国际肿瘤学杂志 2014 年 9 月第 41 卷第 9 期 JIntOncol,September2014,Vol 41,No )to(37.71±2.52)(F=282.05,P<0.01).Theapoptosisratioofthetumorcelwhichtransfe

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1 684 国际肿瘤学杂志 2014 年 9 月第 41 卷第 9 期 JIntOncol,September2014,Vol 41,No 9 [8]ZhangJY,LinMT,YiT,etal.ApoptosissensitizationbyEuphorbia factorl1 inabcb1 mediatedmultidrugresistantk562/adr cels [J].Molecules,2013,18(10): [9]RudnerJ,ElsaeserSJ,JendrosekV,etal.Anti apoptoticbcl 2fails toformeficientcomplexeswithpro apoptoticbaktoprotectfromcele coxib inducedapoptosis[j].biochem Pharmacol,2011,81(1): [10]FalchetiM,SaievaC,LupiR,etal.Gastriccancerwithhigh level microsateliteinstability:targetgenemutations,clinicopathologicfea tures,andlong termsurvival[j].humpathol,2008,39(6): ( 收稿日期 : 修回日期 : ) 论著 敲低 Yes 相关蛋白表达对人脑胶质瘤细胞 SNB19 生长的抑制作用 于福华贾志凡浦佩玉王广秀张安玲杨卫东 摘要 目的探究敲低 Yes 相关蛋白 (YAP) 对人脑胶质瘤细胞 SNB19 细胞生物学特征的影响 方法采用 YAP 干扰 RNA(YAPsiRNA) 敲低 SNB19 细胞中 YAP 的表达,Westernblot 法鉴定肿瘤细胞中 YAP 是否已被敲低 ; 噻唑蓝 (MTT) 比色法测定 YAP 敲低后胶质瘤细胞的增殖能力 ;Transwel 实验检测胶质瘤细胞侵袭能力的变化 ; 流式细胞术和 AnnexinⅤ 标记法分别检测胶质瘤细胞周期及凋亡的变化 应用统计软件 SPSS18.0 进行统计学处理 结果 Westernblot 证实转染 YAPsiRNA 可有效敲低 SNB19 细胞中 Yes 相关蛋白的表达 ; 敲低 Yes 相关蛋白的表达可以抑制胶质瘤细胞增殖活性, 细胞存活率由 (100.00±0.00)% 下降为 (52.32±3.10)%(F=33.00,P<0.01), 细胞周期阻滞于 G 0 G 1 期 (F= 8.76,P<0.01), 细胞侵袭能力明显受抑, 穿膜细胞数由 (163.20±10.10) 个下降至 (37.71±2.52) 个 (F=282.05,P<0.01), 凋亡增加, 凋亡率由 (3.56±0.35)% 增加至 (18.99±0.66)%(F=931.99,P< 0.01) 结论敲低胶质瘤细胞 SNB19 中 YAP 表达可抑制肿瘤细胞增殖和侵袭, 诱导细胞凋亡 ;YAP 可成为人脑胶质瘤基因治疗的潜在靶点 关键词 神经胶质瘤 ; 细胞增殖 ; 细胞凋亡 ;Yes 相关蛋白 Inhibitoryefectofknocking downyes asociatedproteinforthegrowthofsnb19gliomacels Yu Fuhua,JiaZhifan,PuPeiyu,WangGuangxiu,ZhangAnling,YangWeidong.LaboratoryofNeuro Oncology, TianjinNeurologicalInstitute,TianjinMedicalUniversityGeneralHospital,Tianjin300052,China Corespondingauthor:YangWeidong,E mail:yangweidongshine@sina.com Abstract Objective Toinvestigatetheefectofknocking downyes asociatedprotein(yap)onthebiologi calcharacteristicsofsnb19glioblastomacel.methods TheexpresionofYABinSNB19wasknockdownbyYAB smalinterferingrna(yabsirna).thedownregulationofyapexpresionwasidentifiedbywesternblotanalysis. Theproliferativeabilityofcelwasdeterminedbymethylthiazoylterazolium(MTT).Theinvasiveabilityofcelwas examinedbytranswelasay.flowcytometryandannexinvstainingwereusedtodetectthecelcycleandapoptosis respectively.theresultswereanalyzedbythestatisticalsoftwarespss18.0.results TheexpresionofYAPinthe celstransfectedwithyapsirnawassignificantlyreduced.thecelproliferationactivityofsnb19celswasinhibited, whichdecreasedfrom(100.00±0.00)% to(52.32±3.10)% (F=33.00,P<0.01).Thecelcyclewasarestedin G 0 G 1 phase(f=8.76,p<0.01).thecelinvasiveabilitywasatenuatedapparently,whichdecreasedfrom(163.20± DOI: /cma.j.isn X 基金项目 : 国家自然科学基金 ( ) 作者单位 : 天津医科大学总医院神经病学研究所神经肿瘤室通信作者 : 杨卫东,E mail:yangweidongshine@sina.com

2 国际肿瘤学杂志 2014 年 9 月第 41 卷第 9 期 JIntOncol,September2014,Vol 41,No )to(37.71±2.52)(F=282.05,P<0.01).TheapoptosisratioofthetumorcelwhichtransfectedwithYAPsi RNAwasincreasedfrom(3.56±0.35)% to(18.99±0.66)%,(f=931.99,p<0.01).conclusion Knocking down YAPexpresioningliomacelscouldinhibittheproliferativeactivityandinvasiveabilityofSNB19celandcouldinduce celapoptosis.yapcouldbeservedasapotentialtargetforthegenetherapyofglioma. Keywords Glioma;Celproliferation;Apoptosis;Yes asociatedprotein 成人最常见的颅内原发性肿瘤是恶性胶质瘤 尽管神经外科 放射疗法和化学疗法等取得长足进步, 但是恶性胶质瘤患者预后仍然很差 随着生物靶向治疗的出现, 鉴定新的治疗靶点对恶性胶质瘤的治疗至关重要 Hippo Yes 相关蛋白 (Yes asociated protein,yap) 是一个新发现的信号转导通路,YAP 是 Hippo 肿瘤抑制信号通路下游主要的效应因子 [1] 本课题组前期研究发现 YAP 在胶质瘤细胞株以及胶质瘤标本中高表达 为了进一步探讨 YAP 与胶质瘤细胞生长的关系, 本研究采用 YAP 干扰 RNA(YAP sirna) 敲低 SNB19 胶质瘤细胞中 YAP 的表达, 观察胶质瘤细胞生物学行为的变化 1 材料与方法 1 1 材料 YAPsiRNA 的序列为 5 CUGCCACCAAGC UAGAUAATT 3, 无义序列为 5 UUAUCUAGCUUG GUGGCAGTT 3, 由上海吉玛公司合成 ;X tremegen EsiRNATransfectionReagent 购自德国 Roche 公司 SNB19 胶质瘤细胞株购自中国科学院上海细胞生物学研究所中国科学院细胞库 细胞培养所用的 DMEM 培养基和血清购自美国 Hyclone 公司 Tran swel 板购自美国 Corning 公司 抗体分别购自 CST 及中杉金桥公司 1 2 细胞培养与 YAPsiRNA 转染采用 DMEM 培养液加 10% 胎牛血清于 37 5%CO 2 温箱培养细胞 转染时将 个胶质瘤细胞接种在 6 孔板内, 待 50% ~80% 细胞融合后用 X tremegenesirna TransfectionReagent 转染, 方法参照说明书 实验分 3 组 : 对照组 无义序列组及 YAP 敲低组 1 3 Westernblot 分析提取 SNB19 细胞株对照组 无义序列组和 YAP 敲低组蛋白, 采用聚丙烯酰胺凝胶电泳, 将凝胶上的蛋白转移至聚偏氟乙烯 (PVDF) 膜, 进行蛋白免疫检测, 一抗 (YAP:1 500; 内参 GAPDH:1 1000), 二抗为山羊抗兔 IgG(1 1000) 分别孵育, 抗原与抗体结合后应用化学发光系统检测, 计算蛋白表达量 1 4 噻唑蓝比色法检测细胞增殖采用噻唑蓝 (methylthiazoylterazolium,mtt) 比 色法检测胶质瘤细胞的增殖能力 取对数生长期细胞接种于 96 孔板, 每孔 个细胞 /200μl 培养液,12h 后转染 YAPsiRNA 及无义序列, 设对照组 无义序列组及 YAP 敲低组 分别于培养后 0~6d, 每孔加入 MTT20μl, 避光孵育 4h 后, 弃上清液, 每孔再加入 DMSO200μl, 振荡 10min, 使结晶物充分溶解, 用酶标仪 490nm 波长测定各孔光吸收值结果, 每组重复 3 孔 以对照组细胞的吸光度值为对照, 求出其余两组的细胞增殖存活率 1 5 流式细胞术分析细胞周期 75% 乙醇 4 固定消化好的单细胞悬液过夜, RNaseA200μl37 孵育 30min, 与 PI 染色液 800μl 混匀后 4 避光染色 30min, 应用 FACSCalibur( 美国 BD 公司 ) 流式细胞仪检测, 激发波长 488nm,Modifit 软件分析结果 1 6 Transwel 检测细胞侵袭能力在 Transwel 上室中加入 1 2( 基底膜 DMEM) 稀释后的基底膜 50μl,37 30min 使聚合成凝胶 在下室中加入含 10% 胎牛血清的培养基 500μl 将用无胎牛血清培养基制备的细胞悬液 200μl( 细胞密度 /ml) 加入 Transwel 小室上室, 常规培养 24~48h, 弃上室液体, 用湿棉签擦去膜上面的未穿膜细胞,4% 多聚甲醛固定 10min, 结晶紫染 1~2min,PBS 清洗,DP 70 荧光相差倒置显微镜 ( 100) 采集图像, 随机选取 5 个视野, 计算穿过聚碳酸酯膜的细胞数 1 7 AnnexinⅤ FITC 检测细胞凋亡将对照组 无义序列组 YAP 敲低组处于对数生长期的细胞用适量胰酶 (0.25%) 充分消化成单细胞悬液,PBS 洗涤, 再用结合缓冲液 500μl 重新悬浮细胞 ; 依次加入 AnnexinⅤ 和碘化丙啶各 5μl, 混匀 ; 室温 避光条件下, 反应 5~15min;633nm 激发波长检测荧光 1 8 统计学方法 SPSS18.0 软件对数据进行统计学处理, 定量资料用 x±s 表示, 多组间均数比较用方差分析,P< 0.05 为差异有统计学意义 2 结果 2 1 Westernblot 鉴定胶质瘤细胞中 YAP 敲低效果 Westernblot 结果证实, 对照组和无义序列组

3 国际肿瘤学杂志 年 月第 卷第 期 YAP均表达较高 转染 YAP RNA可显著下调胶质瘤 细胞中 YAP的表达 图 JI ntonc o Se pt e mbe r Vo No 流式细胞技术检测胶质瘤细胞不同处理组的细 胞周期分布变化 YAP敲低组 G G 期为 ± 对照 组和无义序列组 G G 期分别 ± 和 ± 差异具有统计学意义 F P 提示敲低 YAP表达使细胞周期出现明显 G G 期阻滞 延缓细胞周期进展 图 YAP为 Ye 相关蛋白 GAPDH为内参 YAP RNA为 YAP干扰 RNA 图 We t e r nb o t检测采用 YAP RNA处理胶质瘤细胞株 SNB中 YAP表达变化 MTT方法检测敲低 YAP对胶质瘤细胞增殖能 力的影响 设定对照组细胞存活率为 ± YAP敲低组 d后细胞增殖开始受到抑制 d抑 制程 度 最 明 显 SNB细 胞 存 活 率 为 ± 与对照组及无义序列组相比 差异有统计 学意义 F P 即细胞增殖能力明显 受抑制 随后抑制能力有所减弱 但 YAP敲低组细 YAP为 Ye 相关蛋白 图 采用流式细胞仪检测 YAP对 SNB胶质瘤细胞周期的影响 胞增殖能力仍低于对照组 表 Tr n we 体外侵袭实验检测敲低 YAP对胶质 表 采用 MTT方法鉴定 YAP对 S NB 胶质瘤细胞增殖 能力的影响 x± 人工计数 个随机视野内穿过聚碳酸酯膜细胞 细胞存活率 时间 d F值 对照组 无义序列组 瘤细胞侵袭能力的影响 P值 数 对 照 组 无 义 序 列 组 及 YAP敲 低 组 分 别 为 ± 个 ± 个和 ± YAP敲低组 ± ± ± 个 YAP敲低组穿膜细胞数较前两者显著减少 ± 差异有统计学意义 F P 见图 ± ± 流式细胞术检测不同处理组细胞凋亡变化 ± ± ± ± ± ± ± ± ± 和 ± YAP敲低组细胞凋亡率 ± ± ± 较上述两组明显增加 为 ± 差异具 ± ± ± 注 MTT为噻唑蓝 YAP为 Ye 相关蛋白 对照组 和 无 义 序 列 组 凋 亡 率 分 别 为 ± 有统计学意义 F P 说明敲低胶质 瘤细胞内 YAP的表达 可促进其凋亡 见图 对照组 b 无义序列组 c YAP敲低组 YAP为 Ye 相关蛋白 图 应用 Tr n we 实验检测胶质瘤细胞侵袭能力 结晶紫染色

4 国际肿瘤学杂志 2014 年 9 月第 41 卷第 9 期 JIntOncol,September2014,Vol 41,No Q1: 坏死细胞 ;Q2: 早凋细胞 ;Q3: 晚凋细胞 ;Q4: 正常细胞 ;YAP:Yes 相关蛋白 图 4 AnnexinⅤ 检测 YAP 基因对胶质瘤细胞凋亡的影响 3 讨论 Hippo 信号转导通路首先在果蝇中被发现,YAP 基因是 Hippo 信号通路的核心成员 [2] 该通路调节 细胞增殖 凋亡, 在胚胎发育以及器官形成过程中起 着重要作用 [3 4] 在许多肿瘤中已经证实存在 Hippo YAP 信号通路调节异常 YAP 在肝癌 肺癌以及卵巢癌等恶性肿瘤中高表 [5] 达 Xu 等证实肝癌中 YAP 高表达与血清中甲胎 [6] 蛋白表达水平及肿瘤分化程度有关 Wang 等研究 非小细胞肺癌细胞株, 证实 YAP 明显增加细胞的增 [7] 殖和侵袭力 与上述研究不同的是,Yuan 等应用 免疫组织化学法检测发现乳腺癌组织中 YAP 表达降 低甚至不表达, 并发现沉默 YAP 基因的乳腺癌细胞 其转移和侵袭力增加 这说明 Hippo YAP 信号通路 在乳腺癌中的作用机制与其他肿瘤中的机制存在一 定差异 本研究的前期实验检测包括 U87 在内的 8 个恶性胶质瘤细胞株和 46 例不同级别人脑胶质瘤 组织中 YAP 的表达, 结果显示 YAP 表达与胶质瘤级 别呈正相关, 提示 YAP 在胶质瘤中起癌基因作用 另外,YAP 是与肿瘤转移 化疗敏感性相关的重 要原癌基因, 并且是总体生存率和无瘤生存率的独立 [8] 预后指标 Zhang 等发现 YAP 可以提高卵巢癌细胞株表型转化, 且与卵巢癌化疗不敏感相关 ; 进一步的研究表明 YAP 高表达的肿瘤患者预后很差 Dano [9] vi 等研究发现 YAP 通过竞争性与 P73 结合并稳定其功能, 有助于促进细胞坏死 因此,YAP 可能是预测化疗敏感性和预后的重要指标 [10] Brent 等研究发现在人类脑胶质母细胞瘤中 YAP 核内高表达, 进一步体外研究证实转染 YAP 病毒载体使胶质瘤细胞中 YAP 高表达, 可促进胶质瘤细胞增殖 本课题组研究对转染 YAPsiRNA 的胶质瘤细胞株 SNB19 细胞进行细胞增殖 细胞周期时相分布 细胞侵袭以及凋亡检测, 发现 YAP 对 SNB19 的上 述生物学特性均有显著的影响 : 敲低 SNB19 细胞中 YAP 表达可以抑制肿瘤细胞增殖, 阻滞细胞周期于 G 0 G 1 期, 抑制肿瘤细胞的侵袭能力, 促进凋亡 ; 提示 YAP 通路对胶质瘤生物学行为具有重要调控作用, Hippo 信号通路为胶质瘤相关信号转导通路 同时, 尽管 YAP 在肝癌 肺癌以及卵巢癌等恶性肿瘤中高表达, 但在乳腺癌中却是低表达, 说明 YAP 与肿瘤类型之间存在关联, 但它们之间的联系比较复杂 YAP 表达的高低或缺失是否都能直接诱导肿瘤的发生和发展, 以及肿瘤 YAP 的表达与肿瘤其他因素之间是否存在关联等问题尚需进一步探究, 而这对于寻找新的治疗靶点有积极意义 参考文献 [1]PanD.Thehipposignalingpathwayindevelopmentandcancer[J]. DevCel,2010,19(4): [2]HongW,GuanKL.TheYAPandTAZtranscriptionco activators:key downstreamefectorsofthemammalianhippopathway[j].semincel DevBiol,2012,23(7): [3]PanD.Hipposignalinginorgansizecontrol[J].GenesDev,2007, 21(8): [4]ZhaoB,LeiQY,GuanKL.TheHippo YAPpathway:newconnec tionsbetweenregulationoforgansizeandcancer[j].curopincel Biol,2008,20(6): [5]XuMZ,TaoTJ,LeeNP,etal.Yes asociatedproteinisaninde pendentprognosticmarkerinhepatocelularcarcinoma[j].cancer, 2009,115(19): [6]WangY,DongQ,ZhangQ,etal.Overexpresionofyes asociated proteincontributestoprogresionandpoorprognosisofnon smal cel lungcancer[j].cancersci,2010,101(5): [7]YuanM,TomlinsonV,LaraR,etal.Yes asociatedprotein(yap) functionsasatumorsuppresorinbreast[j].celdeathdifer, 2008,15(11): [8]ZhangX,GeorgeJ,DebS,etal.TheHippopathwaytranscriptional co activator,yap,isanovariancanceroncogene[j].oncogene, 2011,30(25): [9]DanoviSA,RosiM,GudmundsdotirK,etal.Yes asociatedprotein

5 688 国际肿瘤学杂志 2014 年 9 月第 41 卷第 9 期 JIntOncol,September2014,Vol 41,No 9 (YAP)isacriticalmediatorofc Jun dependentapoptosis[j].cel DeathDifer,2008,15(1): [10]BrentA,BaiH,JainD,etal.Yes asociatedprotein1iswidely expresedinhumanbraintumorsandpromotesglioblastomagrowth [J].JNeuropatholExpNeurol,2011,70(7): ( 收稿日期 : 修回日期 : ) 论著 非小细胞肺癌中 DLC 1 ROCKⅠ 的表达及其临床意义 翟玉洁范庆帅宁方玲刘长民赵大华陈绍水 摘要 目的探讨肝癌缺失基因 1(DLC 1) 和 Rho 相关卷曲螺旋形成蛋白激酶 Ⅰ(ROCKⅠ) 在非小细胞肺癌 (NSCLC) 中的表达及其临床意义 方法选取 48 例手术切除并经病理检查证实的 NSCLC 组织及癌旁组织, 采用免疫组织化学 EnVision 法检测 DLC 1 ROCKⅠ 蛋白的表达, 并分析二者之间的相关性及其与临床病理特征的关系, 探讨 DLC 1 基因对 NSCLC 患者的预后价值 结果 DLC 1 蛋白在 NSCLC 组织中呈低表达或表达缺失, 阳性表达率为 33.3%(16/48), 明显低于癌旁组织的 70.8% (34/48), 差异有统计学意义 (χ 2 =13.523,P<0.01);ROCKⅠ 蛋白在 NSCLC 中的阳性表达率为 58.3% (28/48), 高于癌旁组织的 0(0/48), 差异有统计学意义 (χ 2 =39.529,P<0.01);NSCLC 中 DLC 1 的表达与性别 吸烟史 组织类型等无关, 与肿瘤分化程度 淋巴结转移 TNM 分期有关, 且差异有统计学意义 ; DLC 1 阳性表达组中 ROCKⅠ 的阳性表达率为 37.5% (6/16), 而 ROCKⅠ 的阴性表达率为 68.8% (22/32), 相关分析提示 DLC 1 与 ROCKⅠ 在 NSCLC 中表达呈负相关 (r=-2.214,p=0.039);dlc 1 蛋白高表达组 3 年生存率高于低表达组, 差异有统计学意义 (P=0.043) 结论 DLC 1 蛋白的低表达或表达缺失 ROCKⅠ 蛋白的表达在 NSCLC 的发生 发展中可能扮演重要角色, 检测 DLC 1 及 ROCKⅠ 蛋白的表达, 有助于判断 NSCLC 的生物学行为及预后 关键词 癌, 非小细胞肺 ; 预后 ; 肝癌缺失基因 1;Rho 相关卷曲螺旋形成蛋白酶 Ⅰ ExpresionsandclinicalsignificancesofDLC 1andROCKⅠ innon smalcellungcancer ZhaiYujie, FanQingshuai,NingFangling,LiuChangmin,ZhaoDahua,ChenShaoshui.DepartmentofOncology,Afili atedhospitalofbinzhoumedicaluniversity,binzhou256600,china Corespondingauthor:ChenShaoshui,E mail:chenshaoshui@yeah.net Abstract Objective Toexploretheexpresionsandclinicalsignificancesofdeletedinlivercancer 1 (DLC 1) and Rhoasociated coiledcoilformingprotein kinase(rock)Ⅰ in non smallungcancer (NSCLC).Methods TheexpresionsofDLC 1andROCKⅠ innsclcandadjacenttisueof48patients withpathologicalyconfirmedasnsclcandundergonesurgicalresectionweredetectedbyimmunohistochemis tryenvisionmethod.thecorelationsamongdlc 1protein,ROCKⅠ proteinandtheclinicalpathological characteristicswereanalyzed.theprognosticvalueofdlc 1inpatientswithNSCLCwasstudied.Results TheexpresionofDLC 1proteininNSCLC tisuewaslow ormising,andthepositiveratewas33.3% (16/48),significantlylowerthanthatinthetisueadjacenttocarcinoma70.8% (34/48),withstatistical significance(χ 2 =13.523,P<0.01).ThepositiveexpresionrateofROCKⅠ proteininnsclcwas58.3% (28/48),higherthanthatoftisueadjacenttocarcinoma0(0/48),withstatisticalsignificance(χ 2 =39.529, P<0.01).TheexpresionofDLC 1proteinwascorelatedwithtumordiferentiation,lymphnodemetastasis andclinicalstage,ratherthanwithsex,smokinghistoryandorganizationtype.throughthecorelationanaly DOI: /cma.j.isn X 作者单位 : 滨州医学院附属医院肿瘤科 通信作者 : 陈绍水,E mail:chenshaoshui@yeah.net

12 (autophagy),imagej,,, 3 [1-4] (self-eating) Transwelinvasion, 20μmol L -1 LY A549 [5] PI3K/AKT 24h,PBS, [6-8],, ml -1 ( ) 600μL

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