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惶席
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1 第 40 卷 2012 年月分析化学 (FENXI HUAXUE) 研究 Chinese Journal of Analytical Chemistry 第期 ~ DOI: /SP.J 高效液相色谱分析鱼毒性藻类海洋卡盾藻溶血毒素吴霓江天久 * 江涛 ( 暨南大学赤潮与水环境研究中心, 广州 ) 摘要采用用高效液相色谱技术 (HPLC) 分离和分析了海洋卡盾藻 ( 香港株 ) 溶血毒素的甲醇粗提物, 通过对比不同流动相检测波长等度和梯度洗脱方式, 初步建立了分析其溶血毒素的 HPLC 方法结果表明, 采用梯度洗脱的方法, 海洋卡盾藻溶血毒素的粗提物在 50 min 内取得了较好地分离色谱条件为 C 8 硅胶柱 (4.6 mm 150 mm, 5 mm), 流动相为乙腈和水, 梯度洗脱 (0~10 min 60% 80% 乙腈,10~40 min 80% 90% 乙腈,40~50 min 90% 乙腈 ); 紫外检测器检测波长为 205 nm 和 448 nm; 流速为 0.8 ml/min; 柱温为 25 用兔血红细胞法对各个主要色谱峰进行溶血活性检测显示, 海洋卡盾藻 ( 香港株 ) 的溶血毒素至少含有 5 种成分光谱分析显示一种成分的紫外吸收高峰在 448 nm, 一种未完全分离的混合组分的紫外吸收高峰为 440 nm 和 446 nm, 另外 3 种成分的紫外吸收高峰为 205 nm 关键词高效液相色谱法 ; 海洋卡盾藻 ; 溶血毒素 1 引言海洋卡盾藻是我国常见的有毒赤潮生物, 自 1991 年 3 月在广东大鹏湾首次记录由该藻形成的赤潮以来 [1], 该类赤潮频繁在广东沿海爆发, 导致养殖鱼类大量死亡, 经济损失巨大海洋卡盾藻可产生使动物血红细胞溶解破裂的溶血毒素, 可能为糖脂类物质 [2], 是引起养殖鱼类死亡的主要原因研究表明, 许多藻类毒素可沿食物链向高营养级传递 [3~ 5], 有毒藻类被浮游动物或双壳类, 如贻贝蛤牡蛎等滤食消化吸收后, 藻毒素被积累放大 [6~ 10], 危害海产食品安全由于缺乏对溶血毒素有效的检测方法, 藻类溶血毒素在海洋食物链中的传递与代谢研究鲜有报道目前, 血红细胞法和薄层层析法是检测溶血 [2,11,12] [13] 毒素的主要方法, 但这些方法难以进行准确的定性和定量分析, 而且操作繁琐,Kuroda [14] 和 Miyazaki [15] 等对部分藻类如海洋卡盾藻和圆鳞异囊藻的溶血物质进行过初步的定性研究, 但未建立起有效的仪器分析方法本研究采用高效液相色谱技术分离和分析了海洋卡盾藻溶血毒素, 为检测藻类的溶血毒素及其在食物链中的传递与代谢提供了一种方法 2 实验部分 2.1 仪器试剂与材料 1200 高效液相分析仪 (Agilent 公司 ); C 8 色谱柱 (150 mm 4.6 mm, 5 mm,pickering Laboratories 公司 ); hitachif4600 分光光度计 ( 日立公司 ); RE52AA 旋转蒸发仪 ( 上海嘉鹏科技有限公司 ); 高速离心机 (Thermo 公司 ); XSẔ D2 OLYmPUS/CX31 显微镜,LRH-250-GS 型光照气候箱 ( 广东省医疗器械厂 ),SW- CJ-1BU 型超净工作台 ( 苏州净化设备有限公司 ); sonifiea 540 超声波细胞粉碎机 ( 美国 Branson 公司 ); 超滤离心管 (millepore 公司 ) 乙腈甲醇 ( 色谱纯 ), 其它试剂均为国产分析纯海洋卡盾藻 (Chatonelamarina) 香港株由香港渔农护理署提供,2002 年从香港近岸水体中采集并在室内单种培养至今兔血取自华南师范大学新西兰实验兔 2.2 藻种培养自然海水经 0.22 mm 微孔滤膜过滤后于温度 121 和压力 kpa 下灭菌 25 min, 冷却至室温 C. marina 以 f/2 培养液改良配方培养 [16] 培养温度 20, 光照强度为 3000 lx, 光暗循环为 L D= 收稿 ; 接受本文系国家自然科学基金项目 (No ), 国家 863 项目 (No.2008AA10Z427), 国家重点基础研究发展规划项目 (No.2010CB428702) 和 NSFC- 广东联合基金项目 (No. U ) 资助 * tjiangtj@ jnu.edu.cn

2 分析化学第 40 卷每天固定时间取样于显微镜下, 用 0.1 ml 浮游植物计数框进行藻细胞计数, 绘制其生长曲线 2.3 溶血毒素的提取藻类溶血毒素大多是糖脂类及不饱和脂肪酸类化合物 [17] 参照文献 [12,18] 的方法提取粗毒素取 1 L 对数生长期 (20 d) 的藻液 ( cells/ml), 经 3000 g 离心 10 min 后收集藻细胞, 用氯仿 - 甲醇 - 水 (13 5 7,V/V) 重新悬浮藻细胞, 冰浴条件下超声波破碎细胞,4 条件下静置, 待完全分层后, 取下层液体, 经真空旋转蒸发干燥后, 溶解于适量的甲醇中, 即得溶血毒素甲醇的粗提液, 将其 g 离心 10 min, 取上清液贮于 4 下备用 2.4 色谱条件的选择等度洗脱 C 8 硅胶柱 ; 流速为 0.8 ml/min; 柱温为 25 ; 进样量 10 ml 方案 1: 流动相为 70% 甲醇, 检测波长为 420 nm 方案 2: 流动相为 70% 甲醇, 检测波长为 205 nm 方案 3: 流动相为 70% 乙腈, 检测波长为 205 nm 方案 4: 流动相为 70% 乙腈 ; 检测波长为 448 nm 方案 5: 流动相为 60% 乙腈 ; 检测波长为 205 和 448 nm 梯度洗脱 C 8 硅胶柱 ; 流动相为乙腈和水, 检测波长为 205 和 448 nm; 流速为 0.8 ml/min; 柱温为 25 ; 进样量 10 ml 方案 1:0~60 min,60% ~90% 乙腈 ; 方案 2:0~10 min,60% ~80% 乙腈 ;10~40 min,80% ~90% 乙腈 ;40~50 min,90% 乙腈 2.5 毒素的溶血活性的检测各时间段洗脱物溶血活性的检测进样量为 90 ml, 约 5 min 收集一次洗脱液, 共收集 50 min, 重复 2 次, 将收集液通过真空旋转蒸发干燥后溶于 1 ml 甲醇中采用 5 ml 反应体系, 向离心管中加入 4 ml 0.5% 兔血红细胞溶液 0.75 ml 柠檬酸等渗缓冲液, 再加入洗脱物的甲醇溶液 0.25 ml, 于 37 水浴 30 min, 离心取上清液, 于 OD 540nm 下测其吸光度 Ai, 每组实验设 3 个平行, 以甲醇溶液为阴性对照 A0, 以全溶血溶液为阳性对照 Ac, 根据公式 (1) 得出其溶血百分数 (RH) Ai -A0 RH = Ac 100% (1) 主要色谱峰的溶血活性的检测进样量为 90 ml, 收集每个主要色谱峰的洗脱液, 重复 4 次, 将收集液通过真空旋转蒸发干燥后溶解于 1 ml 甲醇中溶血活性检测同节方法 3 结果与讨论 3.1 等度洗脱按照文献 [14] 的方法, 以 420 nm 为溶血毒素的检测波长,70% 甲醇等度洗脱的分离结果如图 1a 所示, 分离效果不理想, 峰型不好且出现大量倒峰 [19] marshall 等对海洋卡盾藻脂类的分析表明, 海洋卡盾藻含有大量不饱和脂肪酸, 其鱼毒性可能与 [2] 这些不饱和脂肪酸有关张文等对海洋卡盾藻 ( 香港株 ) 溶血毒素的研究表明, 其溶血毒素的组分至少含有 4 种组分, 其中 1 种可能为脂类,3 种为糖脂类糖脂是含有糖基的脂质化合物 [20], 是脂质中的一 [21] [22] 类, 属于复合脂质根据脂类物质的紫外吸收特征, 并依照 Suzuki 等对糖脂类的检测波长, 选择 205 nm 为检测波长, 其它条件不变, 进行甲醇 - 水 (7 3,V/V) 的等度洗脱得到的峰型有所改善, 但分离效果不好, 基线也有漂移 ( 图 1b) 考虑到甲醇的截止波长, 采用乙腈 - 水 (7 3,V/V) 的溶剂系统进行等度洗脱, 色谱峰的分离依旧不理想, 但峰型有所改善, 基线平稳 ( 图 1c) 从毒素粗提物的吸收波扫描图可知, 该粗提取物在 448 nm 处有吸收高峰 ( 图 2), 故采用 448 nm 为检测波长, 其它条件不变, 所得色谱图如图 1d 所示比较图 1c 和图 1d 可见, 保留时间为 20 min 处的倒峰 (205 nm 检测波长 ) 变为正峰 (448 nm 的检测波长 ) 采用乙腈 - 水 (6 4,V/V) 等度洗脱, 以 205 和 448 nm 为检测波长, 其它条件不变, 色谱峰的分离效果未得到改善, 但在乙腈 - 水 (7 3,V/V) 洗脱条件下保留时间为 20 min 的倒峰, 此时后移到 57 min, 由此可知, 在该洗脱条件下洗脱时间较长 ( 图 1e 和图 1f), 故需采用梯度洗脱 3.2 乙腈 - 水梯度洗脱本实验采用乙腈 - 水梯度洗脱, 乙腈浓度在 60 min 内由 60% 上升到 90%, 色谱峰的分离效果有了较

3 第期吴霓等 : 高效液相色谱分析鱼毒性藻类海洋卡盾藻溶血毒素图 1 海洋卡盾藻甲醇提取物等度洗脱的 HPLC-UV 图 Fig.1 HPLC-UV spectra of methanol extraction of C. marina a. 70% 甲醇,420 nm; b. 70% 甲醇,205 nm; c. 70% 乙腈,205 nm; d. 70% 乙腈,448 nm; e. 60% 乙腈,205 nm; f. 60% 乙腈, 448 nm a. 70% methanol, 205 nm; b. 70% methanol, 448 nm; c. 70% acetonitrile, 205 nm; d. 70% acetonitrile, 448 nm; e. 60% acetonitrile, 205 nm; f. 60% acetonitrile, 448 nm. 好地改善, 且基线平稳, 但色谱峰主要集中在了 35~ 65 min( 图 3a 和图 3b) 当采用如下梯度洗脱程序:0 ~10 min,60% ~ 80% 乙腈 ;10~ 40 min,80% ~ 90% 乙腈 ;40 ~ 50 min,90% 乙腈, 检测波长为 205 和 448 nm, 色谱峰的分离效果有了很大改善, 海洋卡盾藻溶血毒素的粗提物在 50 min 内得到了较好地分离, 且基线平稳 ( 图 4a 和图 4b) 检测波长为 205 nm 时保留时间为 16 min 的倒峰变为检测波长为 448 nm 时保留时间为 16 min 的正峰在此色谱条件下共分离出 20 多个色谱峰 3.3 各时间段洗脱物的溶血活性在乙腈和水梯度洗脱方案二的条件下, 每 5 min 洗脱物的溶血活性如图 5 所示粗提物中具有溶血图 2 毒素粗提物的吸收光谱图 Fig.2 Absorption spectrum of methanol extraction of C. marina

4 分析化学第 40 卷图 3 海洋卡盾藻甲醇提取物梯度洗脱 (0~60 min, 60% ~90% 乙腈 ) 的 HPLC-UV 图 Fig.3 HPLC chromatograms of methanol extraction of C.marina (gradient elution with 0-60 min, 60% -90% acetonitrile a. 205 nm; b. 448 nm. 图 4 海洋卡盾藻甲醇提取物梯度洗脱 (0~ 10 min,60% ~ 80% 乙腈 ;10~ 40 min,80% ~ 90% 乙腈 ; 40~50 min,90% 乙腈 ) 的 HPLC-UV 图 Fig.4 HPLC chromatograms of methanol extraction ofc.marina(gradient elution with 0-10 min 60% - 80% acetonitrile,10-40min80% -90% acetonitrile, min 90% acetonitrile) (a)205 nm;(b)448nm. 活性的物质主要集中在 5~40 min 进一步对 5~40 min 内各主要色谱峰的溶血活性进行检测, 结果如图 6 所示, 将具有溶血活性的色谱峰分别标记为 A B C D 和 E( 图 4a 和图 4b), 其中色谱峰 A 的溶血活性最高, 溶血百分数为 16.6 但图 4b 也显示, 色谱峰 A 是未完全分开的混合物质, 且不稳定, 其分离分析工作还有待进一步研究光谱分析显示色谱峰 A 顶点 1 处和 2 处 ( 图 4b) 的最适吸收波长分别为 446 和 440 nm, 色谱峰 B 的最适吸收波长 448 nm, 这都与 Kuroda 等 [14] 对海洋卡盾藻溶血活性物质的最佳吸收波长 [15] nm 和 miyazaki 等对圆鳞异囊藻溶血物质的紫外吸收高峰在 450 nm 处的报道结果一致图 5 Fig.5 每 5 min 洗脱物的溶血活性 Hemolytic activity of eluant of each 5 min

5 第期吴霓等 : 高效液相色谱分析鱼毒性藻类海洋卡盾藻溶血毒素图 6 Fig.6 具有溶血活性的时间段内各峰的溶血活性 Hemolytic activity of the separated fractions in hemolytic time-phase References 1 QIYu-Zao,HUANGChang-Jiang.OceanologiaetLimnologiaSinica,1997,28(4):337~342 齐雨藻, 黄长江. 海洋与湖沼,1997,28(4):337~342 2 ZHANG Wen,JIANG TiaṉJiu,WANG Rui.EcologicalScience,2008,27 (6):457~462 张文, 江天久, 王锐. 生态科学,2008,27(6):457~462 3 YAN Tian,FU Meng,LIJun,YU ReṉCheng,ZHOU Ming-Jiang.OceanologiaetLimnologiaSinica,2001, 32(4):420~427 颜天, 傅萌, 李钧, 于仁成, 周名江. 海洋与湖沼,2001,32(4):420~427 4 PANJie-Hui,LU Kai-Hong.Journalof NingboUniversity(NSEE),2008,21(4):479~484 潘洁慧, 陆开宏. 宁波大学学报 ( 理工版 ),2008,21(4):479~484 5 HamasakiK,TakahashiT,UyeS.MarineBiology,2003,143:981~988 6 OikawaH,FujitaT,Satomim,SuzukiT,KotaniY,YanoY.Toxicon,2002,40(11):1593~ Ito K,Asakawa m,beppu R,Takayama H,miyazawa K.MarinePolution Bulentin,2004,48(11-12): 1116~ DurbinE,TeegardenG,CampbelR,CembelaA,Baumgartnerm F,mateB R.HarmfulAlgae,2002,1(3): 243~251 9 JIANG TiaṉJiu,XU Yi-Xiao.ActaOceanologicaSinia,2006,28(6):169~175 江天久, 徐轶肖. 海洋学报,2006,28(6):169~ XU Yi-Xiao,JIANG TiaṉJiu.ActaScientiaeCircumstantiae,2006,26(8):1331~1336 徐轶肖, 江天久. 环境科学学报,2006,26(8):1331~ HEJia-Yuan,CHEN ming-hui,hezheṉrong.actahydrobiologicasinica,1996,20(1):41~48 何家苑, 陈明惠, 何振荣. 水生生物学报,1996,20(1):41~48 12 PENG Xi-Chun,YANG Wei-Dong,LIUJie-Sheng.Journalof TropicalandSubtropicalBotany,2005,13(1): 25~28 彭喜春, 杨维东, 刘洁生. 热带亚热带植物学报,2005,13(1):25~28 13 WeissTJ,Brownm,ZeringueHJ.JournaloftheAmericanoilChemists society,1971,48(4):145~ Kuroda A,NakashimaT,YamaguchiK,Oda T.ComparativeBiochemistryand Physiology,2005,141(3): 297~ MiyazakiY,NakashimaT,IwashitaT,FujitaT,YamaguchiK,OdaT.AquaticToxicology (Amsterdam),2005, 73(4):382~ GuilardRRL,RytherJH.CanJ microbiol,1962,8:229~ SONG Xiu-Kai,WANG Wei,RUShao-Guo.MarineSciences,2006,30(6):82~86 宋秀凯, 王蔚, 汝少国. 海洋科学,2006,30(6):82~86 18 PENG YiṉHui,LIUJie-Sheng,LIHong-Ye,HUANG ZhaṉChao,LIXiu-Qin,YANG Wei-Dong.Journalof

6 分析化学第 40 卷 HygieneResearch,2009,38(6):653~656 彭颖慧, 刘洁生, 李宏业, 黄展超, 李秀琴, 杨维东. 卫生研究,2009,38(6):653~ marshalja,nicholspd,hamiltionb.harmfulalgae,2003,4(2):273~ YICui-Ping,WANGLi,YAO Hui-Yuan.CerealsandOils,2003,5:25~26 易翠平, 王立, 姚惠源. 粮油与油脂,2003,5:25~26 21 WANG Jing-Yan,ZHU Sheng-Geng,XU Chang-Fa.Biochemistry.Beijing:Higher Education Press,2002: 79~122 王镜岩, 朱圣庚, 徐长法. 生物化学. 北京 : 高等教育出版社,2002:79~ SuzukiH,Park W K,LimSY.FoodChemistryandToxicology,2000,65(6):931~933 AnalysesofHemolyticToxinfromIchthyotoxicPhytoplankton Chatonelamarina(HongKongStrain)by HighPerformanceLiquidChromatography WU Ni,JIANG *,TiaṉJiu,JIANG Tao (ResearchCenterforHarmfulAlgaeandAquaticEnvironment,JinanUniversity,Guangzhou510632,China) Abstract Chatonela marinaisatypicalfisẖkiling HAB (HarmfulAlgaeBloom)species,which couldproducehemolytictoxinandresultinmassmortalityoffishes.inordertounderstandthetransmissionandtransformationofhemolytictoxininfoodchain,highperformanceliquidchromatography (HPLC)withgradientelutionhasbeenusedtoseparatehemolytictoxinextractedfrom C.marina. Diferentsolventsystems,detectionwavelength,isocraticelutionandgradientelutionforHPLCwere compared.theseparationiscarriedoutonac8column (4.6mm 150mm,5 mm)withacetonitrile/ waterasmobilephase,gradientelution (0-10 min60%-80% acetonitrile,10-40min80%-90% acetonitrile,40-50min90% acetonitrile)withaflowrateof0.8ml/min.thedetectionwavelength is205nmand448nm,andthecolumntemperatureis25.hemolysisbioassayshowsthatthereare atleastfivecomponentsinc.marina (HongKongstain).Onecomponenthadthemaximumultraviolet(UV)absorptionat448nm,anotherthatwasnotseparatedcompletelyhadthemaximaat440nm and446nm,andtheothersalhadthemaximalpeakat205nm. Keywords Highperformanceliquidchromatography;Chatonelamarina;Hemolytictoxin (Received8November2011;accepted18January2012)

70 陈伟珠, 等 : 超高压液相色谱法测定鱼油中的和 DHP-EE % (RSD 1.05 %) respectively. The RSD of repetition was 1.54 %(n=6) for and 1.25 %(n=6) for. This method was

70 陈伟珠, 等 : 超高压液相色谱法测定鱼油中的和 DHP-EE % (RSD 1.05 %) respectively. The RSD of repetition was 1.54 %(n=6) for and 1.25 %(n=6) for. This method was DOI 10.3969/j.issn.1005-6521.2013.08.019 Food Research And Development 2013 3 34 6 69 1 2 1 1 * 1 1 1 1. 361005 2. 361005 : 采用超高压液相方法检测鱼油中的二十碳五烯酸乙酯 () 和二十二碳六烯酸乙酯 (), 采用 UPLC BEH C18(2.1 mm 50 mm,1.7 μm)