检验医学 2016 年 6 月第 31 卷第 6 期 Laboratory Medicine,June 2016,Vol. 31,No 区常见型别为 14d/f [6], 此结果与中国其他地区存在差异目前, 对妊娠梅毒基因分型的特点尚不明确, 且 2012 年至今未见关于上海地区

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一韶扈
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1 486 检验医学 2016 年 6 月第 31 卷第 6 期 Laboratory Medicine,June 2016,Vol. 31,No. 6 文章编号 : (2016) 中图分类号 :R446.5 文献标志码 :A DOI : /j.issn 上海闸北地区妊娠梅毒分子流行病学特征分析吴奇, 王丽, 季灵婷, 吕盈盈 ( 上海市闸北区中心医院检验科, 上海 ) 摘要 : 目的分析闸北地区孕产妇梅毒的发病率垂直传播分子分型等流行病学特征, 探讨分子分型的改变及各类样本对检测结果的影响方法对例孕产妇进行梅毒筛查, 阳性者采集全血血浆耳垂血及皮损分泌物样本进行分子分型 ; 并收集临床资料, 分析发病率母婴传播及社会学资料结果共筛查出阳性病例 41 例, 阳性率为 1.32%, 梅毒垂直传播比例为 43.9%(18/41),14d/f 型 (80.9%,17/21) 为临床验证样本中最常见的基因型别,15d/f 型 13a/f 型 13d/f 型和 9o/c 型各 1 例 (4.7%,1/21) 各类样本中以皮损分泌物样本分型效率最高, 耳垂血样本略低于皮损分泌物样本, 显著高于全血和血浆样本结论闸北地区妊娠梅毒发病率高于上海平均水平, 其分子分型多样, 加强对孕产妇管理十分必要耳垂血可能是研究潜伏性梅毒的一个较好的样本关键词 : 梅毒螺旋体 ; 分子分型 ; 母婴传播 ; 耳垂血 Molecular epidemiological analysis for pregnant women with syphilis in Zhabei District of Shanghai WU Qi,WANG Li,JI Lingting,LU Yingying. (Department of Clinical Laboratory,Shanghai Zhabei Central Hospital,Shanghai ,China) Abstract:Objective To evaluate the incidence,maternal-neonatal transmission and genotype of syphilis in pregnant women from Zhabei District,and to investigate the influence of genotype change and specimen on determination results. Methods A total of pregnant women were enrolled for syphilis screening. The specimens were collected from whole blood,plasma,ear lobe blood and skin of syphilis-positive patients for genotype determination. Clinical data were collected to evaluate incidence,maternal-neonatal transmission and social factors. Results A total of 41 pregnant women were positive in syphilis screening,and the positive rate was 1.32%. The proportion of maternal-neonatal transmission accounted for 43.9%(18/41). The predominant type was 14d/f (80.9%,17/21),followed by 15d/f(4.7%,1/21),13a/f(4.7%,1/21),13d/f(4.7%,1/21) and 9o/c (4.7%,1/21). Genotyping efficiency of skin was the highest,and that of ear lobe blood was lower than that of skin,which were higher than those of whole blood and plasma. Conclusions The incidence of syphilis in pregnant women in Zhabei District is higher than that in Shanghai,and the kinds of genotypes are various. Ear lobe blood is a good choice of specimen for genotyping. Key words:treponema pallidum;genotype;maternal-neonatal transmission;ear lobe blood 梅毒是梅毒螺旋体通过性接触而传播的传染病, 在 2014 年上海地区乙类传染病发病率中居第 1 位 [1], 且大环内酯类药物耐药株所占比例极高, 约为 95.5% [2-3] 闸北区为国家级性病监测点, 为性病高发地区加强对孕产妇的梅毒监测, 对孕产妇和新生儿梅毒的防治具有重要意义根据美国疾病预防控制中心的推荐, 梅毒螺旋体采用 arp tpr 和 tp 种基因联合分型 [4-5] 小样本分子流行病学研究显示, 上海地基金项目 : 上海市闸北区公共卫生项目 (133) 作者简介 : 吴奇, 女,1970 年生, 学士, 主管技师, 主要从事免疫学和微生物学检验工作通讯作者 : 吕盈盈, 联系电话 :

2 检验医学 2016 年 6 月第 31 卷第 6 期 Laboratory Medicine,June 2016,Vol. 31,No 区常见型别为 14d/f [6], 此结果与中国其他地区存在差异目前, 对妊娠梅毒基因分型的特点尚不明确, 且 2012 年至今未见关于上海地区梅毒基因分型的调查报道本研究对 2013 年 7 月至 2015 年 6 月在上海市闸北区中心医院就诊的孕产妇进行梅毒的血清学检测生物学分型和行为监测, 旨在了解闸北地区妊娠梅毒的特点及其分子流行病学特征材料和方法一研究对象选择 2013 年 7 月至 2015 年 6 月在上海市闸北区中心医院妇产科初次就诊的孕产妇共例进行梅毒筛查, 采用普通管收集研究对象的静脉血 3 ml, 采用快速血浆反应素 (rapid plasma reagin,rpr) 环状卡片试验 ( 上海荣盛生物药业有限公司 ) 进行初筛,RPR 阳性者采用梅毒螺旋体抗体明胶颗粒凝集试验 (treponema pallidum particle agglutination assay,tppa)( 珠海丽珠试剂股份有限公司 ) 确认二方法 1. 梅毒结果判定 RPR 及 TPPA 均阳性者判定为梅毒妊娠期梅毒按照卫生部疾病控制司 2000 年 8 月颁布的性病诊疗规范和性病治疗 [6] 推荐方案中的标准进行诊断 2. 临床样本和资料收集采集妊娠梅毒患者的静脉血 41 例血浆 41 例耳垂血 39 例及皮损 ( 生殖道溃疡 ) 分泌物 11 例, 均在抗菌药物治疗前采集临床样本同时按照全国哨点监测方案作问卷调查, 收集研究对象的人口学特征临床症状分期感染情况对梅毒相关知识的了解程度等信息 3. 梅毒螺旋体 DNA 的提取分别提取各类样本的梅毒螺旋体 DNA, 采用 QIAamp DNA 试剂盒 (Qiagen,hilden, 德国 ) 进行检测, 按照试剂盒说明书操作 4. 梅毒螺旋体的基因分型对梅毒螺旋体特异性 tp47 进行筛查, 阳性者扩增 arp tpr 及 tp0548 基因, 梅毒螺旋体分型表示为 arp 型别 /tpr 型别 / tp0548 型别 (1)arp 基因内含 2~22 个数目不等的 60 bp 的重复基因序列, 以 arp 基因所含重复序列的个数表示该梅毒螺旋体株 arp 型别, 共有 21 种亚型 ;arp 基因引物浓度为 0.4 mol/l, 聚合酶链反应 (polymerase chain reaction,pcr) 条件为 :94 1 min 61 1min 和 s 40 个循环, 延伸 min, 采用 Image lab 软件分析临床样本所扩增的基因片段大小并计算所含的重复序列数 (2)tpr(tpr E G J) 基因采用限制性内切酶片段长度多态性 (restriction fragment [7] length polymorphism,rflp) 分型方法进行检测目前已发现 a~p 共 16 个亚型 ;tpr 基因引物浓度为 0.6 mol/l,pcr 条件同上, 产物用限制性内切酶 MseI (Invitrogen, 美国 ) 消化后进行 2% 琼脂糖电泳, 用 RFLP 分型方法确定亚型 (3)tp0548 基因型别由 T. Pallidum 开放阅读框 131~215 序列决定,PCR 条件为 :95 2 min, 95 1 min s 72 1 min 40 个循环, 延伸 min, 扩增产物测序, 与标准序列比对后判定 tp0548 基因型别, 目前鉴定出 c~g 型和 i 型 tp47 arp tpr 及 tp0548 基因引物按照文献 [8] 报道的序列, 由上海生物工程技术服务有限公司合成, 序列见表 1 表 1 tp47 arp tpr 及 tp0548 基因引物序列基因名称 tp47 arp tpr tp0548 引物序列 F: CGTGTGGTATCA ACTATGG R: TCA ACCGTGTACTCAGTGC F:CAAGTCAGGACGGACTGTCC R:GGTATCACCTGGGGATGC F:CAGGTTTTGCCGTTAAGC R:AATCAAGGGAGAATACCGTC F:GGTCCCTATGATATCGTGTTCG R:GTCATGGATCTGCGAGTGG 三统计学方法按统一编制的上海市艾滋病综合监测点监测工作软件 (Epi-data 软件 ) 进行资料录入, 使用 SPSS 16.0 软件进行统计分析, 样本数据间比较采用 χ 2 检验, 以 P<0.05 为差异有统计学意义结一孕产妇基本情况 2 年间共调查孕产妇例, 血清学检查 RPR 和 TPPA 均为阳性者共 41 例, 总阳性率为 1.32% 2014 年 7 月至 2015 年 6 月例, 血清学检查 RPR 和 TPPA 均为阳性者 20 例, 阳性率为 1.51%;2013 年 7 月至 2014 年 6 月例, 阳性 21 果

488 检验医学 2016 年 6 月第 31 卷第 6 期 Laboratory Medicine,June 2016,Vol. 31,No. 6 例, 阳性率为 1.23% 梅毒阳性孕产妇年龄集中在 20~29 岁及 30~39 岁, 平均年龄 28.3 岁潜伏期梅毒所占比例较大, 为 73.1%(30/41) 文化程度大专及以下者占 82.9%(34/41) 48.

9% (18/41), 无人合并人类免疫缺陷病毒 (human immunodeficiency virus,hiv) 感染见表 2 表 2 梅毒阳性产妇分娩情况及梅毒母婴垂直传播情况年龄 ( 岁 ) 例数妊娠结局足月活产早产死胎畸形新生儿梅毒阳性合并 HIV 感染 20~29 28 24 3 1 0 13 0 30~39 11 9 1 1 0 4 0 40~49 2 1 1 0 0

3 488 检验医学 2016 年 6 月第 31 卷第 6 期 Laboratory Medicine,June 2016,Vol. 31,No. 6 例, 阳性率为 1.23% 梅毒阳性孕产妇年龄集中在 20~29 岁及 30~39 岁, 平均年龄 28.3 岁潜伏期梅毒所占比例较大, 为 73.1%(30/41) 文化程度大专及以下者占 82.9%(34/41) 48.2% (20/41) 的梅毒阳性孕产妇无固定职业二梅毒阳性产妇分娩情况及梅毒母婴垂直传播情况梅毒阳性产妇早产死胎发生率较高,41 例产妇中有 7 例 (17.1%,7/41) 发生早产死胎, 新生儿梅毒阳性 18 例, 梅毒垂直传播比例为 43.9% (18/41), 无人合并人类免疫缺陷病毒 (human immunodeficiency virus,hiv) 感染见表 2 表 2 梅毒阳性产妇分娩情况及梅毒母婴垂直传播情况年龄 ( 岁 ) 例数妊娠结局足月活产早产死胎畸形新生儿梅毒阳性合并 HIV 感染 20~ ~ ~ 三临床样本的基因型别共收集到全血样本 41 例,13 例 (31.7%) DNA 阳性,8 例得到分型 ; 血浆样本 41 例,17 例 (41.4%,17/41)DNA 阳性,12 例得到分型 ; 耳垂血样本 39 例,25 例 (64.1%,25/39) DNA 阳性,20 例得到分型 ; 皮损分泌物样本 11 例,10 例 (90.9%,10/16)DNA 阳性, 均完全分型 41 例患者中 21 例患者完全分型见表 3 表 4 表 3 各类样本 DNA 提取情况 f 型 2 种序列型别, 其中 f 型占 93.8%, 见图 3 14d/f 型 (80.9%,17 /21) 为临床验证样本中最常见的基因型别,15d/f 型 13a/f 型 13d/f 型 9o/c 型各 1 例 (4.7%,1/21),14d/f 型为上海地区优势基因型 (bp) 梅毒分期例数全血血浆耳垂血皮损分泌物一期 8 3/8 4/8 6/8 * # 7/8 * # 二期 3 2/3 2/3 3/3 * 3/3 * 潜伏期 30 8/30 11/30 16/28 * 合计 41 13/41 17/41 25/39 * 10/11 * # 注 : 与全血比较,*P<0.05; 与血浆比较,#P<0.05 表 4 各类样本分型情况梅毒分期全血血浆耳垂血皮损分泌物 500 注 :M 为 marker;1 条带为 Nichols 株 ;2~6 条带为患者条带, 其中 2 条带为 13 型 (1 099 bp),3 4 条带为 14 型 (1 185 bp),5 条带为 15 型 (1 220 bp),6 条带为 9 型 (860 bp) 图 1 arp 的 PCR 扩增产物电泳分析一期 2/3 3/4 5/6 7/7 * # 二期 2/2 2/2 3/3 3/3 潜伏期 4/8 7/11 12/16 * (bp) 合计 8/13 12/17 20/25 * 10/10 * # 注 : 与全血比较,*P<0.05; 与血浆比较,#P< arp 基因共发现 4 种不同的重复序列, 分别是 9 型 13 型 14 型和 15 型, 见图 1 tprⅡ 亚家族基因经酶切后共发现 4 种 RFLP 型别, 分别是 a 型 d 型和 o 型, 见图 2 tp0548 基因发现 c 型和 300 注 :M 为 marker;1 条带为 Nichols 株, 为 a 型 ;2~6 条带为患者条带, 其中条带为 d 型,3 条带为 a 型 ;7 条带为亚型 o 图 2 tpr 扩增产物经酶切后 RFLP 型别分析

4 检验医学 2016 年 6 月第 31 卷第 6 期 Laboratory Medicine June 2016 Vol. 31 No a型 b型 c型 d型 e型 f型 g型 h型图3 tp0548不同基因型开放阅读框的碱基序列讨论本次共调查孕产妇3 022例血清学检查 RPR和TPPA均为阳性者41例总阳性率为型但梅毒螺旋体分型种类增加 13a/f型和 9o/c型均为少见分型 13a/f型在2012年上海梅毒分型调查中未报道此次出现为2010年来首例可能与闸北区外来流动人口较多有关 1.32% 2014年7月至2015年6月1 321 例血清本研究的分析显示血液样本同皮肤黏膜学检查 RPR和TPPA均为阳性者20例阳性率为样本相比提取效率较低该结果和以往其 1.51% 而2013年7月至2014年6月1 701例阳性他研究的结果 [10]相一致有研究提示主要原 21例阳性率为 1.23% 2015年与2014年总体相因是梅毒螺旋体在皮肤黏膜中的载量高于血比发病率略有上升 2014年与2015年闸北区液中的载量 [11-12] 同时全血中抑制PCR的物孕产妇梅毒阳性率均高于上海地区2014年梅毒质较多也是原因之一 [1] 发病率 70.73/10万耳垂血样本的分型率高于全血和血浆样本妊娠梅毒多为潜伏期梅毒本次调查的41 耳垂血在梅毒的分子诊断和基因分型方面均与皮例妊娠梅毒中73.1% 30/41 为潜伏期梅毒损分泌物样本相当显示出较强的优势可能与患者年龄主要分布在20 29岁其次为30 39 其富含毛细血管有关 CASTRO等[13]报道潜伏岁闸北区地处火车站附近外来人口较多期梅毒患者体内的梅毒螺旋体可隐藏于毛细血管为性病高发区妊娠梅毒发病率显著高于上海床中因此耳垂血样本的分型效率较高地区发病率妊娠梅毒与孕产妇对预防性传播耳垂部位因毛细血管丰富且感觉神经相对疾病知识缺乏人员流动频繁文化程度低缺乏是采集血样的适宜部位对于没有明显无正式工作有关本次调查中梅毒阳性患者文皮损的潜伏期梅毒患者是一个不错的选择但化程度大专及以下者占82.9% 34/ % 这方面研究非常少尚需要通过更多的研究加 20/41 的梅毒阳性孕产妇无固定职业因以证实此加强对孕产妇梅毒知识的宣传教育是非常参考文献必要和紧迫的本次调查未发现孕妇合并HIV 感染这与 [1] 闸北区近年推行的HIV预防措施密切相关本次调查的梅毒分型与以往的报道略有不同 21例完全分型患者中 14d/f型 80.9% 17 /21 为临床验证样本中最常见的基因型别 15d/f型 13a/f型 13d/f型和9o/c型各1例 gov.cn/wsj/n429/n426/u1ai html. [2] 陆海空周平玉. 我国梅毒治疗及梅毒耐药现况 [J]. 上海医药 [3] CHEN ZQ ZHANG GC GONG XD et al. Syphilis in China results of a national surveillance 4.7% 1/21 14d/f型为闸北地区优势基因 programme[j]. Lancet 型本研究结果与上海地区2012年及2007至 2011年报道 [6,9] 相比优势基因型别仍为14d/f 上海市卫生和计划生育委员会. 疫情信息[EB/OL] [ ]. http // [4] M A R R A C S A H I S TA N TA L O L e t a l.

5 490 检验医学 2016 年 6 月第 31 卷第 6 期 Laboratory Medicine,June 2016,Vol. 31,No. 6 Enhanced molecular typing of treponema pallidum: geographical distribution of strain types and association with neurosyphilis[j]. J Infect Dis, 2010,202(9): [5] MIKALOVA / L,POSPISILOVA / P,WOZNICOVA / V,et al. Comparison of CDC and sequence-based molecular typing of syphilis treponemes: tpr and arp loci are variable in multiple samples from the same patient[j]. BMC Microbiol,2013,13: [6] 戴婷. 上海地区梅毒患者梅毒螺旋体基因分型及与神经梅毒相关性的初步研究 [D]. 北京 : 北京协和医学院,2012. [7] TIPPLE C,TAYLOR GP. Syphilis testing,typing, and treatment follow-up: a new era for an old disease[j]. Curr Opin Infect Dis,2015,28(1): [8] GRILLOVA / L,PĚTROSVA H,MIKALOVA / L, et al. Molecular typing of Treponema pallidum in the Czech Republic during 2011 to 2013:increased prevalence of identified genotypes and of isolates with macrolide resistance[j]. J Clin Microbiol,2014,52 (10): [9] 彭锐锐. 早期梅毒的分子流行病学研究 : 我国多地 [10] [11] [12] [13] 区性病门诊的横断面调查 [D]. 北京 : 北京协和医学院,2012. GAYET-AGERON A,LAURENT F,SCHRENZEL J,et al. Performance of the 47-kilodalton membrane protein versus DNA polymerase i genes for detection of Treponema pallidum by PCR in ulcers[j]. J Clin Microbiol,2015,53(3): WU BR,YANG CJ,TSAI MS,et al. Multicentre surveillance of prevalence of the 23S rrna A2058G and A2059G point mutations and molecular subtypes of Treponema pallidum in Taiwan, [J]. Clin Microbiol Infect,2014,20(8): PENG RR,WANG AL,LI J,et al. Molecular typing of Treponema pallidum: a systematic review and meta-analysis[j]. PLoS One,2011,5(11): e1273. CASTRO R,PRIETO E,AGUAS MJ,et al. Molecular subtyping of Treponema pallidum subsp. pallidum in Lisbon,Portugal[J]. J Clin Microbiol, 2009,47(8): ( 收稿日期 : ) ( 本文编辑 : 姜敏 ) 上海市医疗机构临床基因扩增检验技术人员上岗培训暨分子诊断新技术学习班顺利召开 2016 年 3 月 21 至 30 日, 上海市医疗机构临床基因扩增检验技术人员上岗培训暨分子诊断新技术学习班在上海市临床检验中心顺利召开此次培训班共有 386 名来自全国各医疗机构及独立实验室的学员参加随着临床分子诊断技术和临床研究的不断发展, 除了传统的感染性疾病的诊断领域外, 分子诊断技术在肿瘤的靶向治疗个体化药物代谢遗传病诊断及无创产前诊断等领域中的应用日趋广泛学员们的工作背景也不仅局限于检验科, 很多来自医学转化中心分子遗传学室病理科药剂科产前诊断中心等培训班分为理论学习和实验操作两大部分 3 月 21 至 23 日为理论课学习, 授课内容主要包括 : 上海地区分子诊断技术质量管理要求方法学性能验证要求临床聚合酶链反应 (polymerase chain reaction,pcr) 实验室检测中常见问题及整改措施分子诊断报告规范等针对目前分子病理项目的广泛开展, 此次培训班邀请了复旦大学附属肿瘤医院病理科的周晓燕教授介绍了分子病理检测及相关质量控制的知识 ; 针对我国高通量测序技术在临床检测中试点的展开, 学习班还邀请了试点单位长海医院沈茜主任介绍了其开展临床高通量测序检测的经验质量控制要素以及目前应用中存在的问题等学员们通过学习了解了包括测序技术在内的分子诊断技术在检验医学及病理诊断工作中的具体要求和质量控制要点, 为今后开展相关工作积累了宝贵的实践经验为了保证培训质量, 承办者要求每位学员都能动手操作在实验过程中, 带教老师穿插讲解实验的原理, 实验操作过程的关键步骤通过带教老师细致讲解每个步骤的关键点以及实验操作过程中需要注意的问题, 使每位学员更深刻地了解了实时荧光定量 PCR 实验结束后, 学员们还学习了后续的数据分析流程, 填写了实验报告并将自己的结果与预期结果进行比较, 对超出靶值范围的实验结果进行了原因分析通过实验培训, 学员们不仅掌握了 PCR 技术的操作方法, 还学习了 PCR 相关的实验数据分析流程上海市临床检验中心

福建农业学报材料与方法毒株主要仪器主要试剂引物设计的培养反应条件的建立荧光定量检测临床样本结果与分析

福建农业学报材料与方法毒株主要仪器主要试剂引物设计的培养反应条件的建立荧光定量检测临床样本结果与分析福建农业学报林甦朱春华陈珍刘斌琼施少华江斌蔡国漳林羽黄瑜甦男硕士助理研究员主要从事病毒学和动物传染病学研究福建农业学报材料与方法毒株主要仪器主要试剂引物设计的培养反应条件的建立荧光定量检测临床样本结果与分析林甦等鸡亚型白血病病毒荧光定量检测方法的建立福建农业学报讨论林甦等鸡亚型白血病病毒荧光定量检测方法的建立责任编辑

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检验医学 2016 年 6 月第 31 卷第 6 期 Laboratory Medicine,June 2016,Vol. 31,No 区常见型别为 14d/f [6], 此结果与中国其他地区存在差异目前, 对妊娠梅毒基因分型的特点尚不明确, 且 2012 年至今未见关于上海地区