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1 江西农业大学学报 2017,39(2): Acta Agriculturae Universitatis Jiangxiensis http: / / xuebao.jxau.edu.cn DOI: / j.jjau 朱肖亭, 王鸿周, 肖小帅, 等. 精子不同处理方式对绵羊胞质内单精子注射效率的影响 [J]. 江西农业大学学报,2017,39(2): 精子不同处理方式对绵羊胞质内单精子注射效率的影响 朱肖亭, 王鸿周, 肖小帅, 滑留帅, 施巧婷, 辛晓玲, 徐照学, 王二耀 ( 河南省农业科学院畜牧兽医研究所, 河南郑州 ) 摘要 : 胞质内单精子注射前对精子进行预处理是模拟精子受精过程的变化增强精子解聚能力 常用的精子处理方法有聚乙烯吡咯烷酮 二硫苏糖醇 冻融处理等 研究表明 ICSI 卵的卵裂率低的主要原因是精子解聚能力差 因此研究精子的处理方法提高 ICSI 的注射效率是十分必要的 该实验探讨了精子不同预处理方法对 ICSI 胚胎发育的影响 利用超声波细胞粉碎仪对精子做不同时间 (3 s 6 s) 的处理, 观察 ICSI 胚胎发育情况, 选择最佳的处理时间, 然后利用超声波分别处理鲜精和冻精, 比较不同精液对 ICSI 胚胎发育的影响 将精子分别利用超声波和碱处理, 对比两种不同预处理方法对 ICSI 卵卵裂率和桑囊胚率的影响, 结果表明 :(1) 超声波处理绵羊精子最佳的处理时间是 6 s;(2) 鲜精和冻精经超声波处理后对 ICSI 卵的卵裂率 (39.1% vs 37.4%, P>0.05) 和桑囊率 (12.3% vs 13.2%,P>0.05) 影响不显著 ;(3) 冻精经碱处理后其 ICSI 卵的卵裂率 (46.6% vs 37.4%,P<0.05) 和桑囊胚率 (20.4% vs 13.2%,P<0.05) 均显著高于超声波处理冻精 关键词 :ICSI; 精子 ; 超声波 ;NaOH; 中图分类号 :S826.2 文献标志码 :A 文章编号 : (2017) Effects of Different Spermatozoa Treatments on the Efficiency of Intracytoplasmic Sperm Injection ( ICSI) in Sheep ZHU Xiao ting,wang Hong zhou,xiao Xiao shuai,hua Liu shuai, SHI Qiao ting,xin Xiao ling,xu Zhao xue,wang Er yao ( Henan Academy of Agricultural Sciences, Academy of Animal Husbandry and Veterinary, Zhengzhou ,China) Abstract:The aim of sperm pretreatment before sperm injection is to simulate the changes in the sperm fertilization process and to enhance the depolymerization capacity of the sperm.there are three kinds of sperm treatments that are frequently used: polyvinyl pyrrolidone ( PVP ), dithiothreitol ( DTT ), freezing thawing process.studies have shown that low sperm depolymerization is mainly caused by low cleavage rate.therefore,it is necessary to study the sperm treatment method to improve the injection efficiency of ICSI.The effects of dif ferent pretreatment methods on the embryo development of ICSI were discussed.by comparing the effects of dif ferent ultrasonic treatment times (3 s,6 s) and spermatozoa ( fresh and frozen semen) on the cleavage rate of ICSI and the blastocyst rate,it was shown that (1) the optimal sheep sperm processing time was ultrasound 6 seconds;(2) ultrasonic treatment of fresh and frozen ICSI semen showed no significant effect on the oocyte cleavage rate (39.1% vs 37.4%) and the morula / blatocyst rate(12.3% vs 13.2%);(3) treated with ( NaOH 收稿日期 : 修回日期 : 基金项目 : 国家自然科学基金项目 (2014ZX ) Project supported by the National Natural Science Foundation of China (2014ZX ) 作者简介 : 朱肖亭 (1990 ), 女, 硕士生, 主要从事动物胚胎工程研究, @ qq.com; 通信作者 : 王二耀, 副研究员, wangey@ ioz.ac.cn

2 372 江西农业大学学报第 39 卷 and the oocyte cleavage rate was 46. 6%,vs 37. 4% and the morula / blastocyst rate was 20. 4% vs 13. 2%; P<0.05,significanlly higher than those treated with ultrasonic waves. Keywords:ICSI;spermatozoa;ultrasound;NaOH; 胞质内单精子注射技术 (Intracytoplasmic Sperm Injection,ICSI) 是 20 世纪 80 年代后期发展起来的 一项较为尖端的人工辅助生殖技术, 它绕过正常受精的生理过程, 借助于显微操作仪器, 直接将处理后 的单个精子注入到卵母细胞胞质内 (MII), 使精卵结合并完成受精的过程 ICSI 对研究动物受精机理 保护濒危物种 扩大畜牧生产和治疗人类生殖疾病等方面具有重要的作用, 同时还能够提高转基因动物 的生产效率, 使得该技术不论对于科学研究还是生产实践都有着十分重要的意义 目前, 成功使用并获 得转基因动物的方法主要有原核显微注射法 核移植转基因法 逆转录病毒载体法 精子载体法等 单 精子注射法转基因 (ICSI SMGT) 的基本原理是利用 ICSI 技术将携带外源基因 DNA 的精子导入卵母细 胞 ICSI SMGT 以其简便, 高效, 不受 DNA 片段大小限制等优势已在多种动物验证使用 1999 年 Perry [1] 等首次将 ICSI 技术应用于小鼠转基因 大量研究证实, 精子质膜可显著降低外源基因的整合, 采取 电击 DMSO 冻融和超声等破膜处理或脂质体包裹外源 DNA 可显著提高胚胎转基因效率 [2 4] 据报 [5] 导把断尾兔精子头作为基因载体, 将外源目的基因 ( 牛乳糖 ) 通过超声波断尾后破损的精子膜导入精 子头内, 再通过 ICSI 将精子头直接注入卵胞浆内, 培养出了能表达新基因功能的子代 Li [6] 根据碱溶 液破坏细菌细胞膜, 但不损伤 DNA 结构这一特点, 利用碱处理精子, 研究表明碱 (10mMol NaOH) 能够 破坏精子质膜和去除顶体, 选取精子头实施 ICSI, 获得的卵裂率和桑囊率与鲜精没有显著差异, 与 DNA 片段共孵育后获得 100% 的转基因效率 此后碱处理精子进行 ICSI 介导转基因的研究在牛和兔上得到 应用 本实验以探索超声波和碱处理两种精子预处理方法对绵羊 ICSI 卵裂率和桑囊率发育的影响, 旨 在优化绵羊 ICSI 的操作体系, 为后续的深入研究奠定基础 1 材料和方法 1.1 材料 卵巢采自河南省焦作市和新郑市绵羊屠宰场, 将采集到的卵巢置于含双抗的 37 生理盐水中保 存, 于 4 h 内送回实验室取卵 绵羊鲜精采自河南省农业科学院现代农业科技试验示范基地, 鲜精保存 于 37 保温箱,1 h 内送回实验室 绵羊冻精使用的是陶赛特精液 1.2 试剂和部分操作液的配制 所用试剂和药品, 除特别声明, 均购自 Sigma 公司 胎牛血清 (FBS Hyclone) 促卵泡素 促黄体素 雌激素 (FSH LH E 2 宁波激素第二厂 ) 表皮生长因子 ( EGF Peprotech 美国 ) 输卵管合成液 (SOF 自制 ) 谷氨酰胺 (Gln) 半胱氨酸 (Cys) 必需氨基酸 (EAA) 非必需氨基酸 (NEAA) 血清白蛋白 (BSA) IVM 成熟液 Hepes199+10%FBS+1mmol / L 丙酮酸钠 +10μg / ml FSH+10 μg / ml LH+1 μg / ml E ng / ml EGF+1 mmol / L Gln+100 μg / mlcys IVC 1 10 mlsof +1%NAA+2%EAA+1 mmol / L Gln+30 mgbsa+20 ng / ml EGF IVC 2 9 mlsof+10%fbs +1%NAA+2%EAA+1 mmol / L Gln+20 ng / ml EGF 1.3 卵母细胞的采集和成熟培养 用带有 12 号针头的注射器抽吸卵巢表面直径 2 ~ 8 mm 的卵泡, 在体视显微镜下收集卵丘 卵母细 胞复合体, 将 A B 级 COCs 转入 IVM 成熟液微滴中 将 IVM 盘置于 % CO 2 100% 湿度的 CO 2 培养箱中进行培养 1.4 卵母细胞成熟的鉴定 卵母细胞的成熟以排出第一极体为标志 培养 22~24 h 后, 在含有 0.1% 透明质酸酶的 H 199 中迅速 消化去除周围的卵丘细胞 体视镜下挑选带有第一极体的卵母细胞, 记录成熟细胞数, 置培养箱中备用 1.5 精子的处理 超声波处理冻精将 1 粒冻精置于 38 H 199 中解冻, 各取 1 ml 解冻精液利用超声波细胞粉 碎仪对精子断尾, 在频率为 20 ~ 25 khz, 功率为 25 w 的条件下, 分别处理 3 s 6 s 各取 1 μl 处理精子,

3 第 2 期 朱肖亭等 : 精子不同处理方式对绵羊胞质内单精子注射效率的影响 373 做 100 倍稀释后, 置于倒置显微镜下观察断尾情况, 统计精子断尾率 碱处理冻精将与超声波处理的同一管解冻精液与 200 mmol / L 碱溶液 1 10 混合, 室温孵育 1 h 后, 加入同浓度 HCl 溶液, 调整 ph 至 7.3, 置于 4 冰箱备用 鲜精的处理用 37 H 199 对鲜精做稀释, 鲜精和稀释液的比为 1 4 取鲜精 200 μl, 置于 800 μl 稀释液中 稀释精液置于冰浴超声波细胞粉碎仪处理 6 s 1.6 胞质内单精子注射将处理后的精子和卵母细胞放入同一显微操作液盘中, 用固定针将卵母细胞的第一极体固定于时钟 6 点或 12 点钟位置, 注射针于 3 点或 9 点钟位置注射 1.7 ICSI 卵的激活将 ICSI 卵母细胞, 放入含有 10%FBS 的液滴中培养 20 min 后, 导入 5 μmol / L 离子霉素 ( Ionomy cin) 中避光作用 5 min 1.8 ICSI 卵的体外培养将激活后卵母细胞转入 IVC 1 液中, 清洗 3 遍后导入微滴培养液中置于 %CO 2 的培养箱中培养,24 h 后观察卵裂情况, 记录卵裂数 将卵裂的 ICSI 胚导入颗粒细胞盘中共培养, 每 2 d IVC 2 换液 1 次,7 d 后检查桑囊胚情况, 记录数据 2 结果与分析 2.1 精子超声波处理时间对 ICSI 胚发育的影响本实验比较了超声波处理精子时间对 ICSI 的影响 选取 3 s 和 6 s 处理的精子头进行 ICSI, 比较精子超声波处理时间对 ICSI 胚发育的影响 由表 1 可知 :6 s 处理组的卵裂率显著高于 3 s 处理组 (37.4% vs 28.9%,P<0.05), 但 2 组的桑囊率没有显著差异 (13.2% vs 12.2%,P>0.05) 表 1 精子超声波处理时间对 ICSI 胚发育的影响 Tab.1 Influence of ultrasonic treatment time on development of ICSI embryo growth 处理组 断尾率 / % Treatment group Broken rate Mulberry / Blastula rate 3 秒 3 seconds 65 a a 秒 6 seconds 88 b b 不同状态精子经超声波处理后对 ICSI 胚发育的影响 对鲜精和冻精分别进行 6 s 超声波处理, 比较鲜精和冻精对 ICSI 胚发育的影响, 如表 2 所示 鲜精 和冻精经超声波处理后,2 组之间的精子短尾率 (82% vs 88%,P > 0. 05) 卵裂率(39. 1% vs 37. 4%, P>0.05) 和桑囊率 (12.3% vs 13.2%,P>0.05) 均差异不显著 因此鲜精和冻精经超声波处理后对 ICSI 胚的发育影响不显著 表 2 鲜精和冻精超声波处理后对 ICSI 胚发育的影响 Tab.2 Influence of frozen and fresh femen on development of ICSI embryo growth 精液种类 断尾率 / % Kind of semen Brokentail rate Mulberry / Blastula rate 鲜精 Fresh semen 冻精 Frozen semen 超声波和 NaOH 2 种精子处理方式对 ICSI 胚发育的影响 由表 3 可知, 不同浓度的 NaOH 对精子断尾率的影响不同 根据表 2 精子断尾率对 ICSI 胚发育的

4 374 江西农业大学学报第 39 卷 情况, 选择 200 mmol 的 NaOH 处理精子 比较超声波和 NaOH 2 种精子处理方式对 ICSI 胚发育的影 响 注射后 24 h 观察卵裂率和 7 d 观察 ICSI 胚发育率 由表 4 可以看出,NaOH 处理组的卵裂率 (46. 6%) 桑囊率(20.4%) 均显著高于超声波组 (37.4% 13.2%) 以上数据显示 NaOH 处理精子较超声波 处理精子更适宜于绵羊的 ICSI 表 3 NaOH 不同浓度对精子的影响 Tab.3 Effects of different concentrations of alkali on spermatozoa NaOH 浓度 / (mmol L -1) 断尾率 / % 表 4 冻精不同预处理对 ICSI 胚发育的影响 Tab.4 Effects of different pretreatment of spermatozoa on development of ICSI embryo growth 处理组 Treatment group Mulberry 超声波 Ultrasonic a 13.2 a NaOH Alkali b 20.4 b 同一列中, 不同字母表示为差异显著 (P<0.05) 3 讨论与结论 3.1 超声波处理时间对 ICSI 胚发育的影响 采用有效地精子制动方式, 减少卵母细胞暴露在空气中的时间, 降低操作对卵母细胞的损伤是简化 ICSI 操作过程 超声波处理精子能够同时制动多个精子是一种高效简易的精子处理方式 但不同的处 理时间和处理强度对精子造成的机械损伤不同 超声波对精子的机械损伤主要表现在对精子结构完整 性的破坏, 包括精子尾部的断裂, 顶体和精子质膜的丢失 超声波处理不足使精子断尾率低, 顶体和精 子质膜去除不完全 ; 精子处理时间过长可能会损伤精核, 破坏染色体结构, 使其失去与卵母细胞受精的 能力 本实验根据短尾率选取 3 s 和 6 s 2 组精子头实施 ICSI, 通过精子断尾率判断最适宜 ICSI 胚胎发 育的处理时间 结果显示超声波处理 6 s 组的卵裂率显著地高于 3 s 处理组, 但注射后 2 组的桑囊率差 异不显著 目前超声波处理精子实施 ICSI 在牛 猪 兔和人上已得到应用, 但不同动物获得的效果存在 很大的差异 目前尚未对超声波处理绵羊精子的报道 3.2 不同状态精子经超声波处理后对 ICSI 发育的影响 冷冻精液生产过程中及解冻精液时都会对精子质膜的稳定性产生较大的影响 鲜精精浆中含有 DF( 去能因子 ) 精胺以及高浓度 Zn 2+, 这些物质的存在不利于精子的获能, 冻精中添加有冷冻保护剂降 低了获能抑制素的影响 [7] [8] 张文龙等将新鲜精子和冷冻精子进行 ICSI, 发现冻精 ICSI 受精率 [9] (52.21%) 显著高于鲜精 (26.44%,P<0.05) 周曾娣等将冻融后的精子超声波断尾后, 将精子头注入 兔卵母细胞内, 其受精率和卵裂率与新鲜完整精子相比无显著差异 (72% vs 70%,91.6% vs 90%;P > 0.05) 本研究中, 超声波断尾鲜精组和断尾冻精组的胚胎卵裂率卵裂率 (39.1% vs 37.4%,P>0.05) 和 桑囊率 (12.3% vs 13.2%,P>0.05) 均无显著差异 说明鲜精和冻精经超声波断尾处理后对精子的受精 [10] 能力和早期胚胎发育能力无明显影响 这与罗龙兴在猪上的研究结果相同 3.3 超声波和 NaOH 2 种精子处理方式对 ICSI 胚发育的影响 ICSI 前破坏精子质膜和移除顶体可造成卵母细胞更早的激活和提高桑囊率 精子促进卵子的激 活, 是由精子激活卵母细胞因子完成的 SOAF 主要存在于精子头膜下基质和核周基质中, 精子质膜的 [11] 损伤有利于 SOAF 的释放 Kurome 等将超声波处理的精子头进行 ICSI, 得到了 17.9% 的囊胚率 本 实验比较了超声波和碱 2 种处理精子方式, 发现碱处理精子组的卵裂率卵裂率 ( 46. 6%) 桑囊率

5 第 2 期 朱肖亭等 : 精子不同处理方式对绵羊胞质内单精子注射效率的影响 375 (20.4%) 均显著高于超声波组 (37.4% 13.2%) Li [6] 利用 NaOH(10 mmol) 处理小鼠精子, 获得 67.4% 的囊胚率, 与基因共孵育后获得 100% 的转基因率, 移植后获得转基因小鼠 证实了碱处理精子的安全 [12] 和可实用性, 展现了碱处理精子介导转基因的优越性 刘庆友比较了 NaOH 不同处理时间对胚胎发 育的影响, 结果表明短时间的精子处理能使卵母细胞受精, 且对卵裂率没有明显的影响 ; 但精子处理时 间延长, 精子头部尾部分离, 精子质膜受到严重的损坏 胞质内单精子注射前对绵羊精子做超声波和碱 2 种不同方式的预处理, 结果显示碱处理组的卵裂 率和桑囊胚率均显著的高于超声波组, 说明绵羊胞质内单精子注射操作中, 精子碱预处理相比超声波处 理是一种更佳的精子处理方式 参考文献 : [1] Perry A C, Wakayama T, Kishikawa H, et al. Mammalian transgenesis by intracytoplasmic sperm injection [ J]. Science, 1999,284(5417): [ 2] Bachiller D,Schellander K,Peli J,et al.liposome mediated DNA uptake by sperm cells[ J].Mol Reprod Dev,1991,30(3): [3] Gagné M,Pothier F,Sirard M.The use of electroporated bovine spermatozoa to transfer foreign DNA into oocytes[ J].Animal Cell Electroporation and Electrofusion Protocols,995: [4] Kuznetsov A V,Kuznetsova I V,Schit I Y.DNA interaction with rabbit sperm cells and its transfer into ova in vitro and in vivo[ J].Molecular Reproduction and Development,2000,56(2): [5] Perry A C, Wakayama T, Kishikawa H, et al. Mammalian transgenesis by intracytoplasmic sperm injection [ J]. Science, 1999,284(5417): [6] Li C,Mizutani E,Ono T,et al.production of normal mice from spermatozoa denatured with high alkali treatment before ICSI [ J].Reproduction,2009,137(5): [7] 陈大元. 受精生物学一受精机制与生殖工程 [M]. 北京 : 科学出版社,2000: Chen D Y,Fertilization biology a fertilization mechanism and reproductive engineering [ M].Beijing:Science Press,2000: [8] 张文龙, 赵驻军, 田树军, 等. 影响山羊胞质内单精子注射 ( ICSI) 效果的因素研究 [ J]. 畜牧兽医学报,2009,40(3): Zhang W L,Zhao Z J,Tian S J,et al.study on influences of the effect of intracytoplasmic sperm injection(icsi)in goat[j]. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica,2009,40(3): [9] 周曾娣, 黎曼侬, 陈云鹤, 等. 超声断尾精子头显微受精 输卵管内移植研究的初步报告 [ J]. 中国优生与遗传杂志, 2003,11(1): Zhou Z D,Li M N,Chen Y H,et al. Preliminary Report on the study of transplantation of transplantation of transplanted tubes[ J].Chinese Journal of Birth Health &Heredity,2003,11(1): [10] 罗龙兴, 卢晟盛, 许丹娜, 等. 精子不同处理和胰岛素不同浓度对猪卵母细胞胞质内单精子显微受精的影响 [J]. 中国 兽医学报,2009(5): Luo L X,Lu S S,Xu D N,et al.effects of different sperm treatments and insulin concentrations on intracyto plasmic sperm injection of porcine oocytes[ J].Chinese Journal of Veterinary Science,2009(5): [11] Kurome M,Saito H,Tomii R,et al.effects of sperm pretreatment on efficiency of ICSI mediated gene transfer in pigs[ J].J Reprod Dev,2007,53(6): [12] 刘庆友, 王丹, 张会娜, 等. 不同精子处理对应用 ICSI Tr 技术生产转基因水牛胚胎效率的影响 [ J]. 基因组学与应 用生物学,2011,30(4): Liu Q Y,Wang D,Zhang H N,et al.effects of sperm treatment on efficiency of production transgenic buffalo embryo using ICSI Tr technique[ J].Genomics and Applied Biology,2011,30(4):

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