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1 第 39 卷第 1 期渔业科学进展 Vol.39, No 年 2 月 PROGRESS IN FISHERY SCIENCES Feb., 2018 DOI: /yykxjz 刘佳乐, 韦秀梅, 杨顶珑, 童潼, 刘相全. 大竹蛏 β- 整合素基因 SgβInt 的特性分析和重组表达. 渔业科学进展, 2018, 39(1): Liu JL, Wei XM, Yang DL, Tong T, Liu XQ. Recombinant expression and characterization of the β-integrin gene of Solen grandis. Progress in Fishery Sciences, 2018, 39(1): 大竹蛏 β- 整合素基因 SgβInt 的 * 特性分析和重组表达刘佳乐 1,2 韦秀梅 3 杨顶珑 3 童潼 1 刘相全 31 (1. 广西壮族自治区海洋研究所广西海洋生物技术重点实验室北海 ; 2. 上海海洋大学水产与生命学院上海 ; 3. 山东省海洋资源与环境研究院山东省海洋生态修复重点实验室烟台 ) 摘要整合素作为一种细胞粘附因子, 在细胞粘附迁移增殖凋亡和吞噬等过程中发挥重要作用本研究利用分子克隆技术获得了大竹蛏 (Solen grandis) β- 整合素基因 (SgβInt) 的 cdna 全长, 分析了其编码氨基酸序列的进化特点, 并以 SWISS-MODEL 预测了氨基酸序列的三级结构 SgβInt 基因序列全长为 1168 bp,5 和 3 非编码区 (UTR) 分别为 61 bp 和 18 bp, 开放阅读框 (ORF) 为 1089 bp, 编码 362 个氨基酸, 理论等电点约为 4.98, 分子量为 30.0 kda 通过荧光定量 PCR 法检测了 SgβInt 在健康大竹蛏各组织中以及大竹蛏受到脂多糖肽聚糖和葡聚糖等微生物多糖刺激后的表达结果显示,SgβInt 在血细胞鳃肝胰腺性腺肌肉和外套膜等组织中均可表达, 在鳃中的表达量最高 ; 脂多糖肽聚糖和葡聚糖都可以诱导 SgβInt 表达量上调,SgβInt 的表达量分别在脂多糖和葡聚糖刺激后的 3 h 和 48 h 达到最高 ; 肽聚糖刺激后 SgβInt 表达量上调幅度最大, 在 6 h 时达到最高, 证实 SgβInt 参与大竹蛏抵御外源微生物的免疫应答利用基因重组技术构建了 SgβInt 的重组表达载体, 为进一步分析软体动物整合素的功能揭示大竹蛏先天性免疫机制奠定了基础关键词大竹蛏 ; 整合素 ; 免疫应答 ; 荧光定量 PCR 中图分类号 S968.3 文献标识码 A 文章编号 (2018) 细胞粘附因子 (Cell adhesion molecules) 介导细胞与细胞之间以及细胞与细胞外基质之间的相互作用, 参与信号传导细胞间识别细胞增殖和分化炎症和伤口愈合等过程 (Zhuang et al, 2008) 根据结构和功能的不同, 细胞粘附因子分为整合素 (Integrin) 钙粘素 (Cadherin) 选择素(Selectin) 免疫球蛋白超家族 (Ig-superfamily) 和透明质酸粘素 (Hyaladherin) 五类其中, 整合素是一种由一个 α 亚单位和一个 β 亚单位通过非共价键连接而成的异二聚体跨膜糖蛋白目前, 已经确认的有 18 种 α 亚单位和 8 种 β 亚单位, 共组成 20 余种整合素 (Jia et al, 2015) 大部分 α 亚基只结合一种 β 亚基, 少数的如 α V 亚基可以与不同的 β 亚基结合由于不同的 α 亚基和 β 亚基的氨基酸序列存在不同程度上的同源性, 使得它们在结构上有共同的特点整合素在体内表达广泛, 大多数细胞表面都可表达一种以上的整合素, 在多种生命活动中发挥关 * 广西海洋生物技术重点实验室开放基金资助课题资助 [This work was supported by Open Research Fund Program of Guangxi Key Laboratory of Marine Biotechnology (GLMBT )]. 刘佳乐, liujlwz@163.com 1 通讯作者 : 刘相全, 副研究员, lxq6808@163.com 收稿日期 : , 收修改稿日期 :

2 第 1 期刘佳乐等 : 大竹蛏 β- 整合素基因 SgβInt 的特性分析和重组表达 121 键作用脊椎动物的 Integrin 作为一种重要的粘附受体, 首先在淋巴细胞表面发现, 目前, 对于 Integrin 发挥的免疫功能的研究已经比较深入 Integrin 细胞外的头部结构域可以结合配体, 颈部是激活单位, 而长度可变的细胞质内结构域形成细胞骨架起到链接信号分子的作用此外,Integrin 蛋白是双向信号转导分子 (Hynes, 2002; Schwartz et al, 1995), 在调控免疫反应过程中也发挥必不可少的作用 (Rose et al, 2002; von Andrian et al, 2003) 近些年的研究表明, Integrin 还参与肿瘤细胞粘附, 比如,Integrin 在口腔癌癌前病变时, 起串联受体的作用 (Shahidul et al, 2010);Integrin 还被证明是人肠道弧菌病毒 (Nelsen- Salz et al, 1999) 腺病毒(Wickham et al, 1993) 手足口病毒 (Jackson et al, 2000) 乳头瘤病毒(Coulson et al, 1997) 等多种病毒的受体在无脊椎动物中, 果蝇 (Drosophila melanogaster) Integrin 被研究得较为透彻, 现已发现 3 个不同的 α 亚基 (αps1 αps2 和 αps3) 和 2 个 β 亚基,3 个位置特殊的 Integrin 异构体 (PS1 PS2 和 PS3) 与已被发现脊椎动物的 β1-integrin 最为相似 (Relja et al, 2011; Stark et al, 1997; Yee et al, 1993), 有研究表明, 果蝇 β-integrin 参与调控其血细胞吞噬细菌 (Mamali et al, 2009) 在其他无脊椎动物中也相继发现了 Integrin, 例如, 在冈比亚按蚊 (Anopheles gambiae) 中克隆得到的 β-integrin 基因, 推测其参与血细胞介导的对大肠杆菌的包囊作用, 相应的结构特征可能使其具有吞噬革兰氏阴性菌的能力 (Moita et al, 2006); 在海洋无脊椎动物中, 凡纳滨对虾 (Litopenaeus vannamei) β-integrin 被认为是细胞膜上的对虾白斑综合征病毒 (WSSV) 受体 (Li et al, 2007); 中华绒螯蟹 (Eriocheir sinensis) β-integrin 作为细胞受体参与抗菌免疫 (Huang et al, 2015); 仿刺参 (Apostichopus japonicus) β-integrin 起到细胞凋亡抑制剂的作用 (Wang et al, 2016) 与高等动物和模式动物相比, 目前海洋无脊椎动物 Integrin 的研究尚处在起步阶段, 有关贝类 Integrin 的报道十分有限本研究从前期已构建的大竹蛏 (Solen grandis) cdna 文库中克隆获得大竹蛏 β-integrin (SgβInt) 基因的 cdna 全长, 分析了 SgβInt 编码氨基酸的序列特征, 通过荧光定量 PCR 法检测了 SgβInt 基因的 mrna 在健康大竹蛏不同组织中的表达谱, 以及在大竹蛏受到脂多糖 (LPS) 肽聚糖(PGN) 和葡聚糖 (Glucan) 3 种不同病原相关分子 (PAMPs) 刺激后, 血细胞中 SgβInt 基因的响应规律, 旨在了解 SgβInt 基因在大竹蛏防御外源微生物的免疫应答中发挥的功能, 为进一步阐释无脊椎动物 Integrin 的结构和功能丰富无脊椎动物先天性免疫学研究提供支持 1 材料与方法 1.1 实验动物野生大竹蛏捕取自山东省烟台周边海区, 体长为 90 mm 左右, 共 210 只, 实验前在 20~22 海水中暂养 7 d 取其中 10 只大竹蛏用于解剖获得组织, 剩余的 200 只随机均分为 5 组, 用于 PAMPs 刺激实验,LPS PGN 和 Glucan 等 3 种 PAMPs 分别用 PBS(0.14 mol/l NaCl, 3 mmol/l KCl, 8 mmol/l Na 2 HPO 4, 1.5 mmol/l KH 2 PO 4, ph=7.4) 溶解, 终浓度分别为和 1.0 mg/ml; 以 50 μl/ 只的剂量注射大竹蛏肌肉 (Yang et al, 2011) 第 1~3 组分别注射 LPS PGN Glucan, 第 4 组注射 PBS 作为阴性对照, 第 5 组未作任何处理作为空白对照 1.2 RNA 的提取和 cdna 模板的合成解剖大竹蛏, 取肌肉外套膜血细胞性腺肝胰腺和鳃等, 加入 TRIzol (Invitrogen), 存于 80 PAMPs 注射后和 48 h 分别从实验组和对照组中随机取 5 只大竹蛏, 注射器吸取预冷的抗凝剂 (0.1 mol/l 葡萄糖,13 mmol/l 柠檬酸, 15 mmol/l 柠檬酸钠,0.45 mol/l NaCl,10 mmol/l EDTA,pH=7.0), 抽取血淋巴,4 800 g 条件下离心 5 min, 收集血细胞, 以 1 ml TRIzol 重悬, 存于 80 所有保存于 TRIzol 中的样品, 按照 TRIzol 试剂盒说明书提取 RNA, 经 DNase I (Promega) 降解 DNA, 反应体系 :RNA 8 μl, RQ1 RNase-Free DNase 5 Reaction Buffer 2.5 μl,rq1 RNase-Free DNase 1 μl, RNase 抑制剂 0.6 μl, 于 37 反应 30 min; 加入 1 μl Stop solution,65 10 min 灭活 DNase; 加入 2 Oligo dt 2.5 μ1,70 反应 5 min, 冰浴 2 min 反应体系: 5 M-MLV 反应缓冲液 6.5 μl, RNase-Free dntp 12.5 μl,rnase 抑制剂 1.25 μl,m-mlv 反转录酶 2.5 μl,rnase-free 水 1 μl,42 反转录 1 h,95 5 min 灭活反转录酶模板存入 80, 用于荧光定量 PCR 分析 1.3 SgβInt 基因 cdna 全长的克隆在本研究前期工作构建的大竹蛏 cdna 文库中, 用 BLAST 分析获得 SgβInt 基因的 EST 序列, 将对应质粒转入 Trans5α 感受态细胞 ( 全式金 ) 中, 挑取单菌落, 以 pbluescript II SK* 载体的通用引物 M13F 和

3 122 渔业科学进展第 39 卷 M13R 对其进行重新测序 1.4 SgβInt 基因的序列分析在进行蛋白等电点和分子量预测 ; 用 BLAST 软件进行序列同源性比较和相似性搜索 ; 使用 SingalP 查找信号肽 ; 使用 MEGA 4.1 软件, 将 SgβInt 基因和家蚕 (Bombyx mori) 通讯鳌虾 (Pacifastacus leniusculus) 紫海胆(Strongylocentrotus purpuratus) 双脐螺(Biomphalaria glabrata) 凡纳滨对虾中华绒螯蟹果蝇冈比亚按蚊仿刺参鸭嘴海豆芽 (Lingula anatina) 小菜蛾(Plutella xylostella) 豌豆蚜 (Acyrthosiphon pisum) 长牡蛎(Crassostrea gigas) 瓜实蝇(Bactrocera cucurbitae) 地中海实蝇 (Ceratitis capitata) 意大利蜂(Apis mellifer) 华支睾吸虫 (Clonorchis sinensis) 粘虫(Mythimna separata) 和大乳头水螅 (Hydra magnipapillata) 等 20 个物种的 β-integrin 基因编码的氨基酸序列以邻接法 (Neighborjoining) 构建系统进化树 ; 使用 SWISS-MODEL 预测 SgβInt 基因编码氨基酸序列的三级结构, 利用 pymol 软件展示 1.5 荧光定量 PCR 检测将 cdna 模板稀释 100 倍, 使用 Mastercycler ep realplex(eppendorf) 荧光定量 PCR 仪进行 PCR 扩增反应体系 20 μl:2 SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems)10 μl 稀释 100 倍后的 cdna 模板 2 μl 正反引物各 1 μl 和 6 μl 水 SgβInt 的正向引物为 5 -AAGCGTGTCCGAGCAAATGTC-3, 反向引物为 5 -TGTGGGGAGGGGTAGGATAAT-3 ; 内参基因 β-actin 的正反向引物分别为 5 -TGTACGCCAACAC- TGTCCTGTC-3 和 5 -CATCGTATTCCTGCTTGCT- GATC-3 反应程序:50 2 min,95 10 min;94 30 s,60 60 s,40 个循环采用 2 Ct 法分析实验数据, 以 t 检验分析显著性,P<0.05 为差异显著, P<0.01 为差异极显著 1.6 SgβInt 基因重组载体的构建 PCR 反应扩增 SgβInt 成熟肽 DNA 序列, 反应体系 : 菌液模板 1 μl,10 Buffer 2.5 μl,2.5 mmol/l dntp 2 μl, 正反引物各 1 μl,taq 酶 1 μl,depc 水补足至 25 μl 重组正反引物分别为 5 -AACATGAGGTCCAT- GATAAACGG-3 和 5 -TCATGTTGTAGTGTATGTC- TCACTGGTC-3 反应条件:94 5 min;94 30 s, s,72 80 s,35 个循环 ;72 10 min;4 保存 PCR 产物 0.5~4.0 μl;peasy E1 Expression Vector( 全式金 ) 1 μl, 混合后室温反应 5 min, 将连接产物加入 Trans-T1( 全式金 ) 感受态细胞中,42 水浴热激 60 s; 加入 LB 液体培养基, 涂布平板, 培养过夜挑选单菌落由北京诺赛基因组研究有限公司测序 1.7 SgβInt 基因重组蛋白的诱导表达将测序结果正确的菌株使用 EZNA mini plasmid (Omega) 试剂盒按照步骤提取质粒转入 Transetta( 全式金 ) 感受态细胞中, 涂布平板,37 培养过夜挑取单菌落, 加入含氨苄青霉素 (AMP) 的 LB 培养基中, 200 r/min 37 震荡培养至 OD 600 nm 约为 0.6; 加入终浓度为 1 mmol/l 的 IPTG 诱导表达目的蛋白, r/min 诱导培养 4 h; r/min 离心 10 min, 收集菌体沉淀以 12% 的 SDS-PAGE 电泳分析诱导表达结果 2 结果 2.1 SgβInt 基因 cdna 的克隆及序列特点测序结果拼接获得的 SgβInt 基因 cdna 全长, 提交至 GenBank 获得登录号 KX925404, 其全长为 1168 bp,5 和 3 分别含 61 bp 和 18 bp 的非编码区 (UTR), 开放阅读框 (ORF) 为 1089 bp, 共编码 362 个氨基酸, 其中, 在 42~74 位氨基酸和 103~135 位氨基酸处分别为 EGF like 和 EGF 结构域同源性分析显示,SgβInt 与家山羊 (Capra hircus) 和小鼠 (Mus musculus) 的相似性最高, 分别为 37% 和 36%; 利用 SignalP 软件预测发现,SgβInt 基因编码区前 22 位氨基酸序列为信号肽序列 ( 图 1) ExPASy 预测重组后的 SgβInt 基因编码蛋白的理论等电点约为 4.98, 分子量大小为 30.0 kda 2.2 SgβInt 基因系统进化分析使用 MEGA 4.1 软件的邻接法构建系统进化树, 所用 Integrin 的 GenBank 登录号如下 : 家蚕 (NP_ ) 通讯鳌虾(CAA ) 紫海胆 (XP_ ) 双脐螺(AF ) 凡纳滨对虾 (ADK ) 中华绒螯蟹(AKJ ) 果蝇 (AAC ) 冈比亚按蚊(AAM11657) 仿刺参 (AMR ) 鸭嘴海豆芽(XM_ ) 小菜蛾 (GQ ) 豌豆蚜(XM_ ) 长牡蛎 (EKC ) 瓜实蝇(XP_ ) 地中海实蝇 (XP_ ) 意大利蜂(XP_ ) 华支睾吸虫 (GAA ) 粘虫(BAJ ) 大乳头水螅 (XP_ ) 用 MEGA 4.1 软件构建出 SgβInt 编码的氨基酸与

4 第 1 期刘佳乐等 : 大竹蛏 β- 整合素基因 SgβInt 的特性分析和重组表达 123 Fig.1 1 SgβInt The nudeotide and deduced amino acid squences of SgβInt Integrin The start and stop codons are marked in bold, the signal peptide sequence is underline and the Integrin is shaded. 20 个物种的 β-integrin 基因编码的氨基酸序列的系统进化树, 结果显示,SgβInt 编码氨基酸与长牡蛎 β-integrin 编码氨基酸的亲缘关系最近, 二者构成软体动物分支 ( 图 2) 2.3 SgβInt 编码氨基酸的三级结构预测使用 SWISS-MODEL 预测 SgβInt 中 EGF-like EGF 和 Integrin-β-tail 三个结构域的三级结构, 由图 3 可以看出,SgβInt 编码氨基酸的三维结构包括 1 个 α- 螺旋和 9 个 β- 折叠,α- 螺旋靠近其中 3 个 β- 折叠, 另外 6 个 β- 折叠每 2 个形成 1 组 2.4 SgβInt 基因的 mrna 在健康大竹蛏各组织中的表达谱运用荧光定量 PCR 方法检测了 SgβInt 基因在健康大竹蛏不同组织中的表达规律,SgβInt 基因在健康大竹蛏的各个组织中均有表达, 在鳃中表达量最高, 是性腺的倍 ; 在肌肉外套膜血细胞和肝胰腺的表达量分别为性腺表达量的倍 ; 在性腺中表达量最低 ( 图 4) 2.5 SgβInt 基因的 mrna 在大竹蛏受到 PAMPs 刺激后血细胞的表达规律荧光定量 PCR 法检测 LPS PGN 和 Glucan 刺激后大竹蛏血细胞中 SgβInt 基因的表达规律, 结果显示,SgβInt 基因的表达量在各种 PAMPs 刺激后均呈现上升趋势, 并且都在刺激后 3 h 表现出极显著升高其中, 受到 LPS 刺激后,SgβInt 基因表达量在 3 h 达到最高 (P<0.01), 为空白对照的 4.8 倍, 随后逐渐降低, 在 12 h 达到最低 (P<0.01), 为空白对照的 0.4 倍 ; PGN 刺激使 SgβInt 基因的表达量上调幅度最大, 继在刺激 3 h 时上升为空白组的 10.8 倍后 (P<0.01), 在 6 h 达到最高, 是空白对照的 35.3 倍 (P<0.01), 随后显著降低 ;Glucan 刺激也能诱导 SgβInt 基因的表达

5 124 渔业科学进展第 39 卷 Fig.2 图 2 SgβInt 与其他物种 β-integrin 的系统进化树 Phylogenetic tree based on SgβInt sequence with β-integrin of other species Fig.3 图 3 SgβInt 蛋白的三级结构 The predicted spatial structure of SgβInt 蓝色 :β- 折叠 ; 红色 :α- 螺旋 Blue: β-sheets; Red: α-helices 量出现上调, 在刺激 3 h 时为空白对照的 3.2 倍 (P<0.01), 随后逐渐降低, 但与 LPS PGN 刺激后的表达模式不同的是,SgβInt 在 24 h 时再次出现显著升高 (P<0.05), 并在 48 h 达到峰值, 为空白对照的 44.1 倍 (P<0.01)( 图 5) 2.6 SgβInt 基因在大肠杆菌中的重组表达分析 SDS-PAGE 分析对比诱导前后的 SgβInt 蛋白重组菌株, 诱导菌株的泳道明显看到诱导蛋白的条带, 重组蛋白的分子量大小约为 30 kda, 与预测的结果相一致, 证明 SgβInt 基因编码蛋白被诱导表达 ( 图 6) 图 4 SgβInt mrna 在不同组织中的表达谱 Fig.4 SgβInt mrna expression level in different tissues 3 讨论整合素是细胞膜上粘附因子的一种, 属于具有保守 αβ 异构体的细胞表面受体大家族 (Hagen et al, 2001) 高等动物的整合素 Integrin 已被证明可作为人肠道弧菌病毒腺病毒手足口病毒乳头瘤病毒等多种病

6 第1期刘佳乐等: 大竹蛏 β-整合素基因 SgβInt 的特性分析和重组表达 Fig 图 6 重组 SgβInt 的 SDS-PAGE 分析 SDS-PAGE analysis of recombinant SgβInt M: 蛋白质分子量标准 1: 未诱导的重组 SgβInt 2: 诱导的重组 SgβInt M: Protein molecular standard; 1: Negative control for recombinant SgβInt (without induction); 2: IPTG induced recombinant SgβInt 结构相似综合以上分析结果 SgβInt 为 β-integrin 家族成员仿刺参长牡蛎凡纳滨对虾等海洋无脊椎动物的 Integrin 基因具有组织分布广泛的特点与以上报道类似本研究发现 SgβInt 在所有检测组织中均有表达组织表达谱广与 β-integrin 在机体的生命活动中参与多种过程密切相关但是这些物种的 β-integrin 基因的组织表达谱存在差异尤其是它们呈现高表达量的组织部位不同如仿刺参 β-integrin 在肌肉中的表达量最高(Wang et al, 2016) 而长牡蛎和凡纳滨对虾 β-integrin 则分别在性腺和血细胞中表达量最高(Lin et al, 2013; Jia et al, 2015) SgβInt 在鳃图5 血细胞中 SgβInt mrna 在 PAMPs 刺激后的表达水平 Fig.5 The SgβInt mrna expression level in hemocytes after PAMPs stimulation 的表达量最高由于鳃是大竹蛏用于滤食和气体交换的器官与水环境直接接触考虑到水环境中存在多种外源微生物 SgβInt 基因在鳃中的高表达暗示其可能在大竹蛏抵御外源微生物的过程中发挥重要作用毒的受体近几年陆续有研究发现无脊椎动物整为分析 SgβInt 是否参与大竹蛏抵御外源微生物合素 Integrin 也参与多种免疫反应而有关海洋无脊的过程本研究用 LPS PGN 和 Glucan 等微生物多椎动物整合素 Integrin 的研究还相对较少本研究以糖刺激大竹蛏并检测血细胞中 SgβInt mrna 的表大竹蛏为研究对象克隆得到了 β-integrin 基因的达规律微生物多糖 LPS PGN 和 Glucan 是微生物 cdna 全长通过 Blast 分析发现该基因编码蛋白表面某些共有的高度保守的分子结构宿主细胞不能与家山羊和小鼠等脊椎动物的 β-integrin 基因编码蛋自主产生这些多糖为微生物所特有是微生物生存白相似而分析 SgβInt 基因编码蛋白的序列特点发或致病必需的 LPS PGN 和 Glucan 刺激都能诱导现在以邻接法构建的 SgβInt 与其他物种 β-integrin SgβInt 在大竹蛏血细胞中的表达显著上调揭示的系统进化树中 SgβInt 与长牡蛎 β-integrin 构成了 SgβInt 参与大竹蛏抵御多种外源微生物的免疫过程软体动物分支并且其三级结构包括 1 个 α-螺旋和 9 其中 PGN 和 Glucan 刺激后 SgβInt 的表达量上调个 β-折叠与孔雀鱼(Poecilia reticulata)和红鳍东方最为显著说明 SgβInt 可能更容易被革兰氏阳性菌和鲀(Takifugu rubripes)的 β-integrin 基因编码蛋白三维真菌诱导中华绒螯蟹(Huang et al, 2015)和长牡蛎

7 126 渔业科学进展第 39 卷 (Jia et al, 2015) 的 β-integrin 在受到 LPS 刺激后 6 h 时达到最高表达量, 而本研究中, 一方面 SgβInt 的表达量在 3 h 时达到最高, 大竹蛏 SgβInt 对于 LPS 的响应时间早于中华绒螯蟹和长牡蛎 Integrin 另一方面, SgβInt 在大竹蛏受到 PGN 和 Glucan 刺激后达到最高表达量的时间不一致, 其对于不同微生物多糖的响应时间不同, 推测其清除作用机制存在差异重组的基因编码蛋白是研究基因功能的有利工具利用制备的重组蛋白, 已有研究发现, 中华绒螯蟹的 β-integrin 可以包括凝集金黄色葡萄球菌藤黄微球菌大肠杆菌在内的多种细菌, 并能够协助机体清除副溶血弧菌等致命菌 (Huang et al, 2015); 而长牡蛎和仿刺参的 β-integrin 都对 LPS 有较高的亲和力 (Lin et al, 2013; Wang et al, 2016); 构建 SgβInt 编码蛋白的重组载体, 为获得 SgβInt 重组蛋白, 制备抗 Integrin 重组蛋白抗体, 进一步分析 SgβInt 编码蛋白的功能提供了必要的实验材料 SgβInt 编码蛋白对于外源微生物的作用方式还不明确, 有待于进一步研究本研究中 SgβInt 基因的克隆特性分析及其重组载体的构建, 揭示了 SgβInt 基因的序列特点及其对于 PAMPs 的响应规律, 为了解大竹蛏对外源微生物的免疫防御机理和进一步分析其作用机制奠定了基础参考文献 Coulson BS, Londrigan SL, Lee DJ. Rotavirus contains integrin ligand sequences and a disintegrin-like domain that are implicated in virus entry into cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1997, 94(10): Hagen HE, Kläger SL. Integrin-like RGD-dependent cell adhesion mechanism is involved in the rapid killing of Onchocerca microfilariae during early infection of Simulium damnosum s.l. Parasitology, 2001, 122(4): Huang Y, Zhao LL, Feng JL, et al. A novel integrin function in innate immunity from Chinese mitten crab (Eriocheir sinensis). Developmental and Comparative Immunology, 2015, 52(2): Hynes RO. Integrins: Bidirectional, allosteric signaling machines. Cell, 2002, 110(6): Jackson T, Sheppard D, Denyer M, et al. The epithelial integrin alpha-vbeta 6 is a receptor for foot-and-mouth disease virus. Journal of Virology, 2000, 74(11): Jia ZH, Zhang T, Jiang S, et al. An integrin from oyster Crassostrea gigas mediates the phagocytosistoward Vibrio splendidus through LPS binding activity. Developmental and Comparative Immunology, 2015, 53(1): Li DF, Zhang MC, Yang HJ, et al. β-integrin mediates WSSV infection. Virology, 2007, 368(1): Lin YC, Chen JC, Chen YY, et al. Characterization of whiteshrimp Litopenaeus vannamei integrin β and its role in immunomodulation by dsrna-mediated gene silencing. Developmental and Comparative Immunology, 2013, 40(2): Mamali I, Lamprou I, Karagiannis F, et al. A β integrin subunit regulates bacterial phagocytosis in medfly haemocytes. Developmental and Comparative Immunology, 2009, 33(7): Moita LF, Vriend G, Mahairaki V, et al. Integrins of Anopheles gambiae and a putative role of a new β integrin, BINT2, in phagocytosis of E. coli. Insect Biochemistry and Molecular Biology, 2006, 36(4): Myat MM, Rashmi RN, Manna D, et al. Drosophila KASHdomain protein Klarsicht regulates microtubulestability and integrin receptor localization during collective cellmigration. Developmental Biology, 2015, 407(1): Nelsen-Salz B, Eggers HJ, Zimmermann H. Integrin alpha (v) beta3 (vitronectin receptor) is a candidate receptor for the virulent echovirus 9 strain Barty. Journal of General Virology, 1999, 80(9): Relja B, Meder F, Wang M, et al. Simvastatin modulates the adhesion and growth of hepatocellular carcinoma cells via decrease of integrin expression and ROCK. International Journal of Oncology, 2011, 38(3): 879 Rose DM, Han J, Ginsberg MH. Alpha4 integrins and the immune response. Immunological Reviews, 2002, 186(1): Schwartz MA, Schaller MD, Ginsberg MH. Integrins: Emerging paradigms of signal transduction. Annual Review of Cell Developmental Biololgy, 1995, 11: Shahidul A, Yamazaki M, Maruyama S, et al. Differential expression of perlecan receptors, α-dystroglycan and integrin β1, before and after invasion of oral squamous cell carcinoma. Journal of Oral Pathology and Medicine, 2011, 40(7): Stark KA, Yee GH, Roote CE, et al. A novel alpha integrin subunit associates with betaps and functions in tissue morphogenesis and movement during Drosophila development. Development, 1997, 124(22): von Andrian UH, Engelhardt B. Alpha4 integrins as therapeutic targets in autoimmune disease. New England Journal Medicine, 2003, 348(1): Wang ZH, Shao Y, Li CH. A β-integrin from sea cucumber Apostichopus japonicus exhibits LPS binding activity and negatively regulates coelomocyte apoptosis. Fish and Shellfish Immunology, 2016, 52: Wickham TJ, Mathias P, Cheresh DA, et al. Integrins-alphav-beta-3 and alpha-v-beta-5 promote adenovirus internalization but not virus attachment. Cell, 1993, 73(2): Yang JL, Wang LL, Zhang Huan, et al. C-type lectin in Chlamys farreri (CfLec-1) mediating immune recognition and

8 第 1 期刘佳乐等 : 大竹蛏 β- 整合素基因 SgβInt 的特性分析和重组表达 127 opsonization. PLoS One, 2011, 6(2): e17089 Yee GH, Hynes RO. A novel, tissue-specific integrin subunit, beta nu, expressed in the midgut of Drosophila melanogaster. Development, 1993, 118(3): Zhuang SF, Kelo L, Nardi JB, et al. Multiple α subunits of integrin are involved in cell-mediated responses of the Manduca immune system. Developmental and Comparative Immunology, 2008, 32(4): ( 编辑冯小花 ) Recombinant Expression and Characterization of the β-integrin Gene of Solen grandis LIU Jiale 1,2, WEI Xiumei 3, YANG Dinglong 3, TONG Tong 1, LIU Xiangquan 31 (1. Guangxi Institute of Oceanology, Key Laboratory of Marine Biotechnology of Guangxi, Beihai ; 2. College of Fisheries and Science, Shanghai Ocean University, Shanghai ; 3. Key Laboratory of Marine Ecological restoration, Shandong Marine Resource and Environment Research Institute, Yantai ) Abstract Integrins are heterodimeric cell surface receptors that consist of α and β subunits to regulate cell adhesion, migration, proliferation, apoptosis and phagocytosis. The present study identified the β-integrin gene from Solen grandis (SgβInt) and analyzed the characterization of its encoded protein. The phylogenetic tree was constructed by the neighbor-joining method and the three-dimensional structure was predicted with SWISS-MODEL. The full-length cdna of SgβInt was 1168 bp, containing a 61 bp 5 UTR, 18 bp 3 UTR and an open reading frame (ORF) of 1089 bp that encodes a polypeptide of 362 amino acids with an estimated molecular mass of 30.0 kda. The encoded protein of SgβInt shared significant similarities with that in Capra hircus and Mus musculus. The phylogenetic tree indicated that SgβInt had a close genetic relationship with Crassostrea gigas to form a mollusk branch. The three-dimensional structure of SgβInt consisted of one α-helice and nine β-sheets as a member of integrin superfamily. SgβInt expressed in all tested tissues, including mantle, gill, hemocyte, gonad, muscle and hepatopancreas, with the highest expression in gill which was times higher than gonad. SgβInt was induced by all the three pathogen associated molecular patterns (PAMPs) including LPS, PGN and glucan with the peak level at 3 and 48 h post LPS and glucan stimulation, respectively. SgβInt expression reached the maximal level at 6 h post PGN stimulation with 53.5-fold induction. All the results revealed that SgβInt might regulate the immune response of S. grandis to microorganism. This study shed new light on the research of β-integrin in mollusk and immune defense mechanism of S. grandis. Key words Solen grandis; Integrin; Immune response; Real-time PCR 1 Corresponding author: LIU Xiangquan, lxq6808@163.com

Microsoft Word - 4--冯政夫_news_.doc

Microsoft Word - 4--冯政夫_news_.doc 海洋无脊椎动物组织总 RNA 提取方法的探讨冯政夫, 王琳, 李文侠, 部凡, 胡彦江, 朱伟 (, 266109) 摘要 : RNA 提取是分子生物学研究的基础实验, 由于海洋无脊椎动物组织结构以及体成分的特殊性, 导致现有的 RNA 提取方法不能完全胜任此工作作者以刺参 (Apostichopus japonicus) 栉孔扇贝 (Chlamys farreri) 和凡纳滨对虾 (Litopenaeus