疗小便不通尿路感染臃肿疔疮热淋血淋癌症等, 也可抗早孕 [1] 药理实验表明, 瞿麦对麻醉犬兔小白鼠等都有利尿作用, 同时还有兴奋平滑肌抗菌等作用临床上, 瞿麦常与清热解毒的中药合用, 对多种癌症具有很好的疗效国内外学者从瞿麦中分离得到 20 余种化合物, 包括蒽醌类, 如大黄素

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镕陆
5 years ago
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1 年月第卷第期中国现代中药ＭＣＭＡＶＮ基础研究瞿麦正丁醇部位抗肿瘤活性成分筛选张建超余建清张方蕾张磊江银刘焱文湖北中医药大学药学院湖北武汉武汉大学药学院湖北武汉摘要目的研究瞿麦Ｄ正丁醇部位中具有抗肿瘤活性的化合物方法用乙醇提取瞿麦全草中的化学成分正丁醇萃取后在用四甲基偶氮唑盐ＭＴＴ法检测ＨＧ细胞活性的筛选下用硅胶凝胶柱色谱以及半制备ＨＰＬＣ分离纯化得到对肿瘤细胞株的细胞毒活性成分ＶＩ并通过ＬＣＭＳＨＣＮＭＲ结合二维 α β α 三羟基熊果烯酸结果通过ＭＴＴ核磁图谱推测出该活性成分为积雪草酸Ａ法分别测定瞿麦正丁醇部位硅胶柱色谱分离得到的个组分其中第个组分组分对ＨＧ细胞增殖抑制率最高为进一步分离第个组分得到的ＶＩ组分对ＨＧ细胞增殖抑制率为从ＶＩ分离得到的化学成分为积雪草酸其对ＨＧＳＳＭＣＳＫＨＥＰ及Ｂ细胞株的半数抑制率ＩＣ分别为 μ ｍｌ在体外具有较好地抑制肿瘤细胞增殖的活性结论确定瞿麦正丁醇部位抗肿瘤活性成分为五环三萜类化合物积雪草酸关键词瞿麦抗肿瘤活性积雪草酸ＳＡＣＦＤＺＨＡＮＧＪＹＵＪｑＺＨＡＮＧＦＺＨＡＮＧＬＪＩＡＮＧＹＬＩＵＹｗＨＵＣｍＰｍＨＷＳＰｍＳＷＵＨＷＡＯｊＴＤＭＴＤｗｗＥＯＨｗｍｗｗｗｗｍＥＡＢＯＨＴＢＯＨｗＢＯＨｗｗｍＬＨＨＰＬＣｍＴＨＧｗＭＴＴｍＯＬＣＭＳＨＣＮＭＲｍｗｗｍＮＭＲｍｍ α β α ＲＴｍＢＯＨｍｍｗＭＴＴＡｍｍｍＨＧｗＶＩｗＴＶＩｍＶＩｗＨＧＡｍＶＩｗＨＧＳＳＭＣＳＫＨＥＰＢｗＩＣ μ ｍｌＡｗＣＴｍｍｄＫｗＤＬｊ瞿麦Ｄ是我国传统中药中华人的干燥地上部分瞿麦在我国大部分地区均有分布民共和国药典版收载的瞿麦为石竹科植物瞿主产于河北河南湖北辽宁浙江等地资源麦ＤＬ或石竹ＤＬ丰富其具有利尿通淋通血通经的功能用于治基金项目国家自然科学基金资助项目通信作者余建清博士研究方向抗肿瘤药物作用机制ＴＥｍｊｑｗ

2 疗小便不通尿路感染臃肿疔疮热淋血淋癌症等, 也可抗早孕 [1] 药理实验表明, 瞿麦对麻醉犬兔小白鼠等都有利尿作用, 同时还有兴奋平滑肌抗菌等作用临床上, 瞿麦常与清热解毒的中药合用, 对多种癌症具有很好的疗效国内外学者从瞿麦中分离得到 20 余种化合物, 包括蒽醌类, 如大黄素大黄素甲醚等 ; 环肽类, 如石竹酰胺 A 和 B 等及黄酮生物碱甾醇等 [2], 但瞿麦抗肿瘤活性成分尚不清楚本实验对瞿麦中正丁醇萃取部位进行化学成分分离, 在用 MTT 法检测各组分对 HepG2 细胞增殖抑制活性的筛选下, 采用硅胶和 SephadexLH 20 凝胶等色谱, 半制备 HPLC 分离活性部位, 得到其中一种对肿瘤细胞有细胞毒活性的三萜类化合物, 并通过 LC MS 1 H NMR 13 C NMR, 结合 2D NMR 图谱, 推测出该活性成分为积雪草酸 (asiatic acid,2α,3β,23α 三羟基乌苏 12 烯 28 酸 ) 1 仪器材料 1 1 仪器高效液相色谱线性离子阱质谱联用仪 (LTQXL, ESI 源, 赛默飞世尔科技有限公司 ); 核磁共振波谱仪 (Agilent400MR, 安捷伦科技公司 );ZF 1 型三用紫外线分析仪 ( 上海金鹏分析仪器有限公司 ); 玻璃色谱柱玻璃仪器气流烘干器 ( 郑州长城科工贸有限公司 ); 电子天平 ( 上海良平仪器表有限公司 );KQ 250B 型超声波清洗器 ( 昆山市超声仪器有限公司 ); SZ 93 自动双重纯水蒸馏器 ( 上海亚荣生化仪器厂 ); DZF 6050 型真空干燥箱 ( 上海博迅实业有限公司 ) 1 2 材料瞿麦 ( 湖北省中药材总公司 ); 硅胶 G( 青岛海洋化工有限公司 );SephadexLH 20 凝胶 (Pharmacia 公司 ); 肝癌细胞株 HePG2( 武汉大学中国典型物保藏中心 );95% 乙醇正丁醇石油醚乙酸乙酯均为分析纯 ; 水为蒸馏水 2 方法及结果 2 1 提取取干燥粉碎的瞿麦全草 20kg, 用 95% 乙醇回流提取 4 次, 经石油醚乙酸乙酯及正丁醇萃取, 正丁醇部位回收溶剂, 得萃取物 297 5g 2 2 正丁醇萃取部位的分离纯化取正丁醇萃取物 200g, 进行硅胶柱色谱分离, 分别用乙酸乙酯乙酸乙酯正丁醇 (1 1) 正丁醇 70% 乙醇洗脱, 每个梯度 4L 每份流分的体积约为 250mL, 得到 67 个流份将 67 个流份经 TLC 检测, 合并, 得到 8 个组分 (Ⅰ ~Ⅷ) 将 VI 部位进行硅胶柱色谱分离,CHCl 3 CH 3 OH H 2 O= ( 下层 ) 梯度洗脱,15mL/ 份, 共 29 流分 TLC 检测, 分别合并 3~15 流分, 回收溶剂得 VI3 15(43mg); 合并 17~29 流分, 回收溶剂得 VI17 29(104mg) 将 VI3 15 用少许甲醇溶解, 进行 SephadexLH 20 色谱分离, 甲醇洗脱, 共收集 20 份合并 6~17 流份, 回收溶剂得 VI 将 VI 用 Gilson 半制备液相重复进样制备, 流动相为 CH 3 OH H 2 O CH 3 COOH= (pH=4), 等度洗脱 λ=205nm, 收集 t R =35 6min 部分, 回收溶剂, 冻干, 得白色粉末 VI (15mg) 正丁醇萃取部位抗肿瘤活性筛选及化合物活性测定所有肝癌细胞 (HepG2 SK HEP 1 SSMC 7721 Bel 7402) 用 DMEM 培养基 ( 含 10% 小牛血清 100U ml -1 青霉素和 100μg ml -1 链霉素 ), 在含 5%CO 2 的 37 培养箱中培养分离组分活性测定 : 以每孔 4000 个 HepG2 细胞 (100μL) 均匀铺到 96 孔板中, 培养 24h 加入药液, 以含 0 5%DMSO 的培养基作空白对照作用 24h, 向每孔中加入质量浓度为 5mg ml -1 的 MTT 溶液 20μL, 继续在 37 培养 4h MTT 作用完成后, 移去培养基, 向每孔加入 100μLDMSO, 避光振荡均匀后, 使用酶标仪 (Thermo) 检测 570nm 处的吸光值, 计算抑制率计算公式 : 抑制率 =( 对照组 OD 值加药组 OD 值 )/ 对照组 OD 值 100%, 见表 1 VI 化合物活性测定 : 所有肝癌细胞 (HepG2 SSMC 7721 SK HEP 1 Bel 7402) 以每孔 2000 个 (100μL) 均匀铺到 96 孔板中, 培养 24h 加入化合物, 作用 72h, 按上述 MTT 方法测定抑制表 1 MTT 法测定瞿麦正丁醇部位各组分对 HepG2 细胞抑制率 (200μg ml -1 ) 9~14 组分 15~19 组分 20~22 组分 23~25 组分 26~29 组分 30~33 组分 34~63 组分 64~67 组分 VI3~15 组分抑制率 %

3 率, 计算半数抑制浓度 (IC 50 ) 值 VI 对 HepG2 SSMC 7721 SK HEP 1 及 Bel 7402 细胞的 IC 50 分别是 μg ml -1 其中阳性对照药顺铂 IC 50 分别是 (8 9±0 8) (9 3± 0 9) (15 3±1 4) (10 4±0 6)μM 2 3VI 化学结构解析 2 3 1VI : 白色粉末 ( 甲醇 ),mp243~245,liebermann Burchard 反应阳性 1 H NMR 谱中给出 6 个甲基信号, 分别为 δ0 55(H 24),0 83(H 29),1 06(H 27),0 75(H 26),0 92(H 30) 和 0 94(H 25), 其中 δ0 83,0 92 为两个 d 峰, 提示可能为熊果烷型五环三萜 13 C NMR 谱中给出 30 个碳信号, 推断其为三萜皂苷元类化合物根据 DEPT 谱得出化合物中碳信号 6 CH 3 9 CH 2 8 CH 和 7 C δ125 01(C 12) 和 (C 13) 为烯碳特征信号,δ178 72(C 28) 为羧基碳信号,3 个连氧碳信号 δ67 90,76 10,64 45 分别归属为 2α,3β, 23α OH 碳化合物中存在 2 个连羟基的次甲基 1 个连羟基的亚甲基 1 个 CH=C 的双键和 1 个羧基其碳谱数据与文献报道的积雪草酸的碳谱数据对照 [3 4], 二者基本一致, 故初步确定化合物 VI 为积雪草酸 (2α,3β,23α 三羟基熊果 12 烯 28 酸 ) 在 200~800nm, 显示 λ max =205nm, 说明化合物 VI 结构中没有共轭体系存在见图 1 图 1 VI 的液相二级管阵列检测 (LC DAD) 图在 VI 的 HMBC 谱中,6 个高场氢信号 δ0 55,0 75,0 83,0 92,0 94,1 06 分别和相近的碳相关, 如 24 位甲基氢 δ0 55 与 3(δ75 80), 4(δ42 67),5(δ46 39),23(δ64 14) 位碳相关 ; 25 位甲基氢 δ0 94 与 1(δ47 58),10(δ7 39) 位碳相关 ;26 位甲基氢 δ0 75 与 7(δ32 37),8(δ 39 10),9(δ47 17),14(δ42 14) 位碳相关 ;27 位甲基氢 δ1 06 与 8(δ39 08),13(δ138 56),14(δ 42 17),15(δ27 69) 位碳相关 ;29 位甲基氢 δ0 83 与 18(δ52 62),19(δ38 67) 位碳相关 ;30 位甲基 328 氢 δ0 92 与 20(δ38 72),21(δ30 28) 位碳相关见图通过 LC MS 分析, 负离子检测 : [M H] , 得出 VI 化合物 [M] 与积雪草酸分子量一致结合 HMQC 及 H HCOSY 谱将 VI 各个 C H 信号归属如下 : 13 C NMR(DMSO d 6 ):δ47 40(C 1),67 90(C 2), 76 10(C 3), 42 96(C 4), 47 44(C 5), 17 91(C 6),32 66(C 7),39 50(C 8),46 53(C

4 图 2 VI 的 HMBC 图谱及结构中与 6 个甲基氢相关的碳信号图 3 VI 的 LC MS 图谱 329

5 9),37 77(C 10),23 45(C 11),125 01(C 12), (C 13), 42 23(C 14), 27 96(C 15), 24 28(C 16),47 30(C 17),52 85(C 18),38 96 (C 19),38 88(C 20),30 65(C 21),36 79(C 22),64 45(C 23),14 22(C 24),17 48(C 25), 17 47(C 26), 23 79(C 27), (C 28), 17 35(C 29),21 53(C 30); 1 H NMR(DMSO d 6 ):δ 3 49(H 2),3 16(H 3),1 22(H 7),1 21(H 9), 1 87(H 11),5 14(H 12),2 09(H 18),1 30(H 19),1 56(H 22),0 55(H 24),0 94(H 25), 0 75(H 26), 1 06 (H 27), 0 81 (H 29, d, 12Hz),0 92(H 30,d,12Hz) 通过 LC MS 1 H NMR 13 C NMR 结合 2D NMR 图谱, 推测化合物 VI 的结构为 : 3 讨论 3 1 在推测化合物结构时, 通过 1 H NMR 和 13 C NMR 谱图发现化合物中存在杂质 ( 氢谱积分不成比例 ) 通过二维核磁图谱 1 H 1 HCOSY 和 HMBC 发现它们与其他氢信号并没有相关, 因此推测其为杂质信号 [5 6] 3 2 本实验采用在活性跟踪筛选下进行化学成分分离的思路, 相对于系统分离化合物后再测定活性的方法, 减少了一些不必要的无效成分的分离结果发现, 此方法可减少发现天然药物中抗肿瘤活性成分时间, 使分离工作更有效率抗肿瘤活性成分积雪草酸也是首次从瞿麦中分离得到, 其含量在瞿麦中也比较高对积雪草酸的抗肿瘤机制的研究也有一些报道参考文献 [1] 赵龙铉, 田明珠, 金礼吉, 等. 积雪草酸衍生物的合成与表征及体外抗癌活性的研究 [J]. 有机化学,2011,31 (5): [2] 汪向海, 巢启荣, 黄浩, 等. 瞿麦化学成分研究 [J]. 中草药,2000,31(4): [3] 刘普, 段宏泉, 潘勤, 等. 委陵菜三萜成分研究 [J]. 中国中药杂志,2006,31(2): [4] 丁丽丽, 王顺春, 王峥涛. 猫人参化学成分的研究 [J]. 中国中药杂志,2008,32(8): [5] 刘瑜, 赵余庆. 积雪草化学成分的研究 [J]. 中国现代中药,2008,10(3):7 9. [6] 詹勤, 王燕. 大花紫薇叶石油醚部位的化学成分研究 [J]. 时珍国医国药,2009,20(9): ( 收稿日期 ) 檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿 ( 上接第 325 页 ) [15]ChenJ,OhnmachtC,HageDS.Studiesofphenytoinbinding to human serum albumin by high performance afinity chromatography[j].jchromatogrbanalyttechnolbiomed LifeSei,2004,809(1): [16]Kim H S,Hage D S.Chromatographic analysis of carbamazepinebindingtohuman serum albumin[j].j ChromatogrBAnalytTechnolBiomedLifeSci,2005,25, 816(1 2): [17] 周大炜, 李发美. 采用毛细管电泳迎头分析法测定血清或血浆中氯氮平的游离浓度 [J]. 化学学报,2004,62 (13): [18]Kyoung JinL,RachelM,Tom H,etal.Modulation of Nonspecific Binding in Ultrafiltration Protein Binding Studies[J].PharmaceuticalResearch,2003,20(7): [19]SebileB.Methodsofdrugproteinbindingdeterminations [J].Fundam ClinPharmacol,1990,4(Suppl2):15lS 161S. [20]LeeK J,Mow E R,HolenbeckT,eta1.Modulationof nonspecificbindinginultrafiltrationproteinbindingstudies [J].PharmRes,2003,20(7): ( 收稿日期 ) 330