632 第 36 卷第 7 期 Frizled4inhibitssignificantlyproliferation ofkeratinocytes. Theseresultsindicatethattheexpresion of Frizled4isasociatedwiththegrowthan

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宥璩
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1 631 文章编号 : (2014) 论著 Frizzled4 在小鼠毛囊周期中的表达陈年, 伍津津, 邱伟明, 唐辉, 唐书谦 ( 重庆, 第三军医大学大坪医院野战外科研究所皮肤科 ) [ 摘要 ] 目的探讨 Wnt 蛋白的受体分子 Frizled4 在小鼠毛囊周期中的表达功能及其意义方法利用实时定量 PCR RTPCR Westernblot 和免疫荧光等技术分别检测 Frizled4mRNA 和蛋白在毛囊生长期 (P1d P3d P8d) 退化期 (P16d) 和静止期 (P21d) 中的表达免疫荧光技术检测 Frizled4 在小鼠皮肤上皮细胞 JB6cl307b 中的定位,MTT 检测用抗 Frizled4 抗体处理 JB6cl307b 细胞后的增殖情况结果在毛囊生长期早期,Frizled4mRNA 和蛋白在 P1d 的小鼠背部皮肤中表达明显, 膜表达于 Bulge 毛囊外根鞘及毛球外侧在 P3d,Frizled4 蛋白表达明显上调, 主要表达于 Bulge 毛囊外根鞘内根鞘 precortex 部分毛球外侧在生长中期 (P8d),Frizled4 蛋白的表达最强, 集中在毛囊 Bulge 外根鞘上段及内根鞘当毛囊进入退化期 (P16d),Frizled4mRNA 和蛋白的表达显著降低 (P<0.05), 此时主要定位于 Bugle 而在静止期,Frizled4mRNA 和蛋白表达最低 (P<0.05), 只有少量 Frizled4 阳性细胞出现在毛囊 Bulge 免疫荧光技术检测 Frizled4 蛋白同样也在 JB6cl307b 细胞膜中表达 MTT 结果显示与对照组相比,10μg/mL 的抗 Frizled4 抗体处理 JB6 cl307b 细胞后光密度值明显降低 (P<0.05), 而 20μg/mL 的抗 Frizled4 抗体处理后的光密度值降到最低 (P<0.05) 结论 Frizled4 在毛囊周期中的表达具有时空特异性伴随着毛囊的生长,Frizled4 的 mrna 和蛋白水平都呈现高表达, 随着毛囊的退化而表达降低, 直至静止期维持低表达水平拮抗 Frizled4 蛋白的作用促使细胞增殖受到明显抑制, 提示 Frizled4 的表达与毛囊细胞的增殖和分化相关 [ 关键词 ] Frizled4; 毛囊 ; 小鼠 ;Wnt; 抗体 [ 中图法分类号 ] R ;R329.28;R394.2 [ 文献标志码 ] A ExpresionprofileofFrizzled4duringhairfoliclecycle ChenNian,WuJinjin,QiuWeiming,TangHui,TangShuqian(DepartmentofDermatology,InstituteofSurgeryResearch,Da pinghospital,thirdmilitarymedicaluniversity,chongqing,400042,china) [Abstract] Objective ToinvestigatetheexpresionandfunctionofFrizled4,areceptorofWnt proteins,duringmousehairfoliclecycle.methods QPCR,Westernblotingandimmunostainingwereused todetectthemrnaandproteinexpresionoffrizled4inmousehairfoliclecycleat5timepoints:thefirstday afterbirth(p1d),p3d,p8d,p16d,andp21d.immunostainingwasusedtodetecttheproteinexpresionof Frizled4inmouseskinepithelium cellinejb6cl307b.mttasaywasusedtodetectproliferationofjb6 cl307bcelsaftertreatmentofantifrizled4antibody.results AtP1d,mRNAandproteinofFrizled4 werebothdetectedinmouseskinandfrizled4wasexpresedinthebulge,outrootsheath(ors)andlateral hairbulb.atp3d,proteinexpresionoffrizled4wasupregulatedinthebulge,ors,innerrootsheath (IRS),precortexandpartoflateralhairbulb.Andatmiddleanagen(P8d),proteinofFrizled4was expresedatthehighestlevelinthebulge,ors,irsandprecortex.andthenatcatagen(p16d),expresion offrizled4wasdecreasedsignificantly(p<0.05)andmainlylocatedinthebulgewhilelitleinorsand IRS.Whenhairfolicleswereattelegen,expresionofFrizled4reducedtothelowestlevel(P<0.05)and wasrestrictedinthebulge.frizled4wasexpresedoncelmembranesofjb6cl307bcels.aftertreatmentof 10μg/mLantiFrizled4antibody,OD valuesdecreasedsignificantlycomparedwiththatofcontrols(p< 005).Aftertreatmentof20μg/mLantiFrizled4antibody,OD valuesdroppedtothelowestlevel(p< 005).Conclusion ExpresionofFrizled4isspecificandspatiotemporalduringhairfoliclecycle.Itis significantlyhighatanagen,reducesatcatagenandmaintainsatalowestlevelattelegen.antagonism of [ 基金项目 ] 国家高技术研究发展计划 (863 计划,2012AA ); 国家自然科学基金 ( ) [ 通信作者 ] 伍津津, 电话 :(023) , w j@163.com [ 优先出版 ] htp://

2 632 第 36 卷第 7 期 Frizled4inhibitssignificantlyproliferation ofkeratinocytes. Theseresultsindicatethattheexpresion of Frizled4isasociatedwiththegrowthanddiferentiationofhairfolicles. [Keywords] Frizled4;hairfolicle;mice;Wnt;antibody SupportedbytheNationalHighTechnologyResearchandDevelopmentProgramofChina(863Program,2012AA )andtheNationalNaturalScience FoundationofChina( ).Corespondingauthor:WuJinjin,Tel: , w j@163.com 毛囊是皮肤重要的附属器官, 生产毛发, 发挥着保暖感觉吸引异性等重要作用毛囊周期性的生长退化和静止引起毛发的生长和退化而毛囊异常与脱发多毛症甚至肿瘤的发生相关 [1-3] 因而对毛囊生长调控的研究具有很重要的科学意义 Wnt 信号是调控毛囊周期最重要的信号之一 [4] 目前对于 Wnt 信号中的受体 Frizled 家族成员在毛囊中的表达及作用尚不十分清楚作为 Frizled 家族中的一员,Frizled4 与配体 Wnt 蛋白共同作用介导 Wnt 信号通路下游信号 [5-6], 在机体中发挥着重要作用已报道 Frizled4 调控卵泡黄体的形成, 并和外周眼的发育相关 [5,7-8], 但是目前仍未有报道 Frizled4 在整个毛囊周期中的表达本研究将利用实时定量 PCR RTPCR Western blot 和免疫荧光技术从 mrna 和蛋白水平检测 Friz zled4 的表达, 并以细胞皮肤上皮细胞 JB6cl307b 为细胞模型, 利用 MTT 技术检测抗 Frizled4 抗体处理 JB6cl307b 细胞后的增殖情况, 以期为进一步研究毛囊的周期性调控提供一定的基础 1 材料与方法 1.1 材料 [9] 参照赖向东等的研究中对小鼠毛囊周期的形态特征描述, 从第三军医大学大坪医院野战外科研究所实验动物中心选取生长期早期 : 出生后 1d(P1d) 和 P3d, 生长期中期 P8d, 退化期 P16d 和静止期 P21d 的 C57BL/6 雌性小鼠各 3 只小鼠皮肤上皮细胞 JB6cl307b 购买于 ATCC 1.2 主要试剂及实验仪器 Trizol(Invitrogen, 美国 ), 反转录第一链 cdna 合成试剂盒 (Roche, 瑞士 ),LightCycler 480DNASYBRGreenⅠ Master (Roche, 瑞士 ),PCRMixer( 天根, 中国 ), 山羊抗 Frizled4 抗体 (Santacruz, 美国 ), 山羊 IgG( 碧云天, 中国 ),RIPA PMSF( 碧云天, 中国 ),GAPDH( 康成, 中国 ),HRP 标记的山羊抗小鼠 ( 中衫, 中国 ),HRP 标记的驴抗山羊 ( 中衫, 中国 ),Cy3 标记的驴抗山羊 ( 碧云天, 中国 ),DAPI( 碧云天, 中国 ) 垂直电泳仪湿转仪 (BioRad, 美国 ), 石蜡切片机 (Leica, 德国 ), 实时荧光定量 PCR 仪 (Stratagene, 美国 ), 凝胶成像仪 (BioRad, 美国 ), 荧光显微镜 (Olympus, 日本 ) 1.3 方法 C57BL/6 小鼠背部皮肤样本的获得分别将 P1d P3d P8d P16d P21d 的 C57BL/6 小鼠断颈处死, 用眼科剪剪去背部毛发后取得小鼠背部皮片, 准备用于后续实验实时定量 PCR 和 RTPCR 检测小鼠背部皮肤中 Friz zled4mrna 的表达 RNA 的提取 : 在加有液氮的研钵中将获得的小鼠皮片分别磨碎, 随后加入 Trizol 提取 RNA 分别取 1.0μgmRNA 作为模板进行逆转录反应获得 cdna, 具体条件参照罗氏公司的逆转录反应步骤实时定量 PCR 反应体系包括 : 总体积 25μL,Mixer12.5μL, 上游引物 ( 浓度为 10μmol/L) 075μL, 下游引物 ( 浓度为 10μmol/L)0.75μL,cDNA200ng, 加 ddh 2 O 补足 25μL 反应条件为 95 预变性 10min,95 30s,58 1min,72 30s, 反应 40 个循环每次每个样本重复 3 个复管, 将采集到的信号做统计学分析 RTPCR 反应体系包括 : 总体积 20μL,PCR Mixer10μL, 上游引物 ( 浓度为 10μmol/L)1μL, 下游引物 ( 浓度为 10μmol/L)1μL,cDNA 1μg, 加 ddh 2 O 补足 20μL 反应条件为 95 预变性 3min, 95 30s,58 1min,72 30s, 反应 30 个循环,72 延伸 10min 后 4 保存将所得的 DNA 产物跑 1% 琼脂糖凝胶电泳, 在凝胶成像仪下采集图像 Frizled4 的引物序列 : 上游 5 TGACAACTTTCACGCCGC TC3, 下游 5 TACAAGCCAGCATCGTAGCCACAC3 内参 GAPDH 的引物序列 : 上游 5 ACCACAGTCCATGCCATCAC3, 下游 5 TCCACCACCCTGTTGCTGTA Westernblot 检测小鼠背部皮肤中 Frizled4 蛋白的表达蛋白提取 : 在加有液氮的研钵中将小鼠皮片分别研碎, 依照每 20mg 组织加 200μL 裂解液的比例加入含 1mmol/L PMSF 的 RIPA 裂解液, 将组织粉末裂解完全后 g 离心 10min, 收集上清液利用考马斯亮蓝法测定蛋白浓度, 蛋白在 100 变性 5min 配好 SDSPAGE 后将各蛋白样品上样 25μg, 电泳后电转到 PVDF 膜上, 用 TBST 漂洗 PVDF 膜, 在 6% 脱脂奶粉溶液中室温封闭 1~2h, 置 4 冰箱过夜用 PBS 洗 15min 1 次,5min 4 次用 3% BSA 按照稀释抗 Frizled4 抗体, 稀释抗 GAPDH 抗体, 室温孵育 1h PBS 漂洗 15min 1 次,5min 4 次用 3% BSA30mL 依照稀释 HRP 标记的抗山羊和抗鼠二抗, 将膜在室温条件下孵育 1h PBS 漂洗 15min 1 次,5min 4 次配置好发光显色液后显色 1min, 用胶片曝光并采集图片免疫荧光检测 Frizled4 蛋白在毛囊和 JB6cl307b 细胞中的定位将小鼠皮片用 4% 多聚甲醛于 4 固定过夜, 然后用梯度酒精脱水二甲苯透明, 再浸蜡 4h 后包埋, 在石蜡切片机上将石蜡块制作成 5μm 的切片将制作好的石蜡切片放入二甲苯中脱蜡梯度酒精中水合, 随后微波修复 7min, 自然冷却后用 PBS 漂洗 5min 2 次,5% BSA 室温封闭 1.5h 后滴加一抗,4 孵育过夜, 然后用 PBS 漂洗 5min 5 次, 滴加 Cy3 标记的驴抗山羊荧光二抗后再用 DAPI 染色 7min, 然后用 PBS 漂洗 5min 5 次后用抗荧光淬灭剂封片, 最后在荧光显微镜下采集图片取对数生长期细胞, 调整密度为 /ml, 制备细胞爬片常规培养 24h 后, 用 4% 多聚甲醛室温固定 10min,PBS 洗

633 涤 3 次, 加 0.1% 的 Triton 孵育 5min,PBS 漂洗 5min 3 次, 3% BSA 封闭 30min, 加 Frizled4 抗体 (1 100),4 过夜次日,PBS 洗 3 次, 加入驴抗山羊红色荧光二抗, 室温孵育 1h, PBS 漂洗 5min 3 次,DAPI 染核 30min,PBS 漂洗 5min 3 次, 封片, 荧光显微镜下观察 1.3.5

) 将 96 孔板置于 37 5% CO 2 培养箱在培养 24h 后, 每孔加入 5mg/mLMTT 试剂 20μL 继续培养 4h, 用移液器小心吸除上清液, 每孔加入二甲基亚砜 150μL, 放于摇床上震荡 15min 后, 用酶标仪 ( 波长 490nm) 测每孔光密度值 1.4 统计学分析采用 SPSS16.

05) 等到静止期, 其表达水平与退化期的表达水平相比, 明显降低 (P<0.05) RTPCR 检测结果显示 ( 图 1B): 与实时定量 PCR 检测的结果保持相同的趋势,Frizled4mRNA 高表达于生长期, 在退化期表达降低, 在静止期表达最低!"#$ % & '$% & A: 实时定量 PCR 检测结果 ;a:p<0.05, 与 P8d 比较 ;b:p<0.

3 633 涤 3 次, 加 0.1% 的 Triton 孵育 5min,PBS 漂洗 5min 3 次, 3% BSA 封闭 30min, 加 Frizled4 抗体 (1 100),4 过夜次日,PBS 洗 3 次, 加入驴抗山羊红色荧光二抗, 室温孵育 1h, PBS 漂洗 5min 3 次,DAPI 染核 30min,PBS 漂洗 5min 3 次, 封片, 荧光显微镜下观察 MTT 法检测抗 Frizled4 抗体处理 JB6cl307b 细胞后的增殖情况将小鼠皮肤上皮细胞 JB6cl307b 用含 10% 的胎牛血清高糖 DMEM 培养基培养选对数生长期的细胞以 /ml 的细胞密度铺板待细胞贴壁后 24h, 分别加入终浓度为 20μg/mL 同型 IgG 抗体和 μg/mL 抗 Frizled4 抗体, 另设调零组 ( 只加培养液 ) 将 96 孔板置于 37 5% CO 2 培养箱在培养 24h 后, 每孔加入 5mg/mLMTT 试剂 20μL 继续培养 4h, 用移液器小心吸除上清液, 每孔加入二甲基亚砜 150μL, 放于摇床上震荡 15min 后, 用酶标仪 ( 波长 490nm) 测每孔光密度值 1.4 统计学分析采用 SPSS16.0 统计软件对数据进行单因素方差分析, 计量资料以 x±s 珋表示 2 结果 2.1 Frizled4mRNA 在小鼠毛囊周期背部皮肤中的表达实时定量 PCR 检测结果显示 ( 图 1A):Frizled4mRNA 高表达于毛囊生长期早期和中期的小鼠背皮中, 早期和中期的表达水平之间并无显著性差异而在退化期 Frizled4mRNA 的表达明显下调 (P<0.05) 等到静止期, 其表达水平与退化期的表达水平相比, 明显降低 (P<0.05) RTPCR 检测结果显示 ( 图 1B): 与实时定量 PCR 检测的结果保持相同的趋势,Frizled4mRNA 高表达于生长期, 在退化期表达降低, 在静止期表达最低!"#$ % & '$% & A: 实时定量 PCR 检测结果 ;a:p<0.05, 与 P8d 比较 ;b:p<0.05, 与 P16d 比较 ;B:RTPCR 检测结果图 1 实时定量 PCR 和 RTPCR 检测 Frizzled4mRNA 在小鼠毛囊周期背部皮肤中的表达 2.2 Frizled4 蛋白在小鼠毛囊周期背部皮肤中的表达 Westernblot 结果显示 ( 图 2):Frizled4 蛋白在小鼠出生后第 1 天的背部皮肤中表达就较明显, 在第 3 天 Frizled4 蛋白表达明显上调 (P<0.05), 与 P3d 相比,P8d 小鼠背部皮肤中 Friz zled4 蛋白的表达继续上调 (P<0.05) 随后在退化期,Friz zled4 蛋白表达下调显著 (P<0.05), 等到毛囊进入静止期, 小鼠背部皮肤中 Frizled4 蛋白表达微弱, 明显低于 P1d P3d P8d P16d(P<0.05)! ' "# "$ "! "% " " "& " #! & #! & A:Westernblot 检测结果 ;B: 相对光密度值 ;a:p<0.05, 与 P1d 比较 ;b:p<0.05, 与 P3d 比较 ;c:p<0.05, 与 P8d 比较 ;d:p<0.05, 与 P16d 比较图 2 Westernblot 检测 Frizzled4 蛋白在小鼠毛囊周期背部皮肤中的表达 2.3 Frizled4 蛋白在小鼠毛囊周期毛囊中的定位免疫荧光结果显示 ( 图 3):Frizled4 蛋白膜表达在毛囊生长期 (P1d,P3d,P8d) 以及毛囊退化期 (P16d) 的毛囊中, 在静止期没有检测到明显的 Frizled4 蛋白表达毛囊生长期早期 (P1d),Frizled4 蛋白定位在 Bulge 毛囊外根鞘及毛球外侧随着毛囊的继续生长, 在 P3d,Frizled4 蛋白在 Bulge 毛囊外根鞘内根鞘 precortex 毛球外侧的部分细胞中表达在 P8d, Frizled4 蛋白在毛囊中的表达部位又发生了一定变化, 主要集中在外根鞘上段及内根鞘随着毛囊进入退化期 (P16d),Friz zled4 蛋白主要定位于 Bugle, 在毛囊外根鞘上段内根鞘内可见少量 Frizled4 的表达而在静止期, 少量 Frizled4 阳性细胞出现在毛囊 Bulge 2.4 Frizled4 蛋白调控小鼠皮肤上皮细胞 JB6cl307b 的增殖为了进一步探讨 Frizled4 蛋白在小鼠毛囊中的功能, 以小鼠皮肤上皮细胞 JB6cl307b 作为研究对象, 我们首先利用免疫荧光技术检测了 Frizled4 蛋白在 JB6cl307b 中的表达情况, 结果显示 Frizled4 蛋白表达于细胞膜上接着在 JB6cl307b 细胞中分别加入 5 10μg/mL 和 20μg/mL 的 Frizled4 抗体, 以相同浓度的同型 IgG 作为实验对照,24h 后利用 MTT 检测光密度值, 结果发现与对照组相比,5μg/mL 抗 Frizled4 抗体处理的细胞光密度值没有显著变化, 而 10μg/mL 抗 Frizled4 抗体处理后光密度值明显降低 (P<0.05) 随着抗 Frizled4 抗体的浓度增加到 20μg/mL, 细胞的光密度值降到最低 (P<0.05) 结果表明抗 Frizled4 抗体促使 JB6cl307b 细胞增殖能力降低, 且随着抗 Frizled4 抗体浓度的增加,JB6cl307b 细胞增殖的抑制更加明显见图 4 5

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２ " # ＡＦｒＢＤＡＰＩＣＦｒ与ＤＡＰＩ合并图荧光检测Ｆｒ蛋白在ＪＢ６ＣＬ３７Ｂ细胞中的表达!"#$ ３讨论!"#!!!#(!"!"%$

4 第３６卷第７期２１年月１５日６３第 +0' +12 +/32 +4/2 -&".& )*+,!"#$$%&'( +/' Ｖｏ３６Ｎｏ７Ａｐｒ１５２１三军医大学学报ＪＴｈｒＭＭＵｎｖ箭头示阳性结果图３免疫荧光检测Ｆｒ蛋白在小鼠毛囊周期毛囊中的定位! ２ " # ＡＦｒＢＤＡＰＩＣＦｒ与ＤＡＰＩ合并图荧光检测Ｆｒ蛋白在ＪＢ６ＣＬ３７Ｂ细胞中的表达!"#$ ３讨论!"#!!!#(!"!"%$!"%! Ｆｒ作为Ｆｒ家族蛋白中的一员是一类Ｇ蛋白偶联受体目前已知有１个Ｆｒ蛋白作为Ｗｎｔ信号通路中的受体影响细胞极性胚胎发育细 -!"&$!"&!!"'$!"'!.!"!$! #$% $!)*+, '!!)*+, &!!)*+, &'% ａＰ５与对照组和５μｇｍｌ处理组比较ｂＰ５与对照组５１μｇｍｌ处理组比较图５ＭＴＴ检测不同浓度的抗Ｆｒ抗体干扰后ＪＢ６ＣＬ３７Ｂ细胞的增殖胞增殖和分化等功能Ｗｎｔ信号通路是毛囊生长主调控信号之一同样其受体Ｆｒ蛋白在毛囊中也发挥着重要作用已有研究发现Ｆｒ１２３５６７１在毛囊生长期中表达１１２但对其在毛囊周期中的变化未做进一步研究而且Ｆｒ７介导的Ｗｎｔ信号还参与活化毛囊干细胞但目前对于Ｆｒ在毛囊周期中的表达及功能尚未见报道先前的研究发现果蝇中Ｗｎｔ８结合Ｆｒ激活下游信号参与２ｂ与Ｆｒ调控内耳和视网膜的血管发育１３Ｗｎｔ

5 635 共同激活在虹膜的背侧, 决定背侧玻璃体的形成 [5] 由此提示毛囊中 Wnt 信号通路也可能通过 Frizled4 发挥重要作用由此我们利用实时定量 PCR Western blot 和免疫荧光技术, 发现 Frizled4 确实在毛囊中表达, 其表达呈现出时空特异性在毛囊生长早期, 位于次级毛芽的毛囊干细胞受到来自 DP 的包括 Wnt 在内的信号的刺激首先被激活 [14], 在不断增殖的同时开始分化并向下迁移形成毛芽, 此时 Frizled4mRNA 和蛋白表达开始上调, 并且定位于毛囊外根鞘和毛球部外侧, 说明 Frizled4 可能与毛囊干细胞活化相关随着毛囊的继续生长, 出现毛母质, 在此毛囊细胞开始分化形成内根鞘和毛干 [15], Frizled4mRNA 和蛋白表达继续上调, 表达范围开始扩大, 定位于毛囊干细胞巢 Bulge 外根鞘内根鞘 precortex, 但毛球部外侧只有部分细胞表达 Frizled4, 提示 Frizled4 不仅与毛囊干细胞活化相关还参与了毛囊的分化等到毛囊形态发育完整, 毛囊进入生长期,Frizled4mRNA 和蛋白表达最强, 表达于 Bulge 外根鞘上段内根鞘以及 precortex, 未见于毛球部综合 Frizled4 在毛囊生长期的毛球部的表达情况, 提示 Frizled4 随着毛囊发育完成而表达降低, 且局限于毛囊干细胞的部位毛囊 Bulge 及外根鞘上段, 进一步表明 Frizled4 可能参与毛囊干细胞活性的控制, 以及毛囊的分化之后 Bulge 下段的大部分毛囊角质形成细胞发生凋亡 [9], 此时 Frizled4mRNA 和蛋白表达明显降低, 主要表达于 Bulge 外根鞘上段部分内根鞘最后凋亡剩下的少许细胞回到 Bulge [9], 毛囊进入静止期, 此时 Frizled4mRNA 和蛋白的表达最低, 主要在毛囊 Bulge 处这些结果提示 Frizled4 的表达伴随着毛囊的生长而增强, 退化而降低, 可能参与调控毛囊干细胞的活化以及毛囊的分化以 JB6cl307b 细胞为体外研究模型, 检测到 Frizled4 表达在细胞膜上, 这与在体实验的结果相一致随后利用抗 Friz zled4 抗体拮抗 Frizled4 蛋白发挥作用后,JB6cl307b 细胞的增殖明显被抑制, 且这种抑制表现出浓度依赖的方式体外实验的结果进一步表明 Frizled4 调控毛囊细胞的增殖综上所述,Frizled4 在毛囊周期中的表达具有时空特异性, 其分布和表达强度与毛囊周期密切相关, 尤其是在生长期表达最强,Frizled4 在细胞水平被拮抗后增殖得到明显抑制, 因此 Frizled4 在调控毛囊生长过程中参与调控毛囊增殖而对于 Frizled4 调控毛囊增殖及分化的具体机制, 仍需要进一步研究参考文献 : [1] HawrylukEB,EnglishJC3rd.Femaleadolescenthairdisorders[J]. JPediatrAdolescGynecol,2009,22(4): [2] UnluhizarciK,KaracaZ,KelestimurF.Hirsutism fromdiagnosisto useofantiandrogens[j].fronthormres,2013,40: [3] GrachtchoukM,PeroJ,YangSH,etal.Basalcelcarcinomasin micearisefromhairfoliclestemcelsandmultipleepithelialprogenitor populations[j].jclininvest,2011,121(5): [4] MyungPS,TakeoM,ItoM,etal.EpithelialWntligandsecretionis requiredforadulthairfoliclegrowthandregeneration[j].jinvest Dermatol,2013,133(1): [5]OhtaK,ItoA,KuriyamaS,etal.TsukushifunctionsasaWntsigna linginhibitorbycompetingwithwnt2bforbindingtotransmembrane proteinfrizled4[j].procnatlacadsciusa,2011,108(36): [6]KerGE,YoungJC,HorvayK,etal.Regulatedwnt/betacatenin signalingsustainsadultspermatogenesisinmice[j].biolreprod, 2014,90(1):3. [7] HsiehM,Boerboom D,ShimadaM,etal.MicenulforFrizled4 (Fzd4-/-)areinfertileandexhibitimpairedcorporaluteaformation andfunction[j].biolreprod,2005,73(6): [8]DescampsB,SewduthR,FereiraTojaisN,etal.Frizled4regulates arterialnetworkorganizationthroughnoncanonicalwnt/planarcelpo laritysignaling[j].circres,2012,110(1): [9] 赖向东, 白秀峰, 余裕, 等. 毛囊周期性中肿瘤坏死因子受体 1 的表达 [J].,2013,35(14): [10] ReddyST,AndlT,LuM M,etal.ExpresionofFrizledgenesin developingandpostnatalhairfolicles[j].jinvestdermatol,2004, 123(2): [11] HungBS,WangXQ,CamGR,etal.Characterizationofmouse Frizled3expresioninhairfolicledevelopmentandidentificationof thehumanhomologinkeratinocytes[j].jinvestdermatol,2001, 116(6): [12]KandybaE,LeungY,ChenYB,etal.Competitivebalanceofintra bulgebmp/wntsignalingrevealsarobustgenenetworkrulingstem celhomeostasisandcyclicactivation[j].procnatlacadsciusa, 2013,110(4): [13] SmalwoodPM,WiliamsJ,XuQ,etal.Mutationalanalysisof NorinFrizled4recognition[J].JBiolChem,2007,282(6): [14]EnshelSeijfersD,LindonC,KashiwagiM,etal.betacateninac tivityinthedermalpapilaregulatesmorphogenesisandregenerationof hair[j].devcel,2010,18(4): [15] 石家仲, 杨恬, 雷明星, 等.gasdermin3 在小鼠同步化毛囊周期中的表达 [J].,2011,33(5): ( 收稿 : ; 修回 : ) ( 编辑邓强庭 )

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生物技术通报材料方法生物技术通报高曰文朱耀明王艳林朱晨宇秦烨胡汉卿韩钰旨在探讨盐酸普鲁卡因对人结肠癌细胞基因甲基化及表达的影响应用巢式双重甲基化特异性聚合酶链反应检测盐酸普鲁卡因处理前后细胞中基因启动子的甲基化水平逆转录聚合酶链反应和蛋白印迹技术观察细胞内基因表达情况检测发现人结肠癌细胞中基因存在甲基化经盐酸普鲁卡因处理能够使基因甲基化水平下降和蛋白印迹分析结果显