12 期闵洁, 等 : 鲁氏耶尔森菌 invf 基因无痕缺失突变株的构建及生物学特性 1859 icity island) 的形式成簇存在于细菌的染色体或质粒上 Inv 是 T3SS 中编码侵袭蛋白 (INV) 的基因簇, 包含 inva invb invc inve invf invg inv

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勤庾
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1 第 41 卷第 12 期水产学报 Vol. 41, No 年 12 月 JOURNAL OF FISHERIES OF CHINA Dec., 2017 文章编号 : (2017) DOI: /jfc 鲁氏耶尔森菌 invf 基因无痕缺失突变株的构建及生物学特性闵洁 1, 汪开毓 1,2*, 刘韬 1, 贺扬 1, 胡伟 1 1, 罗梦笛 (1. 四川农业大学动物医学院, 四川成都 ; 2. 四川农业大学动物疾病与人类健康四川省重点实验室, 四川成都 ) 摘要 : 鲁氏耶尔森菌是一种具有广泛致病性的条件致病肠杆菌三型分泌系统 (T3SS) 是该菌的重要毒力系统, 其中 invf 基因是 T3SS 功能表达的重要调控因子为探讨 invf 和 T3SS 对 Y. ruckeri 致病作用的影响, 本研究构建了 Y. ruckeri SC09 株 invf 基因的无痕缺失株, 并对其生物学特性进行研究通过融合 PCR 方法, 将 invf 基因的上下游片段 A C 融合, 构建同源臂 AC; 将获得的同源臂 AC 连接入自杀质粒 plp12, 构建 plp12-invf 同源重组载体 ;plp12-invf 电转化进入供体菌株大肠杆菌 β2163, 并利用接合转移方法转入受体菌株 Y. ruckeri SC09, 利用抗生素正向筛选和 vmt 反向筛选分别对插入突变株和缺失突变株进行筛选, 并利用 PCR 技术和序列测定对 Y. ruckeri invf 缺失株进行鉴定 ; 对突变株和野生株进行菌体菌落形态观察生化特性鉴定和生长曲线测定结果显示, 融合 PCR AC 片段经氯霉素抗性正向筛选和 vmt 反向筛选,PCR 鉴定和测序鉴定后, 成功获得了 Y. ruckeri SC09 invf 基因的无痕缺失突变株, 突变株和野生株菌体菌落形态和生化特性基本一致, 突变株菌落较野生株小, 各个时期突变株的生长浓度较野生株低研究表明, 采用自杀质粒 plp12 和大肠杆菌 β2163 接合转移系统, 利用抗生素正向筛选和 vmt 反向筛选技术, 在对其基本生物学特性无显著影响的情况下, 可简捷高效地获得 invf 基因的无痕缺失突变株关键词 : 鲁氏耶尔森菌 ; 三型分泌系统 ;invf 基因 ; 无痕突变 ; 生物学特性中图分类号 : S 文献标志码 : A 鲁氏耶尔森菌 (Yersinia ruckeri) 隶属于肠杆菌科 (Enterobacteriaceae) 耶尔森菌属 (Yersinia), 是无荚膜无芽孢两端纯圆的革兰氏阴性短杆菌 [1] 它是一种危害世界水产养殖业的条件致病菌, 广泛分布于北美南非澳大利亚以及欧洲 [2] 该菌可引起多种水生动物疾病的暴发, 易感动物由鲑鳟类扩大至鲙科 (Ictaluridae) 鲤科(Cypri- nidae) 以及对虾等 [3-5] 该菌常引起鲑鳟发生肠炎红嘴病 (enteric redmouth,erm), 其主要症状为肠道急性炎症反应体表出血, 后期全身性败血症背部皮肤发黑口部严重溃疡及出血等 [6] ; 患病斑点叉尾鲙 (Ietalurus punetaus) 鲢(Hypoph- thalmichthys molitrix) 鳙(Aristichthys nobilis) 则主要以体表充出血为特征, 尤其是在眼眶嘴腹部体表两侧有大量针尖状出血点 [3-4] ; 患病对虾体色加深, 甲壳及肌肉柔软, 血淋巴在体外呈淡蓝色, 绝大多数不凝固 [5] 鲁氏耶尔森菌的主要毒力因子包括细胞外毒素铁载体系统 [7] 三型分泌系统 (T3SS) [8] 四 [9] 型分泌系统等其中,T3SS 是由 20 种以上的蛋白质构成的高度保守的复杂分泌装置, 普遍存在于革兰氏阴性菌中, 是细菌重要的毒力系统, 在细菌感染宿主细胞时能向宿主细胞内靶向转运效应蛋白, 并抑制和调控宿主的天然免疫反应以利于细菌胞内感染和寄生 [10] 编码 T3SS 的基因片段较大, 常常以毒力岛 (pathogen- 收稿日期 : 修回日期 : 资助项目 : 四川农业大学创新性实验计划 ( ) 通信作者 : 汪开毓, kywangsicau@126.com

2 12 期闵洁, 等 : 鲁氏耶尔森菌 invf 基因无痕缺失突变株的构建及生物学特性 1859 icity island) 的形式成簇存在于细菌的染色体或质粒上 Inv 是 T3SS 中编码侵袭蛋白 (INV) 的基因簇, 包含 inva invb invc inve invf invg invi invj 等多种基因, 其中 invf 基因 (invasion protein F) 是 inv 基因簇中的第一个基因, 属于转录激活子 AraC 家族 [8,11-12] invf 基因是沙门氏菌中 T3SS 的核心调控基因, 所表达的蛋白参与了沙门氏菌对宿主的入侵 [13] [8] Liu 等研究表明鲁氏耶尔森菌毒力岛编码的 T3SS 与沙门氏菌的毒力岛 (SPI1) 编码的 T3SS 具有广泛的序列相似性, 且鲁氏耶尔森菌的 T3SS 和沙门氏菌的 SPI1-T3SS 属于系统发育树的相同分支, 同时推测鲁氏耶尔森菌的 invf 基因在该菌中也是 T3SS 的核心调控基 [14] 因 ; 陈俊等研究表明敲除沙门氏菌 T3SS 编码基因 SPI1, 可使该菌的侵袭能力降低倍 ; 目前, 鲁氏耶尔森菌致病机制的研究较少, 关于其 T3SS 和 invf 的研究尚处于空白因此, 本实验探索了 invf 基因缺失株的构建方法, 利用同源重组原理融合 PCR 方法和结合转移技术成功构建了鲁氏耶尔森菌无痕 invf 缺失株, 并对野生株与缺失株的生物学特性进行了基础研究, 旨在为进一步研究 invf 基因在鲁氏耶尔森菌致病过程中的作用奠定基础, 并为鲁氏耶尔森菌减毒疫苗的开发提供新思路 1 材料与方法 1.1 实验材料菌株 / 载体 plp12 和大肠杆菌 β2163 购于广州迈博生物科技有限公司 ; 鲁氏耶尔森菌野毒株 (Y. ruckeri SC09 株 ) 由四川农业大学鱼病研究中心分离鉴定和保存 ;DH 5α λpir 感受态细胞购自天根生化科技 ( 北京 ) 有限公司主要试剂 2 PrimSTAT Max Premix 琼脂糖胶回收试剂盒和 DNA Marker 均购于 TaKaRa 公司 ; 胰蛋白胨酵母提取物购于英国 OXOID 公司 ;L- 阿拉伯糖 2, 6 - 二氨基庚二酸 (DAP) 购于 SIGMA 公司 ; 氯霉素质粒 DNA 小量提取试剂盒购于生工生物工程 ( 上海 ) 股份有限公司 ;2 Taq Master Mix Goldview 细菌基因组提取试剂盒琼脂糖均购于天根生化科技 ( 北京 ) 有限公司 ;T 4 -DNA 连接酶购于德国 Thermo 公司 ; PCR 产物纯化试剂盒购于宁波市重鼎生物技术有限公司 ; 细菌生化微量鉴定管购于杭州生物科技有限公司 1.2 实验方法引物设计根据 GenBank 中鲁氏耶尔森菌 ( 登录号 :JRWX )invF 基因序列, 设计 invf 的上下游同源臂的引物 invf-mf1/mr1( 上游,A) 和 invf-mf2/mr2( 下游,C), 并根据 invf 上下游基因设计 invf-tf/tr 用于缺失检测, 同时设计质粒引物 plp-uf/ur 用于构建重组载体检测 ( 表 1) 鲁氏耶尔森菌的培养及基因组 DNA 提取按照无菌操作要求, 将低温保存的鲁氏耶尔森菌划线接种于 LB 固体培养基,28 C 恒温培养引物 primer 表 1 本研究所用引物及序列 Tab. 1 All the primers involved in this study 引物序列 (5-3 ) sequence 产物 /bp product size invf-mf1 CTACGACGATCTGGCAGAAG 463 invf-mr1 CGAGCAGTACCCACAGCTCAGTAGCGTTGGAAGATACTCTTCA invf-mf2 TGAAGAGTATCTTCCAACGCTACTGAGCTGTGGGTACTGCTCG 432 invf-mr2 ACCAGACTAATGCGGTACGA invf-tf GTACTCACCTTCATCAGTCGG 2/1623 invf-tr CGAGTGCTGATTAGCTGGTTC plp-uf CGACACAGTTGTAACTGGTCC 1327 plp-ur CAGGAACACTTAACGGCTGAC 注 :invf-mf1/mr1 扩增上游同源臂 A;invF-MF2/MR2 扩增下游同源臂 C;invF-TF/TR 用于缺失检测, 缺失突变株为 2 bp, 野生株为 1623 bp;plp-uf/ur 用于构建重组载体检测 Notes: primer invf-mf1/mr1 amplify the upstream homologous arm A; primer invf-mf2/mr2 amplify downstream homologous arm C; PCRs using primer invf-tf/tr to test deletion mutants (2 bp) and wild type (1623 bp); primer plp-uf/ur use to test recombination plasmid

3 1860 水产学报 41 卷 24 h 后, 挑取单个菌落接种于 LB 液体培养基,28 C 静置培养 24 h 菌液经革兰氏染色验纯后, 取 1 ml 培养菌液按照天根细菌 DNA 提取试剂盒提取基因组 DNA 融合 PCR 构建同源臂分别以 invf-mf1/ invf-mr1 和 invf-mf2/invf-mr2 为引物, 以鲁氏耶尔森菌 DNA 为模板进行 PCR 扩增 PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳后, 利用胶回收试剂盒对 PCR 产物进行回收纯化, 获得 invf 上游和下游同源臂 (A C 片段 ) 将 A C 片段按体积比 1 1 混合后作为模板, 以 invf-mf1/invf-mr2 为引物, 进行融合 PCR 扩增产物经琼脂糖凝胶, 利用胶回收试剂盒进行纯化获得 AC 融合片段以 AC 片段为模板,invF-MF1/invF-MR2 为引物, 用 Taq 酶进行 PCR 扩增, 电泳后, 用胶回收试剂盒对 PCR 产物进行纯化, 获得用于 T 克隆的 AC 片段 plp12-invf 自杀载体构建转化及鉴定利用 T 4 DNA 连接酶将 AC 片段与自杀 T 载体 plp12 连接, 连接产物转入 DH 5α λpir 感受态细胞, 转化后的细胞涂布于 Cm-LB 平板 ( 氯霉素,chloramphenicol,Cm=20 μg/ml), 培养至清晰的单菌落挑取单个菌落, 以 plp-uf/plp-ur 为引物, 进行菌落 PCR 验证, 获得阳性克隆株 plp12-invf- DH 5α λ pir 将鉴定正确的克隆 plp12-invf-dh 5α λpir 扩大培养, 并用质粒微量提取试剂盒提取质粒 plp12-invf, 20 C 保存备用大肠杆菌 β2163 感受态的制备将大肠杆菌 β2163 接种于 0.3% DAP-LB 平板 ( 二氨基庚二酸,diaminopimelic acid,dap),37 C 过夜培养后挑取单菌落接种到 0.3% DAP-LB 液体培养基中振荡培养至 OD 600 =0.5; 将菌液置于冰上冷却 10 min 后, 取 1 ml 菌液,7000 r/min,4 C 离心 5 min, 弃上清液, 加入 1 ml 15 % 灭菌甘油洗涤 3 次, 并用 0.6 ml 相同溶液重悬菌体 plp12-invf-β2163 的构建利用电转化法将 plp12-invf 电转化入上述制备的 β2163 感受态细胞将 plp12-invf 和 β2163 感受态细胞分别冰浴 10 min 后, 取 2 μl plp12-invf, 加入 μl 大肠杆菌 β2163 感受态细胞中, 混匀, 于冰上继续放置 10 min, 同时将直径 2 mm 的电转杯冰上预冷 ; 将所有液体转入电转杯中进行电转化 ( 电转化条件 :1.8 kv/cm,200 Ω,25 μf), 电转完成后迅速加入 1 ml 37 C 预热的 DAP-LB 培养液,37 C 复苏培养 l h; 取复苏菌液 μl 均匀涂布在含有 20 μg/ml Cm 的 DAP-LB 平板上,37 C 过夜培养经抗生素压力筛选, 获得阳性菌株, 命名为 plp12-invf-β2163 插入突变株构建及鉴定将 plp12-invfβ2163 与鲁氏耶尔森菌野生株分别过夜培养后, 各取 μl 菌液混合, 离心弃上清液, 收集菌体经 LB 洗涤 1 次后加入 10 μl 新鲜 LB 重悬, 并立即涂布 DAP-LB 平板, 置于 30 C 培养 8 h 用 1 ml LB 洗板, 取 μl 涂布于新的 Cm-LB 平板挑取平板上的单个菌株, 以 invf-mf1/invf-mr2 为引物进行菌落 PCR 鉴定将阳性菌株命名为 plp12- invf-sc09 缺失突变株构建及鉴定将 plp12-invf- SC09 接种于 LB 液体培养基振荡培养 2 h, 取 μl 菌液涂布于含有 0.02% L- 阿拉伯糖的 LB 平板,37 C 过夜培养 ; 挑取平板上长出的单个菌株, 扩大培养后提取基因组 DNA, 以 invf-tf/invf-tr 为引物进行 PCR 鉴定, 并将 PCR 产物送至上海立菲生物技术有限公司测序将鉴定正确的无痕突变株保种于 LB 肉汤 +30 % 甘油, 并置于 20 C 冰箱中菌体菌落形态观察挑取 plp12-invf-sc09 与鲁氏耶尔森菌 SC09 单菌落接种于 LB 液体培养基,37 C 静置培养至 OD 600 =0.6; 对突变株和野生株进行革兰氏染色, 并在油镜下观察比较菌体形态 ; 将 OD 600 =0.6 突变株和野生株接种于 LB 平板上,28 C 培养 24 h, 观察比较菌落形态 plp12-invf-sc09 生化特性鉴定挑取 plp12-invf-sc09 与鲁氏耶尔森菌 SC09 单菌落转接于阿拉伯糖硫化氢赖氨酸脱羧酶鸟氨酸脱羧酶蜜二糖蔗糖葡萄糖半乳糖甘露醇肌醇等生化鉴定管,37 C 过夜, 观察生化鉴定结果 plp12-invf-sc09 生长曲线的测定将 37 C 静置培养至 OD 600 =0.8 的 plp12-invf-sc09 与鲁氏耶尔森菌 SC09 菌液, 分别按 1 0 接种于 LB 液体培养基, 每隔 4 h 取培养物 150 μl 加入 96 孔板中, 测其 OD 600 值, 重复 8 次, 并绘制其生长曲线 2 结果 2.1 基因敲除同源臂的构建以鲁氏耶尔森菌野生型 (SC09) 基因组 DNA 为模板, 以 invf-mf1/mr1 和 invf-mf2/mr2 为引物, 扩增获得了 invf 上游同源臂 A 片段下游同

12 期闵洁, 等 : 鲁氏耶尔森菌 invf 基因无痕缺失突变株的构建及生物学特性 1861 源臂 C 片段, 产物大小均为 400 bp 左右 ( 图 1-a) 以 A C 片段为模板,invF-MF1/invF-MR2 为引物, 进行两步融合 PCR 扩增得到片段大小为约 800 bp 的 AC 融合条带 ( 图 1-b), 获得了基因敲除同源臂 2.

( 图 1-c), 表明 plp12-invf 质粒成功转化入大肠杆菌 DH 5α λ pir 中鉴定正确的阳性菌株命名为 plp12-invf-dh 5α λ pir 将 plp12-invf 电转化入大肠杆菌 β2163 后, 抗性平板初筛得到抗 Cm 的阳性菌株分别以 Cm 阳性菌株和野生菌株为模板,invF-MF1/invF- MR2 为引物进行 PCR

标准物质 ;b. 融合 PCR 合成的基因敲除目的片段 AC, 泳道 1. 同源臂 AC,M. 标准物质 ;c. plp12-invf 质粒构建鉴定结果, 泳道 1~6. 以 plp-uf/ur 为引物进行 plp12-invf 的 PCR 检测,1 3 为阳性,M. 标准物质 ;d.

result of recombination plasmid plp12-invf construction by PCR amplification, line 1-6.

4 12 期闵洁, 等 : 鲁氏耶尔森菌 invf 基因无痕缺失突变株的构建及生物学特性 1861 源臂 C 片段, 产物大小均为 400 bp 左右 ( 图 1-a) 以 A C 片段为模板,invF-MF1/invF-MR2 为引物, 进行两步融合 PCR 扩增得到片段大小为约 800 bp 的 AC 融合条带 ( 图 1-b), 获得了基因敲除同源臂 2.2 敲除载体 plp12-invf-dh 5α λ pir 的构建与鉴定 AC 融合产物经琼脂糖凝胶电泳胶回收后, 与自杀 T 载体 plp12 连接, 后转化入大肠杆菌 DH 5α λ pir 感受态细胞, 经 Cm-LB 选择培养获得 Cm 抗性菌株以该菌株为模板,pLP-UF/pLP- UR 为引物进行 PCR 鉴定, 得到约 1300 bp 的 PCR 产物 ( 图 1-c), 表明 plp12-invf 质粒成功转化入大肠杆菌 DH 5α λ pir 中鉴定正确的阳性菌株命名为 plp12-invf-dh 5α λ pir 将 plp12-invf 电转化入大肠杆菌 β2163 后, 抗性平板初筛得到抗 Cm 的阳性菌株分别以 Cm 阳性菌株和野生菌株为模板,invF-MF1/invF- MR2 为引物进行 PCR 鉴定, 结果显示, 野生株仅 bp M 1 2 M 1 M bp bp 0 a 0 b 0 c bp M bp M d 0 e 图 1 构建鲁氏耶尔森菌 invf 基因无痕缺失突变株的相关电泳图 a. 扩增的上下游同源臂 A C, 泳道 1. 上游同源臂 A, 泳道 2. 下游同源臂 B,M. 标准物质 ;b. 融合 PCR 合成的基因敲除目的片段 AC, 泳道 1. 同源臂 AC,M. 标准物质 ;c. plp12-invf 质粒构建鉴定结果, 泳道 1~6. 以 plp-uf/ur 为引物进行 plp12-invf 的 PCR 检测,1 3 为阳性,M. 标准物质 ;d. 以引物 invf-mf1/invf-mr2 进行的 PCR 插入突变检测结果, 泳道 1~7. 插入突变型, 泳道 8. 野生型 ( 对照 ), M. 标准物质 ;e. 以引物 invf-tf/invf-tr 进行的 PCR 缺失突变检测结果, 泳道 1 2. 缺失突变株, 泳道 3. 阴性对照, 泳道 4. 野生株, M. 标准物质 Fig. 1 Electrophoretic profile of construction of invf gene deleted Y. ruckeri a. upstream and downstream homologous arms, line 1. upstream homologous arm A, line 2. downstream homologous arm C, M. marker ; b gene knock-out target fragment synthetized by fusion PCR, line 1. homologous arm AC, M. marker ; c. result of recombination plasmid plp12-invf construction by PCR amplification, line 1-6. PCR s using primers plp-uf/ur to test plp12-invf, the results of line 1 and 3 were positive, M: marker ; d. PCR s using primers invf-mf1/invf-mr2 to test insertional mutants and wild type, line 1-7. insertion mutants, line 8. wild type; M. marker ; e. PCRs using primers invf-tf/invf-tr to test deletion mutants and wild type, line 1, 2. deletion mutants, line 3. negative control, line 4. wild type, M. marker

水 1862 产学报 41 卷扩增得到一条大小约为1 bp的目的条带而形态进行观察野生株(图3-a)和突变株(图3-b)都 Cm阳性菌株得到2条特异性扩增条带大小分别呈短杆状或卵圆形革兰氏阴性突变株和野为 1和 800 bp 表明 plp12-invf成功插入了生株在LB平板上28 C 培养24 h 二者都生长良 Y.

02 % 的L-阿拉伯糖的有光泽的圆形乳白色菌落但野生株(图4-a)长出 LB培养基上筛选缺失突变株以长出的单菌的菌落稍大于突变株(图4-b) 落为模板 invf-tf/invf-tr为引物进行 PCR检测结果显示缺失突变株 PCR产物大小约为 2.

硫化氢实验阴性鸟氨酸脱羧酶和 2.3 赖氨酸脱羧酶实验阳性(表2) 菌体菌落形态观察将对数生长期的细菌固定于载玻片上进行革兰氏染色后通过光学显微镜油镜对菌体 2.

5 水 1862 产学报 41 卷扩增得到一条大小约为1 bp的目的条带而形态进行观察野生株(图3-a)和突变株(图3-b)都 Cm阳性菌株得到2条特异性扩增条带大小分别呈短杆状或卵圆形革兰氏阴性突变株和野为 1和 800 bp 表明 plp12-invf成功插入了生株在LB平板上28 C 培养24 h 二者都生长良 Y. ruckeri SC09中(图1-d) 将鉴定正确的插入突变好均长出边缘整齐表面光滑稍微隆起株扩大培养后涂布在含0.02 % 的L-阿拉伯糖的有光泽的圆形乳白色菌落但野生株(图4-a)长出 LB培养基上筛选缺失突变株以长出的单菌的菌落稍大于突变株(图4-b) 落为模板 invf-tf/invf-tr为引物进行 PCR检测结果显示缺失突变株 PCR产物大小约为 2.4 plp12-invf-sc09 生化特性突变株与野生株表现出的生化特性无异 0 bp 而野生型菌株PCR产物大小约为1600 bp (图 1-e) 将缺失克隆株的 PCR产物测序鉴定发糖发酵实验中发酵葡萄糖半乳糖甘露现检测的序列与原始序列相比%相似与醇不发酵阿拉伯糖鼠李糖蜜二糖蔗预期结果一致(图2) 表明突变株确实够建成功糖肌醇硫化氢实验阴性鸟氨酸脱羧酶和 2.3 赖氨酸脱羧酶实验阳性(表2) 菌体菌落形态观察将对数生长期的细菌固定于载玻片上进行革兰氏染色后通过光学显微镜油镜对菌体 2.5 plp12-invf-sc09 生长曲线突变株和野生株都符合细菌生长规律突 59 bp 80 bp 139 bp 160 bp 219 bp 240 bp 299 bp 320 bp 379 bp 400 bp 459 bp 480 bp 539 bp 560 bp 619 bp 640 bp 699 bp 720 bp 779 bp 800 bp 859 bp 880 bp 939 bp 960 bp 960 bp 1 bp 图2 以 invf-tf/invf-tr为引物的pcr产物的测序结果比对实线.上游同源臂A 虚线.下游同源臂C 蓝色.引物红色.测序的片段 Fig. 2 Comparison of PCR products of the invf-tf/invf-tr sequence with expected sequence Solid line. the upstream homologous arm A; dotted line. the downstream homologous arm C; blue. primers; red. detection sequence

12 期闵洁, 等 : 鲁氏耶尔森菌 invf 基因无痕缺失突变株的构建及生物学特性 1863 10 μm 10 μm (a) (b) 图 3 鲁氏耶尔森菌野生株 (a) 与缺失突变株 (b) 的革兰氏染色照片 (0 ) Fig. 3 Gram stain of wild type Y.

ruckeri (a) and deletion mutants (b) grown at LB plate 变株的迟缓期持续时间较野生株长, 对数期持续时间较野生株短, 各个时期的菌液浓度均低于野生株, 说明突变株的生长速率较野生株迟缓 ( 图 5) 3

限制了此技术在原核生物上的广泛运用同源重组技术是原核生物主要的敲除技术 Red 同源重组系统是目前常用的敲除技术, 该方法需要 3 种质粒协同提供外源 Red 重组所需要的 3 个蛋白, 同时对敲除菌株的种类具有一定的局限性利用自杀质粒进行同源重组的敲除技术是基因敲除中普

段同源区就可以定位, 使得载体构建更为便利大肠杆菌 β2163 具有高效的供体菌接合系 [18] 统, 接合转移率高, 且适用范围广 Luo 等采用该方法, 敲除率为 60% 左右本实验通过融合 PCR 方法将 invf 基因的上下游同源臂融合并转入到自杀质粒 plp12,

6 12 期闵洁, 等 : 鲁氏耶尔森菌 invf 基因无痕缺失突变株的构建及生物学特性 μm 10 μm (a) (b) 图 3 鲁氏耶尔森菌野生株 (a) 与缺失突变株 (b) 的革兰氏染色照片 (0 ) Fig. 3 Gram stain of wild type Y. ruckeri (a) and deletion mutants (b) (0 ) 1 cm 1 cm (a) (b) 图 4 鲁氏耶尔森菌野生株 (a) 与缺失突变株 (b) 在 LB 平板上生长的菌落 Fig. 4 Colonies of wild type Y. ruckeri (a) and deletion mutants (b) grown at LB plate 变株的迟缓期持续时间较野生株长, 对数期持续时间较野生株短, 各个时期的菌液浓度均低于野生株, 说明突变株的生长速率较野生株迟缓 ( 图 5) 3 讨论构建基因缺失株是研究基因功能的最有效手段基因敲除的方法有多种, 其中 CRISPR- Cas9 是一种全新的基因敲除手段, 具有制作简单成本低作用高效等优点 [15], 但由于大多数原核细胞缺乏非同源末端连接修复系统, 且人工进行同源重组时常有质粒残留 [16-17], 限制了此技术在原核生物上的广泛运用同源重组技术是原核生物主要的敲除技术 Red 同源重组系统是目前常用的敲除技术, 该方法需要 3 种质粒协同提供外源 Red 重组所需要的 3 个蛋白, 同时对敲除菌株的种类具有一定的局限性利用自杀质粒进行同源重组的敲除技术是基因敲除中普遍适用的敲除方法, 其中无痕敲除技术不仅可快速敲除目的基因, 而且可不引入任何外源片段, 避免了外源基因对缺失株的影响 plp12 自杀质粒可利用细菌体自身广泛存在的 RecBCD 系统对外源进入的 DNA 进行同源重组, 从而实现目标基因的等位替换, 只需要一段同源区就可以定位, 使得载体构建更为便利大肠杆菌 β2163 具有高效的供体菌接合系 [18] 统, 接合转移率高, 且适用范围广 Luo 等采用该方法, 敲除率为 60% 左右本实验通过融合 PCR 方法将 invf 基因的上下游同源臂融合并转入到自杀质粒 plp12, 构建了同源重组质粒 plp12-invf; 通过电转化将 plp12-invf 质粒转入大肠杆菌 β2163 获得受体菌株 β2163-plp12-invf; 受体菌株与供体菌株鲁氏耶尔森菌进行接合培养, 便捷且高效地获得了鲁氏耶尔森菌 invf 插入缺失株, 表明自杀质粒 plp12 和大肠杆菌 β2163 可协同高效介导鲁氏耶尔森菌的基因敲除

7 1864 水产学报 41 卷表 2 invf 基因缺失株生化鉴定结果 Tab. 2 The results of biochemical identification of 鉴定项目 identified items 阿拉伯糖 arabinose 鼠李糖 rhamnse 硫化氢 hydrogen sulfide 蜜二糖 melibiose 鸟氨酸脱羧酶 ornithine decarboxylase 葡萄糖 glucose 赖氨酸脱羧酶 lysine decarboxylase 肌醇 inositol 半乳糖 galactose 甘露醇 mannitol 蔗糖 sucrose invf gene deletion 缺失突变菌株野生菌株 deletion mutants wild type 注 : + 表示阳性反应, 表示阴性反应 Notes: + indicates a positive reaction, indicates a negative reaction OD/600nm wild type deletion mutants /h time 图 5 缺失突变株与野生型的生长曲线 Fig. 5 Grow rate curve of the deletion mutants and wild type Y. ruckeri 细菌基因敲除的筛选方法常采用的是正反向的筛选技术正向的筛选主要是利用质粒上的抗性基因作标记, 反向的筛选主要是利用 sacb 基因介导重组, 从而起到反向筛选的目的 [19] Zeng 等利用同源重组的方法, 用氯霉素抗性基因替换海豚链球菌 (Streptococcus iniae) 的 cpsj 基 [20] 因, 正向筛选得到了突变株 ΔcpsJ 潘文等利用反向筛选基因的 sacb 基因, 筛选出成功缺失 bp26 基因的布鲁氏菌弱毒疫苗 S19 株 S2 株 M5 株然而单纯的正向筛选会残留抗性基因, 从而限制了突变株作为疫苗在生产上的应用 ; 而利用 sacb 基因进行反向筛选时, 在第一次同源重组当中,sacB 基因多发生突变失活, 从而导致第一次同源重组的效率降低 [21] vmt 基因常替换 sacb 基因用于反向筛选, 由于 vmt 基因具有极大的细胞毒性, 在 L- 阿拉伯糖诱导条件下 vmt 表达, 使得二次重组失败的菌体死亡, 大大减少 [18] 第二次重组后缺失突变克隆筛选工作 Luo 等利用接合转移同源重组的方法, 通过 vmt 基因进行反向筛选, 成功构建了 4 种弧菌的基因突变株本研究构建鲁氏耶尔森菌 invf 基因缺失株时结合了正反向筛选技术第一轮使用抗生素 Cm 正向筛选 : 将 plp12-invf 质粒接合输入到靶细菌后, 由于自杀载体不能在绝大部分细菌中复制, 在抗生素选择压力下, 只有细菌基因组靶位点整合有自杀载体的插入突变株才可以存活在第二轮采用反向筛选基因 vmt, 将插入突变的克隆 LB 液体培养后涂布于含有 L 0.02%- 阿拉伯糖的 LB 平板, 使得第二次重组失败的含有 vmt 基因的菌体死亡, 而二次重组成功 vmt 基因丢失的菌株存活二次重组后存活菌株通过进一步的 PCR 和序列测定验证, 成功筛选得到了鲁氏耶尔森菌的 invf 基因无痕缺失突变株本实验菌体菌落形态和生化特性结果初步表明,invF 的缺失对鲁氏耶尔森菌的菌体形态和生化特性无明显影响, 野生株在 LB 平板上的菌落较突变株大, 野生株和突变株在 37 C 培养均无动力, 较大的菌落意味着更多的菌体, 所以突变株生长活性较低 ; 生长曲线结果说明突变株的生长速率较野生株迟缓, 进一步表明突变株生长活性较低,invF 的缺失对鲁氏耶尔森菌的生长特性有轻微影响本研究以同源重组的方法, 利用自杀质粒 plp12 和 β2163 高效接合系统首次在鲁氏耶尔森菌上敲除了 T3SS 的核心调控基因 invf, 通过正反向筛选技术, 在对其基本生物学特性无显著影响的情况下, 获得了无抗生素标记的鲁氏耶尔森菌的 invf 基因无痕缺失突变株, 为后续该菌致病性和 invf 功能的研究奠定了基础, 为开发预防鲁氏耶尔森菌的潜在弱毒疫苗提供了新的途径参考文献 : [ 1 ] Ross A J, Rucker R R, Ewing W H. Description of a bacterium associated with redmouth disease of rainbow

8 12 期闵洁, 等 : 鲁氏耶尔森菌 invf 基因无痕缺失突变株的构建及生物学特性 1865 trout (Salmo gairdneri)[j]. Canadian Journal of a putative type IV secretion system is involved in the Microbiology, 1966, 12(4): virulence of Yersinia ruckeri[j]. Applied and [ 2 ] 连海. 鲁氏耶尔森氏菌 p1 基因的克隆分子特性分析 Environmental Microbiology, 2009, 75(4): 及原核表达 [D]. 成都 : 四川农业大学, [10] 李正花. Ⅲ 型分泌系统的研究进展 [J]. 医学信息, 2008, Lian H. Cloning, molecular characteristics analysis and 21(11): prokaryotic expression of the p1 gene of Yersinia Li Z H. The research progress of type III secretion ruckeri[d]. Chengdu: Sichuan Agricultural University, system (T3SS)[J]. Medical Information, 2008, 21(11): 2012 (in Chinese) (in Chinese). [ 3 ] 范方玲, 汪开毓, 耿毅, 等. 斑点叉尾鲙 (Ictalunes [11] 黄冠军, 刘天强, 杨晓玲, 等. 沙门氏菌入侵基因研究 punctatus) 源鲁氏耶尔森氏菌的分离鉴定及系统发育进展 [J]. 亚太传统医药, 2013, 9(11): 分析 [J]. 海洋与湖沼, 2010, 41(6): Huang G J, Liu T Q, Yang X L, et al. Advances of Fan F L, Wang K Y, Geng Y, et al. Isolation, research on invasive genes in Salmonella[J]. Asia-Pacific identification and phylogenetic analysis of Yersinia Traditional Medicine, 2013, 9(11): 65-67(in Chinese). ruckeri in channel catfish Ictalunes punctatus[j]. [12] Darwin K H, Miller V L. Invf is required for expression Oceanologia et Limnologia Sinica, 2010, 41(6): 862- of genes encoding proteins secreted by the SPI1 type III 868(in Chinese). secretion apparatus in Salmonella typhimurium[j]. [ 4 ] 徐伯亥, 殷战, 陈燕燊, 等. 鲢鳙鱼一种新的传染病 Journal of Bacteriology, 1999, 181(16): Yersinia ruckeri, 一种新的鲢鳙鱼病原菌 [J]. 科学通 [13] Main-Hester K L, Colpitts K M, Thomas G A, et al. 报, 1991, 36(21): Coordinate regulation of Salmonella pathogenicity island Xu B H, Yin Z, Chen Y S, et al. An outbreak of a new 1 (SPI1) and SPI4 in Salmonella enterica serovar epizootic in silver carp and bighead carp Yersinia typhimurium[j]. Infection and Immunity, 2008, 76(3): ruckeri, a new pathogen of silver carp and bighead carp[j]. Chinese Science Bulletin, 1991, 36(21): [14] 陈俊, 蒋文灿, 谭天, 等. 沙门氏菌毒力岛及 Ⅲ 型分泌系统研究进展 [J]. 中国人兽共患病学报, 2015, 31(4): [ 5 ] 蔡雪峰, 俞开康, 孟庆显. 对虾耶尔森氏菌病病原及血淋巴生理指标研究 [J]. 西南农业大学学报, 1997, Chen J, Jiang W C, Tan T, et al. Salmonella pathogen- 19(5): icity island and type III secretion system[j]. Chinese Cai X F, Yu K K, Meng Q X. Studies on a pathogen Journal of Zoonoses, 2015, 31(4): (in Chinese). (Yersinia rucheri) and it s effects on hemolymph of [15] 陶果, 信吉阁, 肖晶, 等. 基因敲除技术最新研究进展 penaeus orientalis[j]. Journal of Southwest Agricultural 及其应用 [J]. 安徽农业科学, 2013, 41(29): University, 1997, 19(5): (in Chinese) , [ 6 ] Furones M D, Rodgers C J, Munn C B. Yersinia ruckeri, Tao G, Xin J G, Xiao J, et al. Research advance of gene the causal agent of enteric redmouth disease (ERM) in knockout technology and its application[j]. Journal of fish[j]. Annual Review of Fish Diseases, 1993, 3: 105- Anhui Agricultural Sciences, 2013, 41(29): , 11644(in Chinese). [ 7 ] Fernández L, Prieto M, Guijarro J A. The iron-and [16] Jiang W Y, Bikard D, Cox D, et al. RNA-guided editing temperature-regulated haemolysin YhlA is a virulence of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems[j]. factor of Yersinia ruckeri[j]. Microbiology, 2007, Nature Biotechnology, 2013, 31(3): (2): [17] 余深翼, 赵金荣, 郑玲红, 等. 利用 CRISPR/Cas9 技术构 [ 8 ] Liu T, Wang K Y, Wang J, et al. Genome sequence of 建大肠杆菌 aroa 基因的敲除系统及其初步应用 [J]. 畜 the fish pathogen Yersinia ruckeri SC09 provides 牧兽医学报, 2016, 47(4): insights into niche adaptation and pathogenic Yu S Y, Zhao J R, Zheng L H, et al. The application of mechanism[j]. International Journal of Molecular CRISPR/Cas 9 technology for aroa gene knockout in Sciences, 2016, 17(4): 557. Escherichia coli[j]. Acta Veterinaria et Zootechnica [ 9 ] Méndez J, Fernández L, Menéndez A, et al. A Sinica, 2016, 47(4): (in Chinese). chromosomally located trahijkclmn operon encoding [18] Luo P, He X Y, Liu Q T, et al. Developing universal

9 1866 水产学报 41 卷 [19] [20] genetic tools for rapid and efficient deletion mutation in vibrio Species based on suicide T-Vectors carrying a novel counterselectable marker, vmi480[j]. PLoS One, 2015, 10(12): e Zeng Y, He Y, Wang K Y, et al. cpsj gene of Streptococcus iniae is involved in capsular polysaccharide synthesis and virulence[j]. Antonie van Leeuwenhoek, 2016, 109(11): 潘文, 王佳莹, 赵明秋, 等. 布鲁氏菌 bp26 基因缺失株 [21] Pan W, Wang J Y, Zhao M Q, et al. Construction of unmarked bp26 gene-deleted strains of Brucella spp.[j]. Chinese Veterinary Science, 2011, 41(3): (in Chinese). 张雪, 温廷益. Red 重组系统用于大肠杆菌基因修饰研究进展 [J]. 中国生物工程杂志, 2008, 28(12): Zhang X, Wen T Y. Advances of Red recombination system in Escherichia coli gene modification[j]. China 的构建 [J]. 中国兽医科学, 2011, 41(3): Biotechnology, 2008, 28(12): 89-93(in Chinese). Construction and identification of invf gene deleted Yersinia ruckeri and its biological characteristics MIN Jie 1, WANG Kaiyu 1,2*, LIU Tao 1, HE Yang 1, HU Wei 1, LUO Mengdi 1 (1. College of Veterinary Medicine, Sichuan Agricultural University, Chengdu , China; 2. Key Laboratory of Animal Disease and Human Health of Sichuan Province, Sichuan Agricultural University, Chengdu , China) Abstract: Yersinia ruckeri is a conditional pathogenic bacterium which has widespread pathogenicity. The most important virulence regulatory system of Y. ruckeri is its type III secretion system (T3SS), while invf gene is an important regulatory factor of the T3SS. In this study, we constructed an unmarked deletion mutant with invf gene missing of a Y. ruckeri SC09, a highly virulent strain isolated from Ictalurus punctatus, and studied its biological characteristics. In order to investigate the effects of invf and T3SS on the pathogenicity of Y. ruckeri, construction of homologous arm AC, upstream fragment A and downstream fragment C of invf gene, was combined in overlap extension PCR. Then the homologous arm AC was ligated with the plp12 suicide vector to generate the plasmid plp12-invf. The plasmid was transformed into E. coli DH5α λ pir cells and it was amplified. The plp12-invf was extracted and transformed into E. coli β2163 by electroporation, designated plp12-invf-β2163. Then the plp12- invf was transferred into Y. ruckeri SC09 strain through conjugation. Using the chloramphenicol for screening of insertional mutants and the vmt gene with L-arabinose for counter selection of deletion mutants. The deletion mutants were confirmed by PCR and subsequent sequencing. Then we observed morphology of bacteria and colonies, identified biochemical characterization and measured growth curve of the deletion mutants and wild type.in this study, the Y. ruckeri SC09 strain invf gene has been successfully knockouted. The morphology of bacteria and colonies, biochemical characteristics of deletion mutants and wild type were similar, but the colony size of deletion mutants was smaller than wild type and the growth of deletion mutants was slower than that of wild type. The method of plp12 suicide vector, a highly efficient conjugation system form E. coli β2163 and screening by the antibiotic coupled with counter selecting by vmt gene, can be a simple and efficient gene editing operation to deal with Y. ruckeri, in the absence of a significant effect on its basic biological characteristics. In conclusion, this research obtained the unmarked mutant genes with the missing invf successfully, which laid a foundation for the studies of the pathogenicity of Y. Ruckeri in the future. Key words: Yersinia ruckeri; T3SS; invf gene; unmarked deletion; biological characteristic Corresponding author: WANG Kaiyu. kywangsicau@126.com Funding projects: Innovative Experiment Project of Sichuan Agricultural Uniersity ( )

材料方法

材料方法生物技术通报张发洲杨慧兰为了构建单纯疱疹病毒型感染细胞多肽真核表达质粒应用技术从株的基因组中扩增基因并连接至真核表达载体对阳性克隆进行菌落酶切和测序鉴定后成功构建了重组质粒用转染试剂盒将重组质粒转染至细胞中并用及检测其表达情况结果显示基因在细胞中得到正确表达真核表达质粒的构建成功为进一步研究对宿主细胞的影响奠定了基础单纯疱疹病毒型感染细胞多肽

12 期闵洁, 等 : 鲁氏耶尔森菌 invf 基因无痕缺失突变株的构建及生物学特性 1859 icity island) 的形式成簇存在于细菌的染色体或质 粒上 Inv 是 T3SS 中编码侵袭蛋白 (INV) 的基因 簇, 包含 inva invb invc inve invf invg inv

12 期闵洁, 等 : 鲁氏耶尔森菌 invf 基因无痕缺失突变株的构建及生物学特性 1859 icity island) 的形式成簇存在于细菌的染色体或质粒上 Inv 是 T3SS 中编码侵袭蛋白 (INV) 的基因簇, 包含 inva invb invc inve invf invg inv