月 HaiyangXuebao February2015 董洪亮, 刘乃国, 倪娜, 等. 太平洋牡蛎中 Cg IL 17 和 Cg TGF β 的表达及其免疫作用的研究 [J]. 海洋学报,2015,37(2): ,doi: /j.issn DongHongliang,LiuNaiguo,NiNa,etal.StudyontheexpressionandimmunefunctionofCg IL 17andCg TGF βinthepacificoys ter, 犆狉犪狊狅狊狋狉犲犪犵犻犵犪狊 [J].HaiyangXuebao,2015,37(2): ,doi: /j.issn 太平洋牡蛎中犆犵犐犔 17 和犆犵犜犌犉 β 的表达及其免疫作用的研究董洪亮 1, 刘乃国 1, 倪娜 1, 李彩玉 1, 郑静 1, 苗双 1 (1. 滨州医学院附属医院临床医学实验室, 山东滨州 ) 摘要 : 目的 : 探讨 Cg IL 17 和 Cg TGF β 在太平洋牡蛎中表达的组织定位免疫作用及其可能的机制方法 : 采用 Real timepcr 原位杂交和图像分析的方法进行研究结果 : 实时定量 PCR 研究表明,Cg IL 17 和 Cg TGF β 在弧菌感染后的太平洋牡蛎的鳃外套膜心包液唇须消化道和闭壳肌中表达明显增强原位杂交实验结果表明,Cg IL 17 和 Cg TGF β 在未染菌组牡蛎的消化道消化腺鳃唇须外套膜中都有表达 ; 染菌组以上各组织中的 Cg IL 17 和 Cg TGF β 表达量均有显著增高, 而消化道消化腺中的表达量明显高于其他组织, 闭壳肌中也均有微弱表达 ; 感染弧菌前后两种基因在性腺中均未见表达相关性分析发现这两种基因表达量在唇须和外套膜中具有明显的相关性结论 :Cg IL 17 和 Cg TGF β 具有多种生物学效应, 且都参与了太平洋牡蛎的固有免疫反应 ; 消化道可能是牡蛎主要的免疫反应器官之一 ;Cg IL 17 和 Cg TGF β 在唇须和外套膜中可能存在调控关系或协同作用关键词 : 太平洋牡蛎 ; 牡蛎 IL 17; 牡蛎 TGF β ; 组织定位 ; 免疫反应中图分类号 :S917.4 文献标志码 :A 文章编号 : (2015) 引言在无脊椎动物的免疫系统中, 对病原体的防御机制是固有免疫, 涉及细胞防御和体液反应两个方 [1 3] 面细胞防御, 是指通过细胞吞噬作用, 或在血淋 [4 5] 巴中释放酶来进行防御体液反应, 则是通过合成 [6] 抗细菌肽或抗真菌肽来进行抵御这些肽主要有两类 : 防御肽和调节性细胞因子 IL 17 和 TGF β 可能就 [7 8] 是其中的两种重要的调节性细胞因子牡蛎有丰富的营养价值和药用价值, 牡蛎中已经发现存在 IL 17(Cg IL 17) 和 TGF β ( Cg TGF β ) 两种基因, 并发现细菌感染能够引起太平洋牡蛎中 Cg IL 17 和 Cg TGF β 的表达增高, 说明这两种基因可能都 [7,9] 是牡蛎对抗病原体的早期反应基因但 Cg IL 17 和 Cg TGF β 在哪些组织细胞中表达目前仍不清楚, 因此研究太平洋牡蛎中 Cg IL 17 和 Cg TGF β 基因表达的定位分布对了解太平洋牡蛎免疫反应机制及其免疫系统的进化都具有重要意义本研究首次应用原位杂交技术研究 Cg IL 17 和 Cg TGF β 表达的组织定位, 并用 Real timepcr 方法进行相互验证, 探讨它们在太平洋牡蛎免疫反应中的作用及其可能机制收稿日期 : ; 修订日期 : 基金项目 : 山东省高等学校科技计划项目 : 牡蛎药用基因 IL 17 的体外表达和组织定位研究 (J10LC81) 作者简介 : 董洪亮 (1987 ), 男, 山东省烟台市人, 主要从事细胞分子生物学研究 E mail:hongliang.234@163.com 通信作者 : 刘乃国, 男, 教授, 主要从事细胞分子生物学研究 E mail:liunaiguo1966@163.com

2 2 期董洪亮等 : 太平洋牡蛎中 Cg IL 17 和 Cg TGF β 的表达及其免疫作用的研究材料与方法 2.1 材料试剂与引物新鲜太平洋牡蛎购于水产市场, 灿烂弧菌和漫弧菌购于中国海洋大学生命学院微生物实验室,Maxi mafirststrandcdna SynthesisKitforRT qpcr, MaximaSYBR Green/FluoresceinqPCR Master Mix (2 ) 购自 Thermo 公司,MyLab R PCR 法 DIG 标记试剂盒购自北京美莱博医学科技有限公司应用 Primer(version5.0) 软件, 根据太平洋牡蛎细胞因子 IL 17 及 TGF β 的基因序列, 分析设计特异性引物据太平洋牡蛎 Actin 基因序列, 设计内参基因 Actin 的引物引物有上海生工技术有限公司合成引物序列见表 1 表 1 本研究中所用引物序列犜犪犫.1 犜犺犲狆狉犻犿犲狉狊犲狇狌犲狀犮犲犳狅狉犘犆犚犪犿狆犾犻犳犻犮犪狋犻狅狀犻狀狋犺犻狊狊狋狌犱狔引物引物序列 (5-3 ) 基因基因长度 IL 17 F AAACCACAATGGGCAACT IL bp IL 17 R GGCTCGGAACAAATGACG Cg TGF β F TGCTGGGACTGACCATCA Cg TGF β 103bp Cg TGF β R AGTCACACGGGGCACATT Actin F CTGTGCTACGTTGCCCTGGACTT Actin 129bp Actin R TGGGCACCTGAATCGCTCGTT P IL 17 F AAACCACAATGGGCAACT Probe IL bp P IL 17 R CGCTACGAGGAAATACGG P TGF β F AGAGGATCATACAAGGGAG Probe TGF β 473bp P TGF β R TAGTAAAGCGACAGCACC 2 2 太平洋牡蛎弧菌感染实验取灿烂弧菌和漫弧菌两种新鲜菌液离心, 去上清, 灭菌的海水重悬菌体, 分光光度计测 OD 550, 配成 bacteria/100μl 混合菌液, 用于太平洋牡蛎染菌实验购买生长 3 年大小相近的太平洋牡蛎 32 只, 随机分成两组, 每组 16 只在 15 灭菌海水中饲养适应 24h 后进行实验采用闭壳肌注射的方法, 实验组每只注射 bacteria/100μl 灿烂弧菌和漫弧菌混合菌液, 对照组每只注射 100μL 灭菌的海水 12h 后, 取各组组织进行后续实验 2.3 犚犲犪犾狋犻犿犲犘犆犚法检测细胞因子犆犵犐犔 17 犆犵犜犌犉 β 的转录表达组织总 RNA 的提取及 cdna 的合成 12h 后, 从实验组和对照组各随机取 8 只, 解剖剥离出外套膜鳃消化道唇须闭壳肌, 研磨成粉状, 按每 50~100mg 组织加 1mLTrizol 抽取每只太平洋牡蛎的心包液, 放入无 RNA 酶的离心管中, 离心去上清, 获得的细胞悬浮加入适量 Trizol 按总 RNA 常规提取方法, 提取各组织总 RNA 用分光光度计测定 RNA 的浓度及纯度, 琼脂糖凝胶电泳检测 RNA 完整性用 DNaseⅠ 消化去除 RNA 中的 DNA, 用 DNaseinactivationreagent 终止反应后, 离心收集无 DNA 污染的 RNA, 加入适量的 RNA 酶抑制剂用 MaximaFirstStrandcDNASynthesisKit 进行反转录合成的 cdna 保存于 -80, 备用 Real timepcr 定量检测以 Actin 作为内参基因, 用 Real timepcr 法对实验组和对照组各组织细胞因子 Cg IL 17 和 Cg TGF β 的表达进行相对定量反应体系为 25μL 扩增反应条件 :50 2min;95 10min; 变性 s 退火 s 延伸 72 30s,30 个循环所得数据用 2 - CT 法进行统计分析 2.4 原位杂交法检测细胞因子 ( 犐犔 17 犜犌犉 β ) 的表达水平探针的合成用引物 P IL 17 F/P IL 17 R P TGF β F/P TGF β R, 根据 PCR 法 DIG 标记试剂盒合成 IL 17 探针及 TGF β 探针, 分光光度计测探针浓度,-70 保存备用组织切片的制备取实验组及对照组各组织, 于 4% 多聚甲醛内固定 48h, 常规脱水透明包埋切片, 切片厚度为 4 μm, 所用载玻片经多聚甲醛处理

3 106 海洋学报 37 卷原位杂交检测对实验组和对照组每一组织均选取两张切片, 一张用于探针杂交, 另一张用于空白对照经二甲苯脱蜡, 常规梯度酒精水化,DEPC 水平衡用 0.2mol/L 的 HCl 处理后, 再用蛋白酶 K(7.5μg/mL) 进行消化,0.2% 的甘氨酸终止反应而后经 4% 多聚甲醛固定,0.1% PBS 洗涤 42 在湿盒中, 探针杂交组加杂交液 ( 探针 50nmol/L), 探针空白组加预杂交液 ( 不加探针 ), 用原位杂交专用盖玻片封片,42 湿盒中杂交 16~18h 杂交后, 依次用 2 SSC/0.1%SDS 0.1 SSC/0.1%SDS 进行洗涤加入连接有碱性磷酸酶的抗地高辛抗体, 常温下孵育 1~2h NBP/BCIP 显色液避光显色 2~6h 最后经 0.1% 核固红复染 2 min, 酒精梯度脱水后, 二甲苯透明, 封片显微镜下观察拍照, 并用北京航空大学研制的 MoticMed6.0 数码医学图像分析系统进行图像分析, 所得数据用 SPSS 软件进行分析 3 结果 3.1 实时定量犘犆犚实验结果细胞因子 Cg IL 17mRNA 表达进行分析, 结果显示, 实验组鳃外套膜唇须心包液中 Cg IL 17 的转录水平增高, 分别是对照组相应组织的 1.95 倍 ( 狆 <0.05) 3.61 倍 ( 狆 <0.05) 4.69 倍 ( 狆 <0.05) 和 3.36 倍 ( 狆 <0.05); 消化道闭壳肌中 Cg IL 17 的转录水平显著增高分别是对照组的倍 ( 狆 <0.01)( 图 1) 细胞因子 Cg TGF βmrna 表达进行分析, 结果显示, 实验组鳃外套膜唇须心包液中 Cg TGF β 的转录水平增高, 分别是对照组相应组织的 3.73 倍 ( 狆 <0.01) 3.68 倍 ( 狆 <0.01) 2.06 倍 ( 狆 <0.05) 和 3.41 倍 ( 狆 <0.01) 消化道闭壳肌中 Cg TGF β 的转录水平显著增高分别是对照组的倍 ( 狆 <0.01)( 见图 2) 图 1 real timepcr 实验中 Cg IL 17 的 mrna 表达 ( 狆 <0.05, 狆 <0.01) Fig.1 ThemRNAexpressionofCg IL 17byreal timepcr( 狆 <0.05, 狆 <0.01) 3.2 原位杂交实验结果细胞因子 Cg IL 17 和 Cg TGF β 原位杂交实验结果表明, 实验组和对照组的肠道鳃外套膜唇须中均有阳性信号, 且实验组阳性信号强于对照组闭壳肌在对照组中未见阳性信号, 实验组中有微弱的阳性信号实验组和对照组中性腺均未见阳性表达信号 ( 见图 3A 图 4A) 空白对照组各组织均未见阳性信号对原位杂交实验结果图像进行分析, 实验组中细胞因子 Cg IL 17 和 Cg TGF β 表达量均明显高于对照组 ( 狆 <0.01)( 见图 3B 图 4B), 其中消化腺和肠道的表达量最高 ( 狆 <0.01) 相关性分析发现,Cg IL 17 和 Cg TGF β 的表达量之间在唇须 ( 狉 = , 狆 <0.05) 和外套膜 ( 狉 = , 狆 <0.05) 中具有相关性, 在其他组织中没有明显的相关性 ( 狆 >0.05)

4 2 期董洪亮等 : 太平洋牡蛎中 Cg IL 17 和 Cg TGF β 的表达及其免疫作用的研究 107 图 2 real timepcr 实验中 Cg TGF β 的 mrna 表达 ( 狆 <0.05, 狆 <0.01) Fig.2 ThemRNAexpressionofCg TGF βbyreal timepcr( 狆 <0.05, 狆 <0.01) 4 讨论本实验研究表明, 太平洋牡蛎弧菌感染后 Cg IL 17 和 Cg TGF βmrna 在实验组的鳃外套膜唇须消化道闭壳肌心包液中的表达与对照组相应组织相比明显增高, 其中以消化道和闭壳肌增高最为明显这与以往报道细菌感染后 Cg IL 17 和 Cg TGF β [7,9] 表达增高结果相似本研究原位杂交实验表明, Cg IL 17 和 Cg TGF βmrna 在实验组消化道消化腺鳃唇须外套膜中的表达明显高于其在对照组相应组织中的表达, 对照组闭壳肌未见阳性信号, 而实验组闭壳肌中也只有微弱表达, 性腺组织在对照组和实验组中均未见阳性信号闭壳肌中这两种基因的表达在原位杂交和实时定量 PCR 检测中结果似乎不一致, 这是因为实时定量 PCR 法扩增后比原位杂交方法敏感度要高, 并且实时定量 PCR 方法只是相对定量, 所用 2 - CT 法反映的是实验组和对照组基因表达的倍数关系, 因此结果并不矛盾 Lelong 等报道,TGF β 在太平洋牡蛎中具有广泛表达的模式, 但在某种组织 ( 唇须和鳃 ) 表达量较高, 说明它可能是具有多种效应的细胞因子, 包括细胞生 [7] 长和分化的调节本研究发现, 细胞因子 Cg IL 17 和 Cg TGF β 在牡蛎的多种组织中都表达, 这也进一步说明两种细胞因子可能都具有多种生物学效应染菌后实验组中细胞因子 Cg IL 17 和 Cg TGF β 表达明显高于对照组相应组织中的表达, 进一步证明这两种细胞因子均参与了牡蛎对抗病原体的固有免疫反应相关性分析发现, 细胞因子 Cg IL 17 和 Cg TGF β 表达量之间在唇须和外套膜中具有明显的相关性, 而在其他组织中没有明显的相关性说明在唇须和外套膜中 Cg IL 17 及 Cg TGF β 这两种细胞因子间存在某种联系 Wu 等报道, 珍珠贝中的 PfIL 17 基因与 CgIL 17 基因结构相似,PfIL 17 可能涉及激 [10] 活 NF кb 信号通路对抗细胞外病原体的感染 Lelong 等研究发现,Cg TGF β 启动子结构中发现特异的保守基序, 如 Rel/NFкB 基序,Cg TGF β 及其特定的 TGF β 通路, 可以刺激一些体液细胞因子基因 [7] 的表达 Lemaitre 等报道在缺乏适应性免疫的无脊椎动物中,Tol 和 Imd 通过 NF кb 发挥作用的信 [11] 号通路被认为是宿主防御的最重要的信号通路综上所述, 我们推测在病原体防御过程中, 细胞因子 Cg IL 17 和 Cg TGF β 可能通过 NF кb 发挥作用的信号通路联系在一起, 它们之间可能存在调控关系或协同作用, 这需要进一步研究验证本研究两种实验方法均证明, 染菌后牡蛎消化道中细胞因子 Cg IL 17 和 Cg TGF β 表达增高最为明显, 而且原位杂交结果提示消化道中两种基因的表达量也高于其他组织, 说明消化道可能是牡蛎主要的免疫反应器官之一, 其他组织包括鳃外套膜唇须, 也参与机体的免疫应答

5 海洋学报３７卷１０８图３原位杂交实验中Ｃ１７ｍＲＮＡ的表达结果Ｆ３ｆｃ１７ｍＲＮＡｈｚＣ１７ｍＲＮＡ在牡蛎各组织切片中的表达实验组１肠道３消化腺５唇须７外套膜９鳃１１性腺１３闭壳肌对照组２肠道４消化腺６唇须８外套膜１０鳃１２性腺１４闭壳肌Ｂ牡蛎各组织中Ｃ１７ｍＲＮＡ表达的图像分析结果狆０ｍｒｎａｆｃ１７ｆ３５７ｍ９１１ｘ１３ｍＥｍ１ＩＣ２Ｉ４６８ｍ１０１２ｘ１４ｍｆｃ１７ｍＲＮＡｆｍｆ狆０Ｂ

２期董洪亮等太平洋牡蛎中Ｃ１７和ＣＴＧＦ β的表达及其免疫作用的研究图４原位杂交实验中ＣＴＧＦ βｍｒｎａ的表达结果Ｆ４ｆｃＴＧＦｈｚ βｍｒｎａＣＴＧＦ βｍｒｎａ在牡蛎各组织切片中的表达实验组１肠道３消化腺５唇须７外套膜９鳃１１性腺１３闭壳肌对照组２

6 ２期董洪亮等太平洋牡蛎中Ｃ１７和ＣＴＧＦ β的表达及其免疫作用的研究图４原位杂交实验中ＣＴＧＦ βｍｒｎａ的表达结果Ｆ４ｆｃＴＧＦｈｚ βｍｒｎａＣＴＧＦ βｍｒｎａ在牡蛎各组织切片中的表达实验组１肠道３消化腺５唇须７外套膜９鳃１１性腺１３闭壳肌对照组２肠道４消化腺６唇须８外套膜１０鳃１２性腺１４闭壳肌Ｂ牡蛎各组织中ＣＴＧＦ βｍｒｎａ表达的图像分析结果狆０ｍｒｎａｆｃＴＧＦｆ β Ｅｍ１Ｉ３５７ｍ９１１ｘ１３ｍＣ２Ｉ４６８ｍ１０１２ｘ１４ｍｆｃＴＧＦｆｍｆ狆０Ｂ βｍｒｎａ１０９

7 110 海洋学报 37 卷参考文献 : [1] NicholasHR,HodgkinJ.Responsestoinfectionandpossiblerecognitionstrategiesintheinnateimmunesystemof 犆犪犲狀狅狉犺犪犫犱犻狋犻狊犲犾犲犵犪狀狊 [J].Mol Immunol,2004,41(5): [2] HofmannJA,ReichhartJM. 犇狉狅狊狅狆犺犻犾犪 innateimmunity:anevolutionaryperspective[j].natimmunol,2002,3(2): [3] MiletAC M,EwbankJJ.Immunityin 犆犪犲狀狅狉犺犪犫犱犻狋犻狊犲犾犲犵犪狀狊 [J].CurrOpinImmunol,2004,16(1):4-9. [4] PipeRK.Hydrolyticenzymesassociatedwiththegranularhaemocytesofthemarinemussel 犕狔狋犻犾狌狊犲犱狌犾犻狊 [J].HistochemJ,1990,22(11): [5] ChengTC,RodrickGE.Lysosomalandotherenzymesinthehemolymphof 犆狉犪狊狅狊狋狉犲犪狏犻狉犵犻狀犻犮犪 and 犕犲狉犮犲狀犪狉犻犪犿犲狉犮犲狀犪狉犻犪 [J].CompBiochem PhysiolB,1975,52(3): [6] MitaG,VandenbulckeF,RochP.Originalinvolvementofantimicrobialpeptidesinmusselinnateimmunity[J].FEBSLet,2000,486(3): [7] LelongC,BadariotiF,LeQuéréH,etal.Cg TGF β, atgf β / activeinhomologueinthepacificoystercrassostreagigas,isinvolvedinimmunity againstgram negativemicrobialinfection[j].developmentalandcomparativeimmunology,2007,31(1): [8] LieberMJ,LuckhartS.Transforminggrowthfactor βsandrelatedgeneproductsinmosquitovectorsofhumanmalariaparasites:signalingarchi tectureforimmunologicalcrosstalk[j].molimmunol,2004,41(10): [9] RobertsS,GueguenY,deLorgerilJ,etal.Rapidaccumulationofaninterleukin17homologtranscriptin 犆狉犪狊狅狊狋狉犲犪犵犻犵犪狊 hemocytesfolowing bacterialexposure[j].devcompimmunol,2008,32(9): [10] WuSZ,HuangXD,LiQ,etal.Interleukin 17inpearloyster( 犘犻狀犮狋犪犱犪犳狌犮犪狋犪 ):Molecularcloningandfunctionalcharacterization[J].Fish& ShelfishImmunology,2013,34(5): [11] LemaitreB,HofmannJ.Thehostdefenseof 犇狉狅狊狅狆犺犻犾犪犿犲犾犪狀狅犵犪狊狋犲狉 [J].AnnuRevImmunol,2007,25: 犛狋狌犱狔狅狀狋犺犲犲狓狆狉犲狊犻狅狀犪狀犱犻犿犿狌狀犲犳狌狀犮狋犻狅狀狅犳犆犵犐犔 17 犪狀犱犆犵犜犌犉 β 犻狀狋犺犲犘犪犮犻犳犻犮狅狔狊狋犲狉, 犆狉犪狊狅狊狋狉犲犪犵犻犵犪狊 DongHongliang 1,LiuNaiguo 1,NiNa 1,LiCaiyu 1,ZhengJing 1,MiaoShuang 1 (1. 犆犾犻狀犻犮犪犾犕犲犱犻犮犻狀犲犔犪犫狅狉犪狋狅狉狔, 犅犻狀狕犺狅狌犕犲犱犻犮犪犾犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔犃犳犳犻犾犻犪狋犲犱犎狅狊狆犻狋犪犾, 犅犻狀狕犺狅狌 , 犆犺犻狀犪 ) 犃犫狊狋狉犪犮狋 :Objective:toexplorethetissuelocalization,immunefunctionandthepossiblemechanismofCg IL 17and Cg TGF βin 犆狉犪狊狅狊狋狉犲犪犵犻犵犪狊.Methods:usingreal timepcr, 犻狀狊犻狋狌 hybridizationandimageanalysismethods, theexpressionsofcg IL 17andCg TGF βwerestudied.results:theresultsofreal timepcrshowedthattheex pressionsofcg IL 17andCg TGF βwereup regulatedinthetissuesof 犆. 犵犻犵犪狊,includinggils,mantleedge,labi alpalp,digestivetract,adductormuscleafterbeinginfectedwith 犞犻犫狉犻狅,andsodidinpericardiacliquor.Theresults of 犻狀狊犻狋狌 hybridizationassayindicatedthatbothcg IL 17andCg TGF βexpressedintissuesofuninfectedgroup, includingdigestivetract,digestiveglands,gils,labialpalpandmantleedge.in 犞犻犫狉犻狅 injectedoysters,theexpres sionsofcg IL 17andCg TGF βinabove mentionedtissuesincreasedobviouslycomparedwiththesamecontrol tissues.thehighestexpressionsofthetwogeneswerefoundindigestivetractanddigestiveglands,andtheweak expressionswereappearedinadductormuscle.butnopositivesignalwasfoundingonadofthetwogroups.core lationanalysisimpliedthatthereissignificantcorelationbetweencg IL 17andCg TGF βinlabialpalpandman tleedge.conclusion:cg IL 17andCg TGF βpossessavarietyofbiologicalefects.theirexpressionsmarkedly increasedin 犆. 犵犻犵犪狊 after 犞犻犫狉犻狅 infection,suggestingthatbothcytokinestakepartintheinnateimmunere sponse.thedigestivetractmaybeoneoftheimportantimmuneorgansof 犆狉犪狊狅狊狋狉犲犪犵犻犵犪狊,becausethestrongest signalsofthetwogeneswerefoundinthetissue.thereisregulatoryorsynergisticactionbetweencg IL 17and Cg TGF βinlabialpalpandmantleedgeprobably. 犓犲狔狑狅狉犱狊 :Pacificoyster;Cg IL 17;Cg TGF β ; tissuelocalization;immuneresponse

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2 期董洪亮等 : 太平洋牡蛎中 Cg IL 17 和 Cg TGF β 的表达及其免疫作用的研究 材料与方法 2.1 材料 试剂与引物新鲜太平洋牡蛎购于水产市场, 灿烂弧菌和漫弧菌购于中国海洋大学生命学院微生物实验室,Maxi mafirststrandcdna SynthesisKi

2 期董洪亮等 : 太平洋牡蛎中 Cg IL 17 和 Cg TGF β 的表达及其免疫作用的研究材料与方法 2.1 材料试剂与引物新鲜太平洋牡蛎购于水产市场, 灿烂弧菌和漫弧菌购于中国海洋大学生命学院微生物实验室,Maxi mafirststrandcdna SynthesisKi