586 郑州大学学报 ( 医学版 ) 2018 年 9 月第 53 卷第 5 期 ingprotein1,cugbp1) 作为一种 RNA 连接蛋白家族成员, 在 mrna 翻译及降解中发挥重要作用, 与胚胎发育组织形成细胞分化关系密切 [4] 近年 [5 7] 来研究发现,CUGBP1 在多种

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1 585 doi: /j.issn CUG 连接蛋白 1 在胃癌组织中的表达及对 SGC7901 细胞增殖和侵袭能力的影响朱倩 1), 桂芬芳 1), 罗子华 1), 吴京华 1), 黎发明 1) 2), 郑建伟 1) 深圳市龙华区中心医院消化内科广东深圳 ) 华中科技大学同济医学院附属同济医院普外科武汉关键词胃癌 ;CUG 连接蛋白 1; 细胞增殖 ; 细胞侵袭中图分类号 R735.2 摘要目的 : 探讨 CUG 连接蛋白 1(CUGBP1) 在胃癌组织中的表达及对 SGC7901 细胞增殖和侵袭能力的影响方法 : 收集 82 例胃癌和癌旁正常组织, 免疫组化法检测 CUGBP1 蛋白将人胃癌 SGC7901 细胞分为 CUGBP1 sirna 组对照 sirna 组和空白对照组转染 48h 后, 实时荧光定量 PCR 法检测细胞中 CUGBP1mRNA,MTT 法检测细胞增殖能力, 划痕实验检测细胞迁移能力,Transwel 法检测细胞迁移和侵袭能力结果 : 胃癌组织中 CUGBP1 蛋白阳性表达率为 76.8%, 高于癌旁正常组织 (47.6%)(P<0.05); 胃癌组织中 CUGBP1 蛋白阳性表达与分化程度 TNM 分期浸润深度和淋巴结转移有关 (P<0.05) 与两个对照组比较,CUGBP1siRNA 组细胞中 CUGBP1 mrna 相对表达量划痕修复率降低, 迁移细胞数和侵袭细胞数减少 (P<0.05) 结论:CUGBP1 蛋白与胃癌的发生发展关系密切 ExpresionofCUG bindingprotein1ingastriccancertisueandits efectonsgc7901celproliferationandinvasion ZHUQian 1),GUIFenfang 1),LUOZihua 1),WUJinghua 1),LIFaming 1),ZHENGJianwei 2) 1)DepartmentofGastroenterology,ShenzhenLonghuaDistrictCentralHospital,Shenzhen,Guangdong )DepartmentofGeneralSurgery,TongjiHospital,TongjiMedicalColege,HuazhongUniversity ofscienceandtechnology,wuhan Keywords gastriccancer;cug bindingprotein1;celproliferation;celinvasion Abstract Aim:ToinvestigatetheexpressionofCUG bindingprotein1(cugbp1)ingastriccanceranditsefect oncelproliferationandinvasion.methods:atotalof82casesofgastriccancerandparacanceroustissuewereselected, immunohistochemistrywasusedtodetecttheexpressionofcugbp1.humangastriccancersgc7901celsweredividedin tocugbp1sirna group,controlsirna groupandblankcontrolgroup.after48htransfection,real timefluorescence quantitativepcrwasusedtodetecttheexpressionofcugbp1mrnaincels,mttassaywasusedtodetectcelprolifera tion,scratchtestwasusedtodetectcelmigrationability,transwelassaywasusedtodetectcelmigrationandinvasion. Results:ThepositiverateofCUGBP1proteiningastriccancertissuewas76.8%,whichwashigherthanthat(47.6%) innormaltissue(p<0.05).thepositiverateofcugbp1ingastriccancertissuewasrelatedtothedegreeofdiferentia tion,tnm stage,depthofinvasionandlymphnodemetastasis(p<0.05).comparedwiththoseofcontrolsirnagroupand blankcontrolgroup,therelativeexpressionlevelofcugbp1mrnaincugbpsirnagroupwaslower,thewoundhealing rates,thenumberofmigratingcelsandthenumberofinvasivecelsweresignificantlyreduced(p<0.05).conclusion: CUGBP1proteinisrelatedtothecarcinogenesisanddevelopmentofgastriccancer. 胃癌作为消化系统高发恶性肿瘤, 具有较高的基金项目湖北省自然科学基金资助项目 (2017CFB632) 作者简介郑建伟, 通信作者, 男,1979 年 9 月生, 博士, 主治医师, 研究方向 : 肝胆胰病学,E mail: @ qq.com; 朱倩, 女,1975 年 5 月生, 博士, 副主任医师, 研究方向 : 消化内科,E mail: @qq.com 病死率近年来随着诊疗技术的进步, 胃癌预后得到一定改善, 但进展期患者依然生存率较低 [1] 研 [2 3] 究表明, 早期转移是影响胃癌预后的主要因素因此, 积极探讨影响胃癌侵袭转移的相关因素对改善预后具有重要意义 CUG 连接蛋白 1(CUG bind

2 586 郑州大学学报 ( 医学版 ) 2018 年 9 月第 53 卷第 5 期 ingprotein1,cugbp1) 作为一种 RNA 连接蛋白家族成员, 在 mrna 翻译及降解中发挥重要作用, 与胚胎发育组织形成细胞分化关系密切 [4] 近年 [5 7] 来研究发现,CUGBP1 在多种肿瘤组织中表达异常, 可能与肿瘤发生关系密切本研究分析了胃癌组织中 CUGBP1 蛋白的表达 ; 通过 RNA 干扰技术沉默人胃癌 SGC7901 细胞中 CUGBP1 基因, 观察细胞生物学特性的改变 ; 以期为胃癌侵袭转移机制的研究提供基础资料 1 材料与方法 1.1 胃癌组织中 CUGBP1 蛋白表达的检测临床资料组织标本来源于 2014 年 2 月至 2017 年 3 月在深圳市龙华区中心医院择期行根治性手术治疗的胃癌患者, 均经病理学检查确诊, 共 82 例, 患者术前均未接受放化疗其中, 男 45 例, 女 37 例, 年龄 40~74 岁, 60 岁 52 例 ; 肿瘤直径 5cm17 例 ; 组织分型 : 肠型 53 例, 弥漫型 29 例 ; 分化程度 : 低分化 26 例, 中高分化 56 例 ;TNM 分期 : Ⅰ Ⅱ 期 38 例,Ⅲ Ⅳ 期 44 例 ; 浸润深度 :T1 有 13 例,T2 T3 共 69 例 ; 发生淋巴结转移 45 例术中留取癌组织及距癌灶边缘 >5cm 并经病理学检查证实的正常组织, 福尔马林固定, 石蜡包埋保存本研究通过医院伦理委员会批准, 患者均知情同意 CUGBP1 蛋白表达的检测 EnVision 二步法免疫组化试剂盒购自北京中杉生物技术有限公司, 一抗兔抗人 CUGBP1 多克隆抗体购自美国 Ab cam 公司取石蜡标本, 切片, 用二甲苯和梯度乙醇脱水, 用过氧化氢除去内源性过氧化物酶, 用柠檬酸盐 (ph6.0) 行高压抗原修复, 按照试剂盒说明完成检测一抗稀释度 DAB 显色, 苏木精复染, 封片, 透明, 镜下观察胞核中出现棕黄色颗粒状物质为阳性细胞高倍镜下选取 5 个视野, 根据染色强度和阳性细胞比例进行结果判定 [8] : 无染色浅黄色棕黄色棕褐色染色分别计为分 ; 无阳性细胞, 阳性细胞比例 <10% 10% ~ 51% ~ >75% 分别计为分 ; 两项计分相乘,0~2 分为阴性, 3 分为阳性 1.2 沉默 CUGBP1 基因后 SGC7901 细胞生物学特性的观察细胞培养和分组 SGC7901 细胞购自中科院上海细胞生物学研究所 DMEM 培养基胎牛血清胰蛋白酶购自美国 Gibco 公司将 SGC7901 细胞置于含体积分数 10% 胎牛血清的 DMEM 培养基中, 在含体积分数 5% CO 2 37 恒温培养箱中培养 24h,2.5g/L 胰蛋白酶消化, 传代培养, 取对数生长期细胞用于实验实验分 3 组, 空白对照组对照 sirna 组和 CUGBP1siRNA 组 CUGBP1siRNA 组对照 sirna 组用 Lipofectamine2000 转染试剂盒 ( 美国 Invitrogen 公司 ) 分别转染 CUGBP1siRNA( 序列 5 CTAGCCGGGATTGAAGAATGCCGGATATTCAAG AGATATCCGGCATTCTTCAATCTTTTTAAT 3 ) 和对照 sirna 序列 (5 CTAGCCCGGTTCTCCGAACGT GTCACGTATCTCGAGATACGTGACACGTTCGGAG AATTTTTTTAAT 3 ), 空白对照组不作任何处理 sirna 由上海锐赛生物技术公司设计合成细胞中 CUGBP1mRNA 的检测 Trizol 总 RNA 提取试剂盒购自美国 Invitrogen 公司, 反转录及荧光定量 PCR 试剂盒购自大连宝生物工程公司, PCR 仪购自美国 Bio Rad 公司,CUGBP1 和内参 GAPDH 引物由上海生工生物工程公司设计合成转染 48h 后收集细胞, 加入细胞裂解液, 提取总 RNA, 反转录合成 cdna, 以 cdna 为模板进行 PCR 扩增 CUGBP1 上游引物序列 :5 GATCAGTGCAG CGTCTGTGT 3, 下游 :5 GTGTTGAGGTTCCCAGA GGA 3 ;GAPDH 上游引物序列 :5 TCACCACCATG GAGAAGGC 3, 下游 :5 GCTAAGCAGTTGGTGGT GCA 3 PCR 反应条件 :95 预变性 5min;95 变性 30s,60 30s,74 30s, 连续循环 40 次每组设 3 个平行孔用 2 -ΔΔCt 法计算 CUGBP1mR NA 的相对表达量细胞增殖能力的检测 MTT 细胞增殖检测试剂盒购自上海威奥生物科技公司取转染 48h 后的各组细胞, 胰蛋白酶消化, 接种于 96 孔板, 密度个 / 孔, 在含体积分数 5% CO 2 37 恒温培养箱中培养, 分别于和 96h 时, 将 10 μl 的 MTT 液加入各孔, 培养 4h 后加入 100μL 的二甲基亚砜, 充分振荡, 用酶标仪于 490nm 波长处检测吸光度 (A) 值实验重复 3 次细胞迁移和侵袭能力的检测 1 划痕实验 : 在 6 孔板背面划横线, 每孔 5 条平行线取各组转染 48h 后的细胞, 常规胰蛋白酶消化后接种于 6 孔板, 每组 6 个复孔待细胞长满孔底时, 用 200μL 枪头垂直于孔板底部从上而下划线, 枪头要垂直, 不能倾斜, 尽量保证各个划痕宽度一致, 去除旧培养液,PBS 冲洗 3 次, 加入无血清培养液继续培养显微镜下观察, 分别于培养 0 24 和 48h 时拍照, 利用 Image ProPlus 软件测量划痕宽度划痕修复率 = (0h 时划痕宽度 -24h 或 48h 时划痕宽度 )/0h 时划痕宽度 100% 2Transwel 实验 :Transwel 小

587 室和 Matrigel 胶购自美国 Falcon 公司取各组转染 48h 后的细胞, 胰蛋白酶消化, 室温条件下离心后留取细胞沉淀, 用含体积分数 1% 胎牛血清的无血清培养液制备单细胞悬液, 密度为 1 10 5 ml -1 取 100μL 细胞悬液加入 Transwel 小室上室, 将 600 μl 含体积分数 10% 胎牛血清的 DMEM 培养液加入下室, 在含体积分数 5%

3 587 室和 Matrigel 胶购自美国 Falcon 公司取各组转染 48h 后的细胞, 胰蛋白酶消化, 室温条件下离心后留取细胞沉淀, 用含体积分数 1% 胎牛血清的无血清培养液制备单细胞悬液, 密度为 ml -1 取 100μL 细胞悬液加入 Transwel 小室上室, 将 600 μl 含体积分数 10% 胎牛血清的 DMEM 培养液加入下室, 在含体积分数 5% CO 2 37 恒温培养箱中培养 24h 用甲醛固定细胞, 结晶紫染色, 用棉签轻轻除去散落细胞, 拍照, 取 5 个高倍视野计数穿膜细胞数, 即为迁移细胞数实验重复 3 次将 Matrigel 胶平铺于 Transwel 小室,4 风干备用, 其余步骤同前, 检测侵袭细胞数 1.3 统计学处理使用 SPSS21.0 完成数据分析癌及癌旁正常组织中 CUGBP1 蛋白阳性表达率的比较采用配对 χ 2 检验 ; 不同临床病理特征胃癌组织中 CUGBP1 蛋白阳性表达率的比较采用成组资料的 χ 2 检验 ;3 组细胞 A 值划痕修复率迁移细胞数和侵袭细胞数的比较采用单因素方差分析, 组间两两比较采用 LSD t 检验检验水准 α= 结果 2.1 胃癌组织中 CUGBP1 蛋白的表达胃癌及癌旁正常组织中 CUGBP1 蛋白的表达见图 1 表 1 理特征胃癌组织中 CUGBP1 蛋白表达的比较见表 2 低分化 TNM 分期为 Ⅲ 和 Ⅳ 期浸润深度为 T2 和 T3 有淋巴结转移的胃癌组织中 CUGBP1 蛋白阳性表达率更高 (P<0.05) 临床病理特征性别男女年龄 60 岁 <60 岁肿瘤直径 5cm <5cm 组织分型肠型弥漫型分化程度低分化中高分化 TNM 分期 Ⅰ Ⅱ 期 Ⅲ Ⅳ 期浸润深度 T1 T2 T3 淋巴结转移是否表 2 不同临床病理特征胃癌组织中 CUGBP1 蛋白表达的比较例 (%) n CUGBP1 蛋白阳性 36(80.00) 27(72.97) 41(78.85) 22(73.33) 12(70.59) 51(78.46) 40(75.47) 23(79.31) 24(92.31) 39(69.64) 23(60.53) 40(90.91) 4(30.77) 59(85.51) 39(86.67) 24(64.86) χ 2 P 图 1 胃癌 (A) 和癌旁正常组织 (B) 中 CUGBP1 蛋白的表达 (EnVision, 400) 表 1 胃癌和癌旁正常组织中 CUGBP1 蛋白表达的比较例癌旁正常组织胃癌组织阳性阴性合计阳性阴性合计 χ 2 =11.077,P=0.001 胃癌组织中 CUGBP1 蛋白阳性表达率达 76.8%, 高于癌旁正常组织 (47.6%) 不同临床病 2.2 沉默 CUGBP1 基因后 SGC7901 细胞生物学特性的变化组细胞中 CUGBP1mRNA 表达的比较 CUGBP1siRNA 组对照 sirna 组和空白对照组细胞中 CUGBP1mRNA 的相对表达量分别为 (1.19± 0.16) (2.14±0.11) 和 (2.22±0.14), 差异有统计学意义 (F= ,P<0.001),CUGBP1siRNA 组细胞中 CUGBP1mRNA 相对表达量低于两个对照组 (P<0.05) 组细胞增殖能力的比较见表 3 CUG BP1siRNA 组细胞和 96h 时 A 值低于两个对照组 (P<0.05)

4 588 郑州大学学报 ( 医学版 ) 2018 年 9 月第 53 卷第 5 期表 3 3 组细胞不同时间点 A 值比较 (n=6) 组别 12h 24h 48h 72h 96h CUGBP1siRNA 组 0.18± ± ± ± ±0.05 对照 sirna 组 0.14± ± ± ± ±0.07 空白对照组 0.15± ± ± ± ±0.05 F P < 组细胞迁移和侵袭能力的比较见表 4 5 CUGBP1siRNA 组 24 和 48h 时细胞划痕修复率均低于对照 sirna 组和空白对照组 (P<0.05), 迁移细胞数和侵袭细胞数亦低于对照 sirna 组和空白对照组 (P<0.05) 表 4 3 组细胞划痕修复率的比较 (n=6) % 组别 24h 48h CUGBP1siRNA 组 11.72± ±0.90 对照 sirna 组 29.56± ±1.72 空白对照组 28.54± ±1.51 F P <0.001 <0.001 表 5 3 组迁移细胞数和侵袭细胞数的比较组别 n 迁移细胞数侵袭细胞数 CUGBP1siRNA 组 ± ±3.12 对照 sirna 组 ± ±7.12 空白对照组 ± ±6.90 F P <0.001 < 讨论 [9 10] 有研究指出, 肿瘤转移复发依然是胃癌患者死亡风险增加的主要因素, 如何有效减少胃癌早期转移及术后复发已成为目前研究的热点和难点 CUGBP1 位于人染色体 11p11, 与 mrna 代谢密切相关 [11] [12] 杨昌俊等发现, 膀胱癌组织中 CUGBP1 蛋白呈高表达, 并在肿瘤细胞的增殖凋亡中发挥重 [13] 要作用 Wang 等发现,CUGBP1 是影响非小细胞肺癌脑转移的重要因素本研究结果显示, 胃癌组织中 CUGBP1 蛋白阳性表达率高于癌旁正常组织, 低分化 TNM 分期 Ⅲ 和 Ⅳ 期浸润深度 T2 和 T3 及发生淋巴结转移的胃癌组织中 CUGBP1 蛋白阳性表达率明显升高, 说明 CUGBP1 可能参与了胃癌的发生进展过程, 可能与不良预后有关 [14] 有研究指出,CUGBP1 在调节细胞生长和凋亡中起着关键作用本研究结果显示,CUGBP1siR NA 组细胞和 96h 时 A 值均低于对照 sir NA 组和空白对照组, 迁移细胞数和侵袭细胞数亦低于两对照组, 说明 CUGBP1 基因与胃癌细胞的增殖 [15] [16] 迁移能力关系密切, 与 Zhao 等和 Liu 等的研究结论相同综上所述, 胃癌组织中 CUGBP1 蛋白呈高表达, 且参与了胃癌细胞增殖侵袭过程的调节, 有望成为胃癌基因靶向治疗的新靶位参考文献 [1] ZHANGXY,ZHANGPY.Gastriccancer:somaticgenetics asaguidetotherapy[j].jmedgenet,2017,54(5):305 [2] 张梦阳, 张新生, 张乾世, 等.229 例早期胃癌淋巴结转移危险因素分析 [J]. 中华胃肠外科杂志,2017,20(2): 224 [3] 贾长河, 谢甲贝, 张昊, 等. 整合素 α3 及 β catenin 在胃癌中表达及临床意义 [J]. 中华实用诊断与治疗杂志, 2017,31(8):787 [4] ZHAIK,GU L,YANG ZG,etal.RNA bindingprotein CUGBP1regulatesinsulinsecretionviaactivationofphos phodiesterase3binmice[j].diabetologia,2016,59(9): 1959 [5] GAOC,YU Z,LIU S,etal.OverexpressionofCUGBP1is associatedwiththeprogressionofnon smalcellungcanc er[j].tumourbiol,2015,36(6):4583 [6] XIAL,SUNCX,LIQL,etal.CELF1isup regulatedingli omaandpromotesgliomacelproliferationbysuppression ofcdkn1b[j].intjbiolsci,2015,11(11):1314 [7] WANG XD,WANG HZ,JIFJ,etal.Lentivirus mediated knockdownofcugbp1suppressesgastriccancercelpro liferationinvitro[j].applbiochem Biotechnol,2014,173 (6):1529 [8] 李珍, 许涛, 程雄飞.E2F 1 在肝细胞癌中的表达情况及其对患者预后的影响研究 [J]. 浙江临床医学,2017,19 (6):1007 [9] 陈路川, 魏晟宏, 叶再生, 等. 青年胃癌患者的临床病理

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12 (autophagy),imagej,,, 3 [1-4] (self-eating) Transwelinvasion, 20μmol L -1 LY A549 [5] PI3K/AKT 24h,PBS, [6-8],, ml -1 ( ) 600μL

12 (autophagy),imagej,,, 3 [1-4] (self-eating) Transwelinvasion, 20μmol L -1 LY A549 [5] PI3K/AKT 24h,PBS, [6-8],, ml -1 ( ) 600μL ( )2017 57 5JournalofNanchangUniversity(MedicalSciences)2017,Vol.57No.5 11 LY294002, (, 330006) : LY294002 PI3K/AKT 0 10 15 20 25 30μmol L -1 LY294002(LY294002 ) A549,PBS CCK8 LY294002 A549 ; Westernblot

586 郑州大学学报 ( 医学版 ) 2018 年 9 月第 53 卷第 5 期 ingprotein1,cugbp1) 作为一种 RNA 连接蛋白家族成员, 在 mrna 翻译及降解中发挥重要作用, 与胚胎发育 组织形成 细胞分化关系密切 [4] 近年 [5 7] 来研究发现,CUGBP1 在多种

586 郑州大学学报 ( 医学版 ) 2018 年 9 月第 53 卷第 5 期 ingprotein1,cugbp1) 作为一种 RNA 连接蛋白家族成员, 在 mrna 翻译及降解中发挥重要作用, 与胚胎发育组织形成细胞分化关系密切 [4] 近年 [5 7] 来研究发现,CUGBP1 在多种