642 国际肿瘤学杂志 2017 年 9 月第 44 卷第 9 期 JIntOncol,September2017,Vol 44,No 9 rescencemicroscopewasappliedtoobservethemorphologicalultrastructureofmitochondri

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玄豪米
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1 国际肿瘤学杂志 2017 年 9 月第 44 卷第 9 期 JIntOncol,September2017,Vol 44,No 论著 Mfn 2 基因对人乳腺癌 T47D 细胞光动力疗法敏感性的影响及其作用机制邱梅清王涛佟仲生贾勇圣摘要目的探讨过表达 Mfn 2 基因对人乳腺癌 T47D 细胞光动力疗法 (PDT) 敏感性的影响及其可能机制方法转染 pegfp 和 pegfp Mfn 2 至 T47D 细胞, 实时定量 PCR(RT PCR) 和 Western bloting 分别检测人乳腺癌 T47D 细胞中 pegfp 组和 pegfp Mfn 2 组 Mfn 2mRNA 和 Mfn 2 蛋白的表达 ; pegfp 组 pegfp Mfn 2 组转染 T47D 细胞 48h 后, 四甲基偶氮唑蓝 (MTT) 法检测细胞对 PDT 的敏感性 ; PDT 照射转染了 T47D 细胞的 pegfp 及 pegfp Mfn 2, 得到 pegfp+pdt 组和 pegfp Mfn 2+PDT 组流式细胞术检测 pegfp+pdt 组 pegfp Mfn 2+PDT 组 T47D 细胞凋亡及线粒体膜电位变化情况 ; 激光共聚焦显微镜观察 pegfp 组 pegfp Mfn 2 组 pegfp+pdt 组 pegfp Mfn 2+PDT 组线粒体超微形态结构结果 RT PCR 结果显示, 转染 pegfp 后 T47D 细胞中 Mfn 2mRNA 的表达量为 1.01±0.12, 转染 pegfp Mfn 2 后 T47D 细胞中 Mfn 2mRNA 的表达量为 ±41.72, 差异有统计学意义 (t= ,P<0.001) Westernbloting 检测结果显示, 与转染 pegfp 相比, 转染 pegfp Mfn 2 可明显提高 T47D 细胞中 Mfn 2 蛋白的表达 MTT 分析结果显示, 与转染 pegfp 相比,pEGFP Mfn 2 转染可明显提高 T47D 细胞对 PDT 的敏感性, 差异有统计学意义, 如亚甲蓝为 5.00μmol/ml 时,pEGFP+PDT 组和 pegfp Mfn 2+PDT 组乳腺癌 T47D 细胞生存率分别为 59.96% ±1.21% 46.50% ±1.72%(t=34.403, P<0.001) 流式细胞术检测结果显示, 与 pegfp+pdt 组相比,pEGFP Mfn 2+PDT 组细胞凋亡率明显升高, 差异有统计学意义 [(81.21±2.13)% (68.82±2.64)%,P=0.024] 与 pegfp+pdt 相比, pegfp Mfn 2+PDT 组线粒体膜电位明显降低, 差异有统计学意义 [(1.37±0.12)% (23.33± 1.86)%,P<0.001] 激光共聚焦显微镜显示,pEGFP 组细胞呈网状,pEGFP Mfn 2 组和 pegfp+pdt 组可导致线粒体融合, 而 pegfp Mfn 2+PDT 组可导致线粒体崩解, 完全失去其形态结构结论 Mfn 2 基因可能增强 T47D 细胞对 PDT 治疗的敏感性, 其机制可能与改变线粒体形态结构, 诱导线粒体途径凋亡有关关键词乳腺肿瘤 ; 基因, 线粒体 ; 光化学疗法 ; 药理作用分子作用机制 EfectsandmechanismofoverexpresionofMfn 2geneonphotodynamictherapysensitivityofT47Dcels inhuman breastcancer QiuMeiqing,WangTao,TongZhongsheng,JiaYongsheng.Departmentof Oncology,ZaozhuangMunicipalHospitalofShandongProvince,Zaozhuang277100,China Corespondingauthor:WangTao, wangtao1968@126.com Abstract Objective ToinvestigatetheefectsandposiblemechanismsofMfn 2geneoverexpresion on photodynamic therapy (PDT) sensitivity of T47D cels in human breast cancer. Methods pegfpandpegfp Mfn 2weretransfectedintohumanbreastcancerT47Dcels,andthenthemRNAandprotein expresionofmfn 2geneinT47Dcelsweredetectedbyreal timepcr(rt PCR)andWesternblotingin pegfpgroupandegfp Mfn 2group,respectively.AfterpEGFPandpEGFP Mfn 2weretransfectedintohuman breastcancert47dcelsfor48hours,methylthiazoliltetracolium(mtt)asaywasusedtomeasurethepdt sensitivityoft47dcelsinhumanbreastcancerinpegfpgroupandpegfp Mfn 2group.pEGFP+PDTgroup andpegfp Mfn 2+PDTgroupwereobtainedbyPDTiradiatingpEGFPandpEGFP Mfn 2whichweretransfec tedintohumanbreastcancert47dcels.celapoptosisandmitochondrialmembranepotentialoft47dcelswere asayedbyflowcytometryinpegfp+pdtgroupandpegfp Mfn 2+PDTgroup.Laserscanningconfocalfluo DOI: /cma.j.isn X 作者单位 : 山东省枣庄市立医院肿瘤科通信作者 : 王涛, wangtao1968@126.com

2 642 国际肿瘤学杂志 2017 年 9 月第 44 卷第 9 期 JIntOncol,September2017,Vol 44,No 9 rescencemicroscopewasappliedtoobservethemorphologicalultrastructureofmitochondriainpegfpgroup, pegfp Mfn 2group,pEGFP+PDTgroup,andpEGFP Mfn 2+PDTgroup.Results RT PCRshowedthatafter transfectingt47dcelswithpegfp,theexpresionofmfn 2mRNAwas1.01±0.12.AftertransfectingT47D celswithpegfp Mfn 2,theexpresionofMfn 2mRNAwas ±41.72.Therewasstatisticalsignificance (t=67.541,p<0.001).westernblotingrevealedthatcomparedwiththepegfpgroup,thepegfp Mfn 2 transfectiongrouphadhigherexpresionofmfn 2geneinT47D cels.mttasayshowedthatpegfp Mfn 2 transfectionsignificantlyenhancedthepdtsensitivityoft47dcelsinhumanbreastcancercomparedwiththe pegfp+pdtgroup.whentheconcentrationofmethylenebluewas5.00μmol/ml,thesurvivalrateofthe pegfp+pdtgroupandpegfp Mfn 2+PDTgroupwere(59.96% ±1.21%)vs.(46.50% ±1.72%),with significantdiference(t=34.403,p<0.001).flowcytometryasayshowedthatthecelapoptosisratesin pegfp Mfn 2+PDTgroupwasmarkedlyhighercomparedwiththepEGFP+PDTgroup[(81.21±2.13)% vs. (68.82±2.64)%,P=0.024],withstatisticalsignificance.Also,themitochondrialmembranepotentialwasobviously lowerinpegfp Mfn 2+PDTgroupcomparedwiththepEGFP+PDTgroup[(1.37±0.12)% vs.(23.33±1.86)%, P<0.001],withstatisticalsignificance.LaserscanningconfocalfluorescencemicroscopeshowedthatcelsinpEGFP groupshowednetworkstructure,bothpegfp Mfn 2groupandpEGFP+PDTgroupcouldcausemitochondrialfusion, andthepegfp Mfn 2+PDTgroupcouldinducemitochondrialdisintegrationandloseitsnormalmorphologycompletely. ConclusionMfn 2mayenhancethePDTsensitivityofT47Dcelsinhumanbreastcancer,whichisposiblyrelatedwith thenormalmorphologyalterationofmitochondriaandtheinducementofmitochondrialapoptosis. Keywords Breastneoplasms;Genes,mitochondrial;Photochemotherapy;Molecularmechanismsof pharmacologicalaction 乳腺癌是危害女性健康的重要肿瘤之一, 且有 5% ~19% 的乳腺癌患者会出现胸壁复发, 严重影响患者的生命质量, 缩短患者生存期光动力疗法 (photo dynamictherapy,pdt) 是一种新型治疗乳腺癌胸壁复发的方法, 而其对乳腺癌细胞株的作用及抗肿瘤机制尚不明确本研究以人乳腺癌 T47D 细胞株为研究对象, 探讨亚甲蓝介导的 PDT 对线粒体形态改变的作用, 为深入研究其机制提供一定的依据 Mfn 2 基因是 [1] 一种作用于线粒体外膜的增殖抑制基因,Xia 等研究显示 Mfn 2 可通过降低线粒体膜电位增强化疗药物的抗肿瘤活性本研究通过体外实验初步探索过表达 Mfn 2 基因对 PDT 敏感性的影响及其调控机制, 以期为治疗乳腺癌胸壁复发提供新思路 1 材料与方法 1 1 细胞株及主要试剂人乳腺癌细胞株 T47D 由本实验室保存 ; 胎牛血清改良型 RPMI1640 培养基等购自美国 Gibco 公司 ; 实时定量 PCR(RT PCR) 试剂盒购自日本 TAKARA 公司 ;TrizolRNA 抽提试剂 Lipofectamine TM 2000 购自美国 Invitrogen 公司 ;PDT 治疗的光敏剂亚甲蓝购自江苏济川制药有限公司,Mfn 2 抗体四甲基偶氮唑蓝 (MTT) 试剂盒购自美国 Sigma 公司 ; AnnexinV FITC 凋亡试剂盒购自美国 BD 公司 ; 线粒体荧光探针 MitoTrackerRED 购自上海杰美生物公司 ; 重组真核表达质粒 pegfp pegfp Mfn 2 由中国科学院动物所陈? 教授惠赠 ;PCR 引物由美国 In vitrogen 公司合成 1 2 pegfp Mfn 2 和 pegfp 质粒转染人乳腺癌 T47D 细胞株取对数生长期 T47D 细胞个接种于 6 孔培养板,37 5%CO 2 培养箱过夜, 培养至细胞汇合度 60% ~70%, 每孔细胞中分别加入 pegfp Mfn 2 pegfp 质粒各 4μg, 每孔均加入 10μlLipofectami ne TM 2000, 无血清培养基培养 6h 后更换含血清培养基转染 48h 后收集 T47D 细胞 1 3 RT PCR 检测人乳腺癌 T47D 细胞中 Mfn 2 mrna 的表达消化收集转染目的细胞, 按 Trizol 试剂盒说明书提取细胞总 RNA 按 TAKARA 试剂盒操作说明进行反转录成 Mfn 2cDNA, 根据基因库中 Mfn 2 的序列设计一对特异性引物,5 CATGGGCATTCTTGTTGTTG 3 ;5 TG GAGCCAGTGTAGCTGATG 3 按照 TAKARA SYBR RT PCR 的说明书进行扩增 Mfn 2 基因片段反应条件 :95 30s 预变性后,95 5s,60 34s, 72 30s, 共 40 个循环,72 10min,4 保存 1 4 Westernbloting 检测 T47D 细胞中 Mfn 2 蛋白的表达取 30g 细胞裂解液与上样缓冲液混合, 煮沸 10min 后上样, 行 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳 ; 电转移法将蛋白转移至 PVDF 膜, 用 5% 脱脂奶粉封闭,4 过夜一抗稀释度为 1 500, 室温孵育 2h; 二抗稀释度为 , 室温孵育 2h 后, 用电化学发光试

国际肿瘤学杂志 2017 年 9 月第 44 卷第 9 期 JIntOncol,September2017,Vol 44,No 9 643 剂盒处理并暗室显影以 β actin 为内参照图像运用 Quantitiveone 软件进行分析, 用 Mfn 2 蛋白条带与 β actin 条带的积分密度比值表示其蛋白水平 1 5 MTT 法检测转染 pegfp Mfn 2 质粒对人乳腺癌 T47D

3 国际肿瘤学杂志 2017 年 9 月第 44 卷第 9 期 JIntOncol,September2017,Vol 44,No 剂盒处理并暗室显影以 β actin 为内参照图像运用 Quantitiveone 软件进行分析, 用 Mfn 2 蛋白条带与 β actin 条带的积分密度比值表示其蛋白水平 1 5 MTT 法检测转染 pegfp Mfn 2 质粒对人乳腺癌 T47D 细胞增殖的影响取对数生长期 T47D 细胞接种于 6 孔板,pEGFP pegfp Mfn 2 转染至 T47D 细胞 48h 后, 按 / 孔细胞接种于 96 孔板,37 5%CO 2 培养箱过夜培养后加入不同浓度的亚甲蓝, 其各组亚甲蓝终浓度依次为 μmol/ml 置于 37 5%CO 2 培养箱避光孵育 4h 后吸除, 磷酸盐缓冲液 (PBS) 洗 2 遍, 每孔加入 1640 培养液 200μl 以波长 633nm 半导体激光 PDT 仪照射, 能量密度为 1.2J/cm 2, 照射结束后弃去原 1640 培养液, 换加含 10% 胎牛血清的培养液继续避光孵育 24h 后, 每孔加 5mg/mlMTT20μl,37 5%CO 2 培养箱孵育 4h, 弃培养基, 每孔加 DMSO150μl, 充分振荡 10min 在全自动酶标仪上检测 490nm 吸光度 (A) 值, 细胞增殖抑制率 (%)=(1-A 实验组 /A 空白对照组 ) 100%, 实验重复 3 次 1 6 Annexin V/PI 双标检测人乳腺癌 T47D 细胞的凋亡 T47D 细胞转染 pegfp 和 pegfp Mfn 248h 后, 根据是否接受 PDT 照射分为 4 组, 分别是 pegfp 组 pegfp Mfn 2 组 pegfp+pdt pegfp Mfn 2+PDT 组离心前处理如下 : 转染质粒后 pegfp 组 pegfp Mfn 2 组分别加终浓度 0 μmol/ml 的亚甲蓝, pegfp+pdt pegfp Mfn 2+PDT 组分别加终浓度 5.00μmol/ml 的亚甲蓝置于 37 5%CO 2 培养箱避光孵育 4h 后吸除,PBS 洗 2 遍, 每孔加入 1640 培养液 200μl pegfp+pdt 组和 pegfp Mfn 2+PDT 组以波长 633nm 半导体激光 PDT 仪照射, 能量密度为 1.2J/cm 2, 照射结束后弃去原 1640 培养液, 换加含 10% 胎牛血清的培养液, 继续避光孵育 24h 后收集细胞用预冷的 PBS 洗涤细胞离心 5 min (1000r/min, 离心半径 5cm) 后再悬浮于 100μl 缓冲液中, 加 5μlAnnexinV 和 5μlPI, 避光保存 15min, 加入 400μl 的缓冲液, 上流式细胞仪检测, CelQuest 软件分析每组重复 3 次, 取平均值 1 7 线粒体荧光探针 MitoTrackerRED 染色法检测线粒体膜电位 T47D 细胞的分组及处理同上, 后加入终浓度为 10μg/ml 的线粒体探针 MitoTrackerRED, 避光孵育 30min PBS 洗 3 遍后上机检测, 激发波长分别为 579nm 和 599nm, 用流式细胞仪检测线粒体膜电位的变化 1 8 激光共聚焦显微镜下观察人乳腺癌 T47D 细胞线粒体形态结构的变化 T47D 细胞接种于共聚焦专用培养皿, 分组和其他处理同上, 后加入终浓度为 10μg/ml 的线粒体探针 MitoTrackerRED, 避光孵育 30min 在激光共聚焦显微镜下观察各组细胞线粒体形态结构的变化 1 9 统计学处理采用 SPSS16.0 软件进行统计学分析, 计量资料以 x±s 表示, 两组间比较采用 t 检验, 多组间比较采用单因素方差分析, 进一步两两比较采用 LSD t 检验 ; 检验水准 α= 结果 2 1 pegfp Mfn 2 转染上调 T47D 细胞中 Mfn 2 mrna 和蛋白的表达 RT PCR 检测结果显示, 转染 pegfp 后 T47D 细胞 Mfn 2 mrna 的表达量为 1.01±0.12, 转染 pegfp Mfn 2 后 T47D 细胞中 Mfn 2mRNA 的表达量为 ±41.72, 差异有统计学意义 (t=67.541, P<0.001) Westernbloting 检测结果显示, 与转染 pegfp 相比, 转染 pegfp Mfn 2 可明显提高 T47D 细胞中 Mfn 2 蛋白的表达 ( 图 2), 由此可见,pEGFP Mfn 2 转染至 T47D 细胞可以高表达 Mfn 2 蛋白注 :1 为 pegfp;2 为 pegfp Mfn 2 图 2 转染 pegfp 和 pegfp Mfn 2T47D 细胞 Mfn 2 蛋白表达水平 2 2 过表达 Mfn 2 增强 PDT 对 T47D 细胞的增殖抑制作用 MTT 法检测结果显示 ( 表 1), 不同亚甲蓝浓度下,pEGFP+PDT 组和 pegfp Mfn 2+PDT 组乳腺癌 T47D 细胞生存率差异均有统计学意义亚甲蓝浓度为 μmol/ml 时, pegfp Mfn 2+PDT 组与 pegfp+pdt 组 T47D 细胞的生存率相比, 差异均有统计学意义通过以上数据计算出亚甲蓝半抑制浓度 (IC 50 ) 为 7.34μmol/ml, 选取 5.00μmol/ml 为后续实验给药浓度 2 3 过表达 Mfn 2 促进 PDT 对 T47D 细胞诱导凋亡的作用流式细胞术检测结果显示 ( 图 3),pEGFP 组 (3.21±0.34)% pegfp + PDT 组 (68.82 ±

国际肿瘤学杂志１７年月第卷第期ＪＩｎｔｏｎｃｏｌＳｅｐｔｅｍｂｅｒ１７ＶｏｌＮｏｐ组７±１７５ｐＰＤＴ组线粒体膜电位较ｐＥＧＦＰＰＤＴ组明显降低ＰＤＴ组８１１± １３组细胞凋亡率差差异有统计学意义Ｐ１异有统计学意义Ｆ１１７Ｐ１ｐ５激光共聚焦显微镜观察各组细胞线粒体形态结构变化ＰＤＴ诱导细胞凋亡作用更加明显

合１３８ｐＥＧＦＰＰＤＴ组３３３±１８ｐｐＥＧＦＰＰＤＴ组大部分细胞荧光强度减弱线粒体呈ＰＤＴ组１３７± １组差异具有统计点状融合ｐＰＤＴ组大部分细胞脱落学意义Ｆ５８１３Ｐ１ｐ偶见部分未脱落细胞线粒体已失去形态结构表１不同亚甲蓝浓度下乳腺癌Ｔ７Ｄ细胞的生存率亚甲蓝浓度 μｍｏｌｍｌ组别Ｆ值１５５５１Ｐ值

4 国际肿瘤学杂志１７年月第卷第期ＪＩｎｔｏｎｃｏｌＳｅｐｔｅｍｂｅｒ１７ＶｏｌＮｏｐ组７±１７５ｐＰＤＴ组线粒体膜电位较ｐＥＧＦＰＰＤＴ组明显降低ＰＤＴ组８１１± １３组细胞凋亡率差差异有统计学意义Ｐ１异有统计学意义Ｆ１１７Ｐ１ｐ５激光共聚焦显微镜观察各组细胞线粒体形态结构变化ＰＤＴ诱导细胞凋亡作用更加明显与ｐＥＧＦＰＰＤＴ组比较差异具有统计学意义Ｐ激光共聚焦显微镜显示图５ｐＥＧＦＰ组细胞状流式细胞术检测各组细胞线粒体膜电位变化态良好线粒体荧光探针定位于胞质内显示为红色流式细胞术结果显示图ｐＥＧＥＰ组荧光呈网状ｐ转染组部分细胞胞质荧５３３± １ｐ组１３３± 光强度较ｐＥＧＦＰ组稍弱线粒体呈点状融合１３８ｐＥＧＦＰＰＤＴ组３３３±１８ｐｐＥＧＦＰＰＤＴ组大部分细胞荧光强度减弱线粒体呈ＰＤＴ组１３７± １组差异具有统计点状融合ｐＰＤＴ组大部分细胞脱落学意义Ｆ５８１３Ｐ１ｐ偶见部分未脱落细胞线粒体已失去形态结构表１不同亚甲蓝浓度下乳腺癌Ｔ７Ｄ细胞的生存率亚甲蓝浓度 μｍｏｌｍｌ组别Ｆ值１５５５１Ｐ值ｐｅｇｆｐＰＤＴ组１ ±３１ ±１８３± ５１５ ±１７７± ３１１ ± ３１１ｐＰＤＴ组１ ±３８３５± ８ ±１５±１７５７±１８８５５± １８３７３１ｔ值３７５７７３３３５８８８８Ｐ值８１１１１１注ＰＤＴ为光动力疗法ｐｅｇｆｐＰＤＴ组为光动力治疗组ｐＰＤＴ组为基因联合光动力治疗组注ＰＤＴ为光动力疗法ｐＥＧＦＰ组为对照组ｐ组为基因组ｐｅｇｆｐＰＤＴ组为光动力治疗组ｐＰＤＴ组为基因联合光动力治疗组图３流式细胞术检测各组乳腺癌Ｔ７Ｄ细胞的凋亡率注ＰＤＴ为光动力疗法ｐＥＧＦＰ组为对照组ｐ组为基因组ｐｅｇｆｐＰＤＴ组为光动力治疗组ｐｎＰＤＴ组为基因联合光动力治疗组图流式细胞术检测各组乳腺癌Ｔ７Ｄ细胞线粒体膜电位变化

国际肿瘤学杂志 2017 年 9 月第 44 卷第 9 期 JIntOncol,September2017,Vol 44,No 9 645 注 :A 为 pegfp 组 ;B 为 pegfp Mfn 2 组 ;C 为 pegfp+pdt 组 ;D 为 pegfp Mfn 2+PDT 组 ; PDT 为光动力疗法 ;pegfp 组为对照组 ;pegfp Mfn 2 组为 Mfn 2 基因组

5 国际肿瘤学杂志 2017 年 9 月第 44 卷第 9 期 JIntOncol,September2017,Vol 44,No 注 :A 为 pegfp 组 ;B 为 pegfp Mfn 2 组 ;C 为 pegfp+pdt 组 ;D 为 pegfp Mfn 2+PDT 组 ; PDT 为光动力疗法 ;pegfp 组为对照组 ;pegfp Mfn 2 组为 Mfn 2 基因组 ;pegfp+pdt 组为光动力治疗组 ;pegfp Mfn 2+PDT 组为 Mfn 2 基因联合光动力治疗组图 5 激光共聚焦显微镜显示各组乳腺癌 T47D 细胞线粒体形态结构变化讨论乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一, 发病率逐年上升根据我国癌症死亡率变化趋势报道, 胃癌食管鼻咽及宫颈部位的肿瘤死亡率均出现下降, 而肺癌及女性乳腺癌死亡率则呈上升趋势 [2] 同时有研究显示, 晚期乳腺癌中有 5% ~19% 的乳腺癌患者会出现局部胸壁复发 [3] PDT 是继化疗放疗内分泌治疗靶向治疗之后的一种新型治疗乳腺癌胸壁复发的方法 PDT 对体内肿瘤的杀伤机制较为复杂, 目前尚不清楚有研究显示, 光敏剂的亚细胞定位是决定 PDT 效应的关键因素 [4] 不同的光敏剂其亚细胞定位不同, 目前报道多见定位于线粒体的多种光敏剂, 如 5 氨基酮戊酸苯卟啉衍生物单元酸 A 及亚甲蓝等 [5] 亚甲蓝是一种氧化剂, 临床上应用于高铁血红蛋白血症的治疗近期发现亚甲蓝在 633nm 激光照射下, 可通过 Ⅱ 型光敏反应产生较高的活性氧簇和自由基, 可作为 PDT 的光敏剂 [6 7] [8] Yan 等进行的亚甲蓝介导 PDT 治疗乳腺癌 MCF 7 细胞株的试验显示亚甲蓝介导的 PDT 可明显抑制 MCF 7 细胞株的生长, 诱导细胞凋亡本研究进行的亚甲蓝介导 PDT 治疗乳腺癌 T47D 细胞株的试验也得出类似结果, 结果显示在 1.25μmol/ml 亚甲蓝浓度进行 PDT 时,PDT 即可明显抑制 T47D 细胞的生长 ; 且在同一照射剂量下, 随着亚甲蓝浓度增加,T47D 细胞生存率明显下降同时流式细胞术结果显示, 与对照组相比,PDT 组细胞凋亡率显著升高, 凋亡率高达约 68% PDT 组可明显降低 T47D 细胞线粒体膜电位此结果提示亚甲蓝介导的 PDT 可能是通过线粒体介导的凋亡通路诱导细胞凋亡的线粒体结构是功能的基础, 研究发现线粒体在细胞内彼此连接, 呈现立体的管网状结构, 并且发生频繁的融合与分裂 [9 10] 而线粒体的融合分裂与细胞凋亡密切相关, 凋亡早期线粒体网络往往发生明显的片断化, 线粒体形态的调控分子参与了细胞凋亡, 调控凋亡的分子也会明显改变线粒体的形态 [11] 本研究通过激光共聚焦显微镜观察到,PDT 引起细胞凋亡后线粒体形态发生明显的片段化, 此结果提示调控凋亡的分子也会明显改变线粒体形态现在已知的介导线粒体融合的分子主要有 Mfn 1 Mfn 2 核基因 OPA1; 介导线粒体分裂的分子主要有发动蛋白相关蛋白 1 线粒体分裂基因 Fis1 [12] Mfn 2 是应用差异显示方法克隆得到的一种作用于线粒体外膜的增殖抑制基因, 对线粒体的融合线粒体的形态和功能的调节有着重要的作用 [13 14] 目前研究发现,Mfn 2 是 p53 抑癌基因调控的靶基因, Mfn 2 可通过介导线粒体凋亡通路, 上调 Bax 凋亡蛋白的表达 [15 16] [17] Wang 等进行的 Mfn 2 对肝癌细胞株增殖的研究也证实了这一结果同时 Mfn 2 蛋白在线粒体外膜和内质网都有丰富的表达, 不仅调控着线粒体的正常形态和功能, 而且调节着内质网的应激和内质网 Ca 2+ 的释放 [18 19] 这些可能与 Mfn 2 抑制癌细胞增殖和诱导凋亡密切相关本研究通过 MTT 法比较转染空载体 pegfp 与 pegfp Mfn 2 对 T47D 细胞株生存率的影响, 结果显示过表达 Mfn 2 基因可明显抑制细胞生存同时流式细胞术结果显示 Mfn 2 基因能够明显促进细胞凋亡这些结果提示 Mfn 2 自身可通过改变线粒体形态及膜电位, 抑制细胞增殖, 诱导细胞凋亡 [1] Xia 等研究显示,Mfn 2 可通过降低线粒体膜电位增强化疗药物的抗肿瘤活性本课题组前期研究结果显示,Mfn 2 可增强小白菊内酯化疗的敏感性 [20] 本研究结果显示 Mfn 2 转染可使 PDT 抑制细胞增殖, 诱导细胞凋亡同时流式细胞术结果显示过表达 Mfn 2 基因联合 PDT 可显著降低线粒体膜电位 ; 激光显微镜结果显示过表达 Mfn 2 基因联合 PDT 可导致线粒体崩解, 完全失去其正常的形态结果这一结果提示 Mfn 2 可增强 PDT 的敏感性, 其机制可能与

6 646 国际肿瘤学杂志 2017 年 9 月第 44 卷第 9 期 JIntOncol,September2017,Vol 44,No 9 显著降低线粒体的膜电位及改变线粒体正常线粒体结构有关但过表达 Mfn 2 基因增强 PDT 敏感性的分子机制尚需进一步深入研究综上所述, 亚甲蓝介导的 PDT 可明显抑制乳腺癌 T47D 细胞株的增殖,Mfn 2 可显著增强 PDT 的抗肿瘤活性, 其机制可能与 Mfn 2 基因通过线粒体介导的凋亡通路诱导细胞凋亡和改变线粒体形态结构有关本研究为 PDT 的抗肿瘤分子机制提供了新的线索, 尚需进一步深入研究参考文献 [1]XiaY,WuYQ,ZhengQC,etal.Efectofmitofusin 2geneinapop tosisofhumanbreastcarcinomacellineinvitro[j].zhonghuazhong LiuZaZhi,2007,29(9): [2]CardosoF,Senkus KonefkaE,FalowfieldL,etal.Localyrecurent ormetastaticbreastcancer:esmo ClinicalPracticeGuidelinesfor diagnosis,treatmentandfolow up[j].annoncol,2010,21suppl 5:v15 v19.doi: /annonc/mdq160. [3]GuoP,HuangZL,YuP,etal.TrendsincancermortalityinChina: anupdate[j].annoncol,2012,23(10): DOI: /annonc/mds069. [4]DavilaML.Photodynamictherapy[J].GastrointestEndoscClinN Am,2011,21(1):67 79.DOI: /j.giec [5]IsaMC,Manela AzulayM.Photodynamictherapy:areviewoftheli teratureandimagedocumentation[j].anbrasdermatol,2010,85 (4): [6]TuiteEM,KelyJM.Photochemicalinteractionsofmethyleneblueand analogueswithdnaandotherbiologicalsubstrates[j].jphotochem PhotobiolB,1993,21(2 3): [7]TardivoJP,DelGiglioA,deOliveiraCS,etal.Methylenebluein photodynamictherapy:frombasicmechanismstoclinicalapplications [J].PhotodiagnosisPhotodynTher,2005,2(3): DOI: /S (05) [8]YanF,ZhangY,KimKS,etal.Celularuptakeandphotodynamic activityofproteinnanocagescontainingmethylenebluephotosensitizing drug[j].photochemphotobiol,2010,86(3): DOI: /j x. [9]RizutoR,PintonP,CaringtonW,etal.Closecontactswiththeen doplasmicreticulum asdeterminantsofmitochondrialca 2+ responses [J].Science,1998,280(5370): [10]Bereiter HahnJ,V thm.dynamicsofmitochondriainlivingcels: shapechanges,dislocations,fusion,andfisionofmitochondria[j]. MicroscResTech,1994,27(3): DOI: /jemt [11]KarbowskiM,YouleRJ.Dynamicsofmitochondrialmorphologyin healthycelsandduringapoptosis[j].celdeathdifer,2003,10 (8): DOI: /sj.cdd [12]YouleRJ,vanderBliekAM.Mitochondrialfision,fusion,and stres[j].science,2012,337(6098): DOI: /science [13]ZorzanoA,LiesaM,SebastiánD,etal.Mitochondrialfusionpro teins:dualregulatorsofmorphologyandmetabolism[j].semincel DevBiol,2010,21(6): DOI: /j.semcdb [14]EuraY,IshiharaN,OkaT,etal.Identificationofanovelprotein thatregulatesmitochondrialfusionbymodulatingmitofusin(mfn) proteinfunction[j].jcelsci,2006,119(pt23): DOI: /jcs [15]WangW,LuJ,ZhuF,etal.Pro apoptoticandanti proliferative efectsofmitofusin 2viaBaxsignalinginhepatocelularcarcinoma cels[j].medoncol,2011,29(1):70 76.DOI: / s [16]WangW,ChengX,LuJ,etal.Mitofusin 2isanoveldirecttarget ofp53[j].biochem BiophysResCommun,2012,400(4): DOI: /j.bbrc [17]WangW,ZhouD,WeiJ,etal.HepatitisBvirusXproteininhibits p53 mediatedupregulationofmitofusin 2inhepatocelularcarcinoma cels[j].biochembiophysrescommun,2012,421(2): DOI: /j.bbrc [18]deBritoOM,ScoranoL.Mitofusin2tethersendoplasmicreticulum tomitochondria[j].nature,2008,456(7222): DOI: /nature [19]NgohGA,PapanicolaouKN,WalshK.Losofmitofusin2promotes endoplasmicreticulum stres[j].jbiolchem,2012,287(24): DOI: /jbc.M [20] 邱梅清, 佟仲生, 贾勇圣, 等. 线粒体融合蛋白 2 基因增强人乳腺癌 T47D 细胞对小白菊内酯的敏感性 [J]. 中国肿瘤生物治疗杂志,2013,20(1):37 42.DOI: /j.isn X ( 收稿日期 : 修回日期 : ) ( 本文编辑 : 张晶晶 )

材料方法

材料方法生物技术通报张发洲杨慧兰为了构建单纯疱疹病毒型感染细胞多肽真核表达质粒应用技术从株的基因组中扩增基因并连接至真核表达载体对阳性克隆进行菌落酶切和测序鉴定后成功构建了重组质粒用转染试剂盒将重组质粒转染至细胞中并用及检测其表达情况结果显示基因在细胞中得到正确表达真核表达质粒的构建成功为进一步研究对宿主细胞的影响奠定了基础单纯疱疹病毒型感染细胞多肽