208 中华消化外科杂志 2014 年 3 月第 13 卷第 3 期 ChinJDigSurg,March2014,Vol.13,No.3 Abstract Objective Toinvestigatethemechanismsoferythropoietin producinghepatocel

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稀籍洪
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1 中华消化外科杂志 2014 年 3 月第 13 卷第 3 期 ChinJDigSurg,March2014,Vol.13,No EphA3 通过调控 VEGF 参与肝癌细胞侵袭的机制论著周亮王德盛赵辉何楠楠寇明文窦科峰摘要目的探讨促红细胞生成素肝细胞受体 A3(EphA3) 参与肝癌细胞侵袭的作用机制方法培养人肝细胞 HL 7702 和肝癌细胞株 HepG2 和 MHCC97H 采用 sirna 干扰的方法抑制肝癌细胞中 EphA3 的表达设立未处理组 ( 未处理肝癌细胞 ), 对照组 ( 加入对照 sirna) 和 sirna 干扰组 ( 加入 sirna 干扰 EphA3) 用 RT PCR 和 Westernblot 法检测 EphA3 的表达 ; 用 Transwel 小室检测不同处理后的 HepG2 和 MHCC97H 细胞的侵袭能力 ; 采用 Westernblot 和 ELISA 法检测 VEGF 蛋白表达和活力的变化情况多组比较采用单因素方差分析, 组间比较采用 LSD t 检验结果 HL 7702 HepG2 和 MHCC97H 中 EphA3mRNA 的相对表达量分别为 0 94± ±0 16 和 3 62±0 14;EphA3 蛋白的相对表达量分别为 0 96± ±0 11 和 3 82±0 11, 非肿瘤细胞与肝癌细胞中 EphA3 表达比较, 差异有统计学意义 (t=2.511,6.437;2.321,6.895,p<0.05) RT PCR 法检测 HepG2 细胞系中未处理组对照组 sirna 干扰组 EphA3mRNA 的相对表达量分别为 0 95± ±0 12 和 0 31±0 15,siRNA 干扰组与对照组比较, 差异有统计学意义 (t=4 051,P<0 05);MHCC97H 细胞中 EphA3mRNA 的相对表达量分别为 0 97± ±0 14 和 0 40±0 11,siRNA 干扰组与对照组比较, 差异有统计学意义 (t=5 237,P<0 05); Westernblot 法检测 3 组 HepG2 细胞中 EphA3 蛋白的相对表达量分别为 0 97± ±0 15 和 0 32± 0 17,siRNA 干扰组与对照组比较, 差异有统计学意义 (t=4 145,P<0 05);MHCC97H 细胞中 EphA3 蛋白的相对表达量分别为 0 95± ±0 12 和 0 38±0 17,siRNA 干扰组与对照组比较, 差异有统计学意义 (t=4 327,P<0 05) 采用体外侵袭实验, 检测 3 组穿透的细胞数量,HepG2 细胞系细胞数量分别为 (111±4) 个 /10HPF (109±5) 个 /10HPF 和 (51±3) 个 /10HPF,siRNA 干扰组与对照组比较, 差异有统计学意义 (t=7 582,P<0 05);MHCC97H 细胞系细胞数量分别为 (402±6) 个 /10HPF (397±7) 个 /10HPF 和 (152±7) 个 /10HPF,siRNA 干扰组与对照组比较, 差异有统计学意义 (t=9 479,P<0 05) Westernblot 法检测 HepG2 细胞系中 3 组 VEGF 蛋白的相对表达量分别为 0 98± ±0 13 和 0 57±0 11, sirna 干扰组与对照组比较, 差异有统计学意义 (t=3 167,P<0 05);Westernblot 法检测 MHCC97H 细胞系中 3 组 VEGF 蛋白的相对表达量分别为 0 97± ±0 12 和 0 34±0 15,siRNA 干扰组与对照组比较, 差异有统计学意义 (t=4 278,P<0 05) ELISA 法检测 HepG2 细胞系中 3 组 VEGF 蛋白的相对活力 OD 值分别为 0 96± ±0 11 和 0 47±0 13,siRNA 干扰组与对照组比较, 差异有统计学意义 (t= 3 981,P<0 05);MHCC97H 细胞中 VEGF 蛋白的相对活力 OD 值分别为 0 98± ±0 12 和 0 38± 0 14,siRNA 干扰组与对照组比较, 差异有统计学意义 (t=4 059,P<0 05) 结论 EphA3 可能是通过调控 VEGF 蛋白表达和活性来实现肝癌细胞的侵袭, 提示 EphA3 可作为肝癌治疗的新靶点关键词肝肿瘤 ; 促红细胞生成素肝细胞受体 A3; 血管内皮生长因子 ; 侵袭 Mechanismsoferythropoietin producinghepatocelulara3participatingintheinvasionofhepatocelular carcinomacelsviaregulatingvascularendothelialgrowthfactor ZhouLiang,WangDesheng,ZhaoHui, HeNannan,KouMingwen,DouKefeng. DepartmentofGeneralSurgery,No.155HospitalofPLA,Kaifeng ,China Corespondingauthor:DouKefeng,DepartmentofHepatopancreatobiliary& SplenicSurgery,XijingHospital, Xi an710032,china, kefengdou@126.com DOI: /cma.j.isn 基金项目 : 国家自然科学基金重点项目 ( ) 作者单位 : 开封, 解放军第一五五医院普通外科 ( 周亮赵辉何楠楠寇明文 ); 西安, 第四军医大学西京医院肝胆胰脾外科 ( 王德盛窦科峰 ) 通信作者 : 窦科峰, kefengdou@126.com

2 208 中华消化外科杂志 2014 年 3 月第 13 卷第 3 期 ChinJDigSurg,March2014,Vol.13,No.3 Abstract Objective Toinvestigatethemechanismsoferythropoietin producinghepatocelulara3 (EphA3)intheinvasionofhepatocelularcarcinoma(HCC)cels.Methods HepaticcelHL 7702andHCC celandhcc cellineshepg2andmhcc97h werecultured.theexpresionofepha3inthehepg2and MHCC97HcelswassuppresedbysiRNA interference,andthenweredividedintotheuntreatedgroup,the controlgroupandthesirnainterventiongroup.theexpresionofepha3wasdetectedbyrt PCRandWestern blot.theinvasionabilityofhepg2andmhcc97hwasdetectedbytranswelchamber.theproteinexpresionof VEGFandactivityofvascularendothelialgrowthfactor(VEGF)weredetectedbywesternblotandELISA.Al datawereanalyzedusingtheanalysisofvarianceorlsd ttest.results TherelativemRNA expresionsof EphA3inHL 7702,HepG2,andMHCC97Hcelswere0.94±0.13,1.76±0.16and3.62±0.14,respectively, andtheproteinexpresionsofepha3inthe3celswere0.96±0.12,1.59±0.11and3.82±0.11.therewas significantdiferenceintheepha3expresionbetweenhl 7702celsandHepG2,MHCC97Hcels(t=2.511, 6.437;2.321,6.895,P<0.05).TherelativemRNAexpresionsofEphA3intheHepG2celsintheuntreated group,thecontrolgroupandthesirnainterventiongroupwere0.95±0.11,0.96±0.12and0.31±0.15, respectively.therewassignificantdiferenceinthemrnaexpresionofepha3inthehepg2celsbetweenthe sirnainterventiongroupandthecontrolgroup(t=4.051,p<0.05).therelativemrnaexpresionsofepha3 inthemhcc97hcelsintheuntreatedgroup,thecontrolgroupandthesirnainterventiongroupwere0.97± 0.16,0.95±0.14and0.40±0.11,respectively.TherewassignificantdiferenceinthemRNAexpresionof EphA3intheMHCC97HcelsbetweenthesiRNAinterferencegroupandthecontrolgroup(t=5.237,P<0.05). TherelativeproteinexpresionsofEphA3intheHepG2celsintheuntreatedgroup,thecontrolgroupandthe sirnainterventiongroupwere0.97±0.16,0.95±0.15and0.32±0.17,respectively.therewassignificant diferenceintheproteinexpresionofepha3inthehepg2celsbetweenthesirnainterferencegroupandthe controlgroup(t=4.145,p<0.05).therelativeproteinexpresionsofepha3inthemhcc97h celsinthe untreatedgroup,thecontrolgroupandthesirnainterventiongroupwere0.95±0.11,0.96±0.12and0.38± 0.17,respectively.TherewassignificantdiferenceintheproteinexpresionsofEphA3intheMHCC97H cels betweenthesirnainterferencegroupandthecontrolgroup(t=4.327,p<0.05).thenumbersofhepg2cels penetratedthewatrigelintheuntreatedgroup,thecontrolgroupandthesirnainterventiongroupwere(111±4)/ 10HPF,(109±5)/10HPFand(51±3)/10HPF,respectively.Therewassignificantdiferenceinthenumberof HepG2celsbetweenthesiRNAinterferencegroupandthecontrolgroup(t=7.582,P<0.05).Thenumbersof MHCC97HcelspenetratedtheWatrigelintheuntreatedgroup,thecontrolgroupandthesiRNA intervention groupwere(402±6)/10hpf,(397±7)/10hpfand(152±7)/10hpf,respectively.therewassignificant diferenceinthenumberofmhcc97hcelsbetweenthesirnainterferencegroupandthecontrolgroup(t=9.479, P<0.05).TherelativeproteinexpresionsofVEGFintheHepG2celsintheuntreatedgroup,thecontrolgroup andthesirnainterventiongroupwere0.98±0.11,0.96±0.13and0.57±0.11,respectively.therewassig nificantdiferenceintheproteinexpresionofvegfofthehepg2celsbetweenthesirnainterferencegroupand thecontrolgroup(t=3.167,p<0.05).therelativeproteinexpresionofvegfinthemhcc97hcelsinthe untreatedgroup,thecontrolgroupandthesirnainterventiongroupwere0.97±0.14,0.98±0.12and0.34± 0.15,respectively.TherewassignificantdiferenceintheproteinexpresionofVEGFoftheMHCC97H cels betweenthesirnainterferencegroupandthecontrolgroup(t=4.278,p<0.05).therelativeactivitiesof VEGFproteinsofHepG2celsintheuntreatedgroup,thecontrolgroupandthesiRNAinterventiongroupwere 0.96±0.15,0.94±0.11and0.47±0.13,respectively.TherewassignificantdiferenceintheactivityofVEGF proteininthehepg2celsbetweenthesirnainterferencegroupandthecontrolgroup(t=3.981,p<0.05). TherelativeactivitiesofVEGFproteinsinMHCC97Hcelsintheuntreatedgroup,thecontrolgroupandthesiRNA interventiongroupwere0.98±0.12,0.97±0.12and0.38±0.14,respectively.therewassignificantdiference intheactivityofvegfproteininthemhcc97hcelsbetweenthesirnainterferencegroupandthecontrolgroup (t=4.059,p<0.05).conclusions EphA3playsanimportantroleintheinvasionofHCCcelsviaregulating theproteinexpresionandactivityofvegf.epha3mightbeanewtargetforthetreatmentofhcc. Keywords Liverneoplasms; Erythropoietin producinghepatocelulara3; Vascularendothelial growthfactor; Invasion 促红细胞生成素肝细胞受体 (erythropoietin pro ducinghepatocelular,eph) 是迄今为止最大的受体酪氨酸激酶亚家族, 与大多数其他受体酪氨酸激酶不同,Eph 受体的激活通常不会导致细胞的增殖反应, 而是在细胞形状的变化, 运动和细胞黏附中发挥重要作用 [1-4] 研究结果表明:EphA3 在胃癌肺癌肾癌结肠癌黑色素瘤肉瘤中异常表达, 并且与肿瘤的侵袭转移相关 [5-12] 然而, 在肝癌中,EphA3 是否参与侵袭及其机制尚不明确本研究通过采用 sirna 的方法抑制肝癌细胞中 EphA3 表达, 初步探讨 EphA3 参与肝癌细胞侵袭的机制

3 中华消化外科杂志 2014 年 3 月第 13 卷第 3 期 ChinJDigSurg,March2014,Vol.13,No 材料与方法 1.1 试剂 DMEM 细胞培养液胎牛血清胰蛋白酶等主要试剂均购自 Hyclone 公司 ;EphA3 和 VEGF 一抗均购自 SantaCruz 公司, 二抗购自 Pierce 公司 ;sirna EphA3 和对照 sirna 购自 SantaCruz 公司 ;Transwel 细胞培养板购自 Milicel 公司 ;Matrigel 胶购自美国 BD 公司 ;ELISA 试剂盒购自 Amersham 公司 ;RT PCR 试剂盒购自 TaKaRa 公司 ;Trizolreagent Lipo fectamine TM 2000 购自 Invitrogen 公司 ; 其他试剂未加特殊说明者均购自 Sigma 公司引物由大连宝生物工程有限公司合成 1.2 细胞培养人肝细胞 HL 7702 和肝癌细胞株 HepG2 MH CC97H 均由第四军医大学肝胆胰脾外科实验室提供培养细胞用含 10% 胎牛血清的 DMEM 培养液, 置于 37 5%CO 2 的细胞培养箱中培养细胞贴壁增殖至培养瓶底 80% 左右时, 用 0.25% 胰蛋白酶进行消化传代 1.3 实验分组未处理组 : 未处理肝癌细胞 ; 对照组 : 加入对照 sirna;sirna 干扰组 : 加入 sirna 干扰 EphA3 1.4 sirna 转染转染前 24h, 取对数生长期的细胞计数, 调整细胞数为 / 孔, 接种于 6 孔板, 孵箱培养, 使细胞密度达到 60% 转染时用 Opti MEM 培养基 2mL 替换完全培养基, 分别用 250μL 的 Opti MEM 稀释 200pmolsiRNA(siRNA EphA3 和对照用 sirna) 和 5μLLipofectamine TM 2000, 混匀, 室温孵育 5min 后, 将 250μLLipofectamine TM 2000 混合物加入 sirna 混合物中, 总体积为 500μL, 混匀, 室温孵育 20min, 将 500μLsiRNA/Lipofectamine TM 2000 混合物分别加入 6 孔板中, 混匀, 培养 4~6h 后更换完全培养基,37 继续培养 48~72h 用于实验 1.5 RT PCR 收集培养的细胞, 按 Trizol 说明书操作提取细胞总 RNA, 按逆转录试剂盒说明书进行逆转录反应 EphA3 的引物序列为 : 上游引物 5 CCATG GACTGCCCAGCTGCC 3, 下游引物 5 CCTTGCG GCTGCACTGGTGA 3 ; 以人 GAPDH 为内参照, 引物序列为 : 上游引物 5 AAATCCCATCACCATCTTCC 3, 下游引物 5 TCACACCCATGACGAACA 3 PCR 反应条件为 :94,5min 预变性,94 30s,59 30s,72 30s, 共 30 个循环,72 延伸 10min 取 PCR 扩增产物 15μL, 以 2.5% 琼脂糖凝胶电泳, 溴化乙啶染色后, 用 UVP 凝胶成像系统进行检测, 用 Labworks 软件对阳性条带的吸光度进行测定, 以相对吸光度率 ( 以目标基因的阳性条带与 GAPDH 吸光度相比 ) 作为目标基因 mrnas 的相对表达量 1.6 Westernblot 检测 EphA3 和 VEGF 蛋白的表达不同处理的 HepG2 和 MHCC97H 细胞, 置于 37 5%CO 2 的细胞培养箱中培养 24h 后提取各组细胞蛋白分别将相同含量的蛋白样品和上样缓冲液 (2 ) 等体积混合, 沸水中煮 5min 使蛋白变性 ; 以 SDS PAGE 分离蛋白后, 用 200mA 恒流电转移至硝酸纤维素膜上, 用含 5% 脱脂奶粉的 TBST 缓冲液封闭, 加入 1 50 稀释的一抗缓冲液, 接触均匀后 4 冰箱过夜 ;TBST 反复洗膜 3 次后, 加入稀释的二抗缓冲液, 室温封闭 60min;TBST 反复洗膜 3 次后, 加入 1 1AB 显影液后用成像仪显影按目的蛋白和内参照蛋白的相对表达量比值, 进行半定量分析 1.7 细胞体外侵袭实验分别取每组对数生长期的细胞, 常规消化细胞后用 DMEM 培养基重悬细胞, 调整细胞密度至个 /ml 的单细胞悬液, 将 200μL 细胞悬液加入到已铺好 Watrigel 生物胶的 Transwel 小室内, 每组重复接种 3 孔, 将 Transwel 小室放置于加入 500μL 的含有 10% 胎牛血清培养液的 24 孔板中, 继续培养细胞 24h 后取出小室, 用 PBS 淋洗, 并用 PBS 浸湿的棉签擦去小室微孔膜内层的细胞,95% 酒精固定 5min, 结晶紫溶液染色 30min, 光学显微镜下计数, 穿透的细胞染为蓝色, 在 400 倍视野下随机计数 10 个视野中侵袭细胞的数量 1.8 ELISA 方法检测 VEGF 蛋白活性变化情况应用 ELISA 试剂盒分别测定不同处理的 HepG2 和 MHCC97H 细胞中 VEGF 的活性, 不同处理组细胞, 培养 48h 后, 留取细胞培养基上清, 上清样本在冰上解冻, 所有试剂是平衡到室温,ELISA 分析实验按照试剂盒的说明进行 1.9 统计学分析应用 SPSS13.0 统计软件进行分析, 多组比较采用单因素方差分析, 组间比较采用 LSD t 检验 P<0.05 为差异有统计学意义 2 结果 2.1 EphA3 在不同肝细胞系中的表达情况在非肿瘤肝细胞系 HL 7702 和肝癌细胞系 HepG2 和 MHCC97H 中,EphA3mRNA 的相对表达量分别

4 210 中华消化外科杂志 2014 年 3 月第 13 卷第 3 期 ChinJDigSurg,March2014,Vol.13,No.3 为 0 94± ±0 16 和 3 62±0 14;EphA3 蛋白的相对表达量分别为 0 96± ±0 11 和 3 82±0 11, 非肿瘤细胞与肝癌细胞中 EphA3 表达比较, 差异有统计学意义 (t=2.511,6.437;2.321, 6.895,P<0.05) 见图 1,2 1:HL 7702 细胞 ;2:HepG2 细胞 ;3:MHCC97H 细胞图 1 RT PCR 检测不同细胞系中 EphA3mRNA 的表达水平表 2 各组 HepG2 和 MHCC97H 细胞系中 EphA3 蛋白的相对表达量 ( 珋 x±s) 组别 HepG2 细胞 MHCC97H 细胞未处理组 0.97± ±0.11 对照组 0.95± ±0.12 sirna 干扰组 0.32±0.17 ab 0.38±0.17 ab F 值 P 值 <0.05 <0.05 注 : a 与未处理组比较,t=4.432,4.232,P<0.05; b 与对照组比较,t=4.145,4.327,P<0.05 通过体外侵袭实验检测 3 组 HepG2 和 MHCC97H 细胞系的细胞侵袭数量, 发现 sirna 干扰组细胞数量明显降低 (P<0.05), 见表 3, 图 5 1:HL 7702 细胞 ;2:HepG2 细胞 ;3:MHCC97H 细胞图 2 Westernblot 检测不同细胞系中 EphA3 蛋白的表达水平 2.2 sirna 抑制 EphA3 的表达和肝癌细胞的侵袭 sirna 能够明显降低 HepG2 和 MHCC97H 细胞系中 EphA3mRNA 和蛋白的表达量 (P<0.05) 见图 3,4; 表 1,2 表 3 各组 HepG2 和 MHCC97H 细胞系中侵袭的细胞数 ( x±s, 珋个 /10HPF) 组别 HepG2 细胞 MHCC97H 细胞未处理组 111±4 402±6 对照组 109±5 397±7 sirna 干扰组 51±3 ab 152±7 ab F 值 P 值 <0.05 <0.05 注 : a 与未处理组比较,t=8.134,10.261,P<0.05; b 与对照组比较,t=7.582,9.479,P<0.05 1: 未处理组 ;2: 对照组 ;3:siRNA 干扰组图 3 RT PCR 检测 HepG2 和 MHCC97H 细胞中 EphA3mRNA 的表达情况 2.3 sirna EphA3 能抑制肝癌细胞中 VEGF 的表达和活性采用 sirna 干扰的方法抑制 EphA3, 能够明显降低 HepG2 和 MHCC97H 细胞系中 VEGF 蛋白的表达见图 6, 表 4 采用 ELISA 法检测了 VEGF 蛋白的活性, 发现抑制 EphA3, 能够明显降低 VEGF 蛋白的活性 (P<0.05), 见表 5 1: 未处理组 ;2: 对照组 ;3:siRNA 干扰组图 4 Westernblot 检测 HepG2 和 MHCC97H 细胞中 EphA3 蛋白的表达情况表 1 各组 HepG2 和 MHCC97H 细胞系中 EphA3 mrna 的相对表达量 ( x±s) 珋组别 HepG2 细胞 MHCC97H 细胞未处理组 0.95± ±0.16 对照组 0.96± ±0.14 sirna 干扰组 0.31±0.15 ab 0.40±0.11 ab F 值 P 值 <0.05 <0.05 注 : a 与未处理组比较,t=3.902,5.286,P<0.05; b 与对照组比较,t=4.051,5.237,P< 讨论酪氨酸激酶 Eph 受体及配体不仅在正常细胞黏附迁移血管生成中发挥重要的作用, 还和许多肿瘤血管的形成密切相关 [13-14], 并被认为参与肿瘤的侵袭和转移 [15-16] EphA3 是酪氨酸激酶系统的一个重要成员,EphA3 异常改变与多种肿瘤的发生发展密切相关 [17-18] EphA3 的改变造成细胞特定的形态特征和生物学特性变化, 如细胞的生长和存活率细胞黏附细胞迁移及抗凋亡能力的改变 [19-22] 但是关于 EphA3 在肝癌中的作用报道尚少 EphA3 与肝癌的侵袭转移是否相关并不清楚有研究报道肝癌细胞系的侵袭能力明显高于非肿瘤肝细胞系 HL 7702, 在肝癌细胞系 (HepG2 和 MHCC97H) 中,

5 中华消化外科杂志２４年３月第３卷第３期２ＣｈｎｊｄｇｓｕｒｇＭａｒｃｈ２４Ｖｏｌ３Ｎｏ３５ａ未处理组ＨｅＧ２细胞５ｂ对照组ＨｅＧ２细胞５ｃｓＲＮＡ干扰组ＨｅＧ２细胞５ｄ未处理组ＭＨＣＣ７Ｈ细胞５ｅ对照组ＭＨＣＣ７Ｈ细胞５ｆｓＲＮＡ干扰组ＭＨＣＣ７Ｈ细胞图５在ＨｅＧ２和ＭＨＣＣ７Ｈ细胞中ｓＲＮＡ对细胞侵袭能力的抑制作用结晶紫染色４侵袭能力强弱表现为ＨｅＧ２ＭＨＣＣ７Ｈ２３在本实验中肝癌细胞系ＥｈＡ３表达明显高于正常非肿瘤细胞系并且随着细胞侵袭能力的增加ＥｈＡ３未处理组２对照组３ｓＲＮＡ干扰组表达增加提示ＥｈＡ３可能与肝癌细胞的侵袭相图６Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测ＨｅＧ２和ＭＨＣＣ７Ｈ细胞中ＶＥＧＦ蛋白的关为了进一步验证笔者采用ｓＲＮＡ干扰的方法表达情况抑制ＥｈＡ３的表达来观察肝癌细胞的侵袭能力表４各组ＨｅＧ２和ＭＨＣＣ７Ｈ细胞系中ＶＥＧＦ变化其研究结果提示ｓＲＮＡ干扰能够有效抑制蛋白的相对表达量ｘ珋±ｓＥｈａ３的表达并且随着ＥｈＡ３的表达的抑制肝组别ＨｅＧ２细胞ＭＨＣＣ７Ｈ细胞癌细胞的侵袭能力下降这也进一步说明Ｅｈａ３参未处理组８± ７± ４与了肝癌细胞的侵袭过程但是ＥｈＡ３如何调控对照组６± ３８± ２肝癌细胞侵袭的机制尚不明确ｓＲＮＡ干扰组５７± ａｂ３４± ５ａｂＦ值４５３２７Ｐ值注ａ与未处理组比较ｔ３２２４Ｐ５ｂ与对照６７２７８Ｐ组比较ｔ３侵袭是肿瘤扩散的一个重要过程肿瘤细胞从原发灶转移到其他靶器官是一系列的连续过程包括肿瘤诱导血管生成肿瘤侵出和侵入脉管系统等从肿瘤发生的初始阶段到发生转移的终末阶段血管的生成发挥了重要的作用ＶＥＧＦ在参与上述过表５各组ＨｅＧ２和ＭＨＣＣ７Ｈ细胞系中ＶＥＧＦ程中起到了重要作用ＶＥＧＦ作为一种血管生成蛋白的相对活性ｘＯＤ珋±ｓ肽是目前被认为在血管生成中作用最强的一种组别ＨｅＧ２细胞ＭＨＣＣ７Ｈ细胞在肿瘤组织中ＶＥＧＦ的表达上调并且与肿瘤的远未处理组６± ５８± ２处转移密切相关ＶＥＧＦ促进肿瘤细胞的迁移和侵对照组４± ７± ２ｓＲＮＡ干扰组４７± ３ａｂ３８± ４ａｂＦ值４８２５６５２５Ｐ值注ａ与未处理组比较ｔ２２５２２Ｐ５ｂ与对照组比较ｔ３８ＰｈＡ３袭２４本研究结果表明在肝癌细胞中抑制Ｅ的蛋白表达后ＶＥＧＦ的蛋白表达和蛋白活性也明显下降这提示在肝癌细胞中ＥｈＡ３能够调控ＶＥＧＦ进一步说明在肝癌组织中ＥｈＡ３调控肝癌细胞侵袭过程可能是通过调控ＶＥＧＦ来实现的但

6 212 中华消化外科杂志 2014 年 3 月第 13 卷第 3 期 ChinJDigSurg,March2014,Vol.13,No.3 是 EphA3 是如何调控 VEGF 的具体机制尚不清楚, 有待进一步探讨综上所述, 下调肝癌细胞中 EphA3 的表达, 可降低肝癌细胞的侵袭可能是通过调控 VEGF 来实现的因此,EphA3 可能作为肝细胞癌治疗的分子靶点然而, 其潜在的机制尚需要进一步研究和阐明参考文献 [1] KleinR.ExcitatoryEphreceptorsandadhesiveephrinligands [J].CurOpinCelBiol,2001,13(2): [2] NorenNK,PasqualeEB.Ephreceptor ephrinbidirectionalsignals thattargetrasandrhoproteins[j].celsignal,2004,16(6): [3] WilkinsonDG.Ephreceptorsandephrins:regulatorsofguidance andasembly[j].intrevcytol,2000,196: [4] DavyA,RobbinsSM.Ephrin A5modulatesceladhesionand morphologyinanintegrin dependentmanner[j].emboj,2000, 19(20): [5] WangJ,DongY,WangX,etal.ExpresionofEphA1ingastric carcinomasisasociatedwithmetastasisandsurvival[j].oncol Rep,2010,24(6): [6] NakamuraR,KataokaH,SatoN,etal.EPHA2/EFNA1expres sioninhumangastriccancer[j].cancersci,2005,96(1): [7] YuanW,ChenZ,WuS,etal.ExpresionofEphA2andE cad heriningastriccancer:corelatedwithtumorprogresionandlym phogenousmetastasis[j].patholoncolres,2009,15(3): [8] WangJ,LiG,MaH,etal.DiferentialexpresionofEphA7re ceptortyrosinekinaseingastriccarcinoma[j].hum Pathol, 2007,38(11): [9] HafnerC,SchmitzG,MeyerS,etal.Diferentialgeneexpresion ofephreceptorsandephrinsinbenignhumantisuesandcancers [J].ClinChem,2004,50(3): [10] Wimmer KleikampSH,LackmannM.Eph modulatedcelmor phology,adhesionandmotilityincarcinogenesis[j].iubmb Life,2005,57(6): [11] BaeHJ,SongJH,NohJH,etal.Lowfrequencymutationofthe EphrinreceptorA3geneinhepatocelularcarcinoma[J].Neoplas ma,2009,56(4): [12] XiHQ,ZhaoP.Clinicopathologicalsignificanceandprognostic valueofepha3andcd133expresionincolorectalcarcinoma [J].JClinPathol,2011,64(6): [13] DodeletVC,PasqualeEB.Ephreceptorsandephrinligands:em bryogenesistotumorigenesis[j].oncogene,2000,19(49): [14] CleversH,BatleE.EphB/EphrinBreceptorsandWntsignaling incolorectalcancer[j].cancerres,2006,66(1):2 5. [15] NakamotoM,BergemannAD.DiverserolesfortheEphfamilyof receptortyrosinekinasesincarcinogenesis[j].microscrestech, 2002,59(1): [16] Brantley SiedersD,SchmidtS,ParkerM,etal.Ephreceptor tyrosinekinasesintumorandtumormicroenvironment[j].cur PharmDes,2004,10(27): [17] HéroultM,SchafnerF,AugustinHG.Ephreceptorandephrin ligand mediatedinteractionsduringangiogenesisandtumorpro gresion[j].expcelres,2006,312(5): [18] XiHQ,WuXS,WeiB,etal.AberantexpresionofEphA3in gastriccarcinoma:corelationwithtumorangiogenesisandsurvival [J].JGastroenterol,2012,47(7): [19] DaviesH,HunterC,SmithR,etal.Somaticmutationsofthe proteinkinasegenefamilyinhumanlungcancer[j].cancerres, 2005,65(17): [20] BardeliA,ParsonsDW,SilimanN,etal.Mutationalanalysisof thetyrosinekinomeincolorectalcancers[j].science,2003,300 (5621):949. [21] BonifaciN,GorskiB,MasojcB,etal.Exploringthelinkbe tweengermlineandsomaticgeneticalterationsinbreastcarcino genesis[j].plosone,2010,5(11):e [22] LeeJS,ThorgeirsonSS.Comparativeandintegrativefunctional genomicsofhcc[j].oncogene,2006,25(27): [23] ZhouL,WangDS,LiQJ,etal.DownregulationoftheNotchsig nalingpathwayinhibitshepatocelularcarcinomacelinvasionby inactivationofmatrixmetaloproteinase 2and 9andvascularen dothelialgrowthfactor[j].oncolrep,2012,28(3): [24] WeyJS,FanF,GrayMJ,etal.Vascularendothelialgrowthfac torreceptor 1promotesmigrationandinvasioninpancreaticcarci nomacellines[j].cancer,2005,104(2): ( 收稿日期 : ) ( 本文编辑 : 毛蜀 ) 广告目次柯惠医疗器材国际贸易 ( 上海 ) 有限公司封二奥林巴斯 ( 北京 ) 销售服务有限公司对封二深圳市瑞霖医疗器械有限公司对中文目次 1 深圳翰宇药业股份有限公司对中文目次 2 江苏先声药业有限公司对英文目次 1 雅培制药有限公司对英文目次 2 华瑞制药有限公司对正文阿斯利康制药有限公司对封三柯惠医疗器材国际贸易 ( 上海 ) 有限公司封三强生 ( 上海 ) 医疗器材有限公司封四

12 (autophagy),imagej,,, 3 [1-4] (self-eating) Transwelinvasion, 20μmol L -1 LY A549 [5] PI3K/AKT 24h,PBS, [6-8],, ml -1 ( ) 600μL

12 (autophagy),imagej,,, 3 [1-4] (self-eating) Transwelinvasion, 20μmol L -1 LY A549 [5] PI3K/AKT 24h,PBS, [6-8],, ml -1 ( ) 600μL ( )2017 57 5JournalofNanchangUniversity(MedicalSciences)2017,Vol.57No.5 11 LY294002, (, 330006) : LY294002 PI3K/AKT 0 10 15 20 25 30μmol L -1 LY294002(LY294002 ) A549,PBS CCK8 LY294002 A549 ; Westernblot