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寸宫
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1 2014 年 9 月 Vol.32 No.9 September 2014 Chinese Journal of Chromatography 1005 ~ 1012 研究论文 DOI: / SP.J 超高效液相色谱线性离子阱 / 静电场轨道阱高分辨质谱鉴别纺织品中禁用芳香胺及其异构体叶曦雯 1, 彭燕 2, 牛增元 1, 高永刚 1, 罗忻 1, 邹立 2 3, 周明辉 (1. 山东出入境检验检疫局, 山东青岛 ; 2. 中国海洋大学环境科学与工程学院, 山东青岛 ; 3. 广东出入境检验检疫局, 广东广州 ) 摘要 : 针对目前纺织品中禁用偶氮染料检测中的假阳性问题, 建立了一套应用超高效液相色谱线性离子阱 / 静电场轨道阱高分辨质谱 (UPLC LTQ / Orbitrap) 同时筛选 24 种禁用芳香胺及其常见的 14 种异构体的方法样品经连二亚硫酸钠还原, 叔丁基甲醚提取后, 以水 / 甲醇 (9 / 1, v / v) 稀释定容, 用 ZORBAX SB C 18 色谱柱 (150 mm 2 1 mm, 5 μm) 分离, 以 0 1% 甲酸水溶液和甲醇为流动相, 电喷雾正离子 ( ESI + ) 模式电离以准分子离子峰的精确质量数和保留时间定性, 以提取的色谱图峰面积定量 38 种芳香胺的线性相关系数大于 0 99, 方法检出限为 0 5~ 5 μg / kg 该方法可通过一次实验同时对 24 种禁用芳香胺及其常见的 14 种异构体准确定性定量, 大大缩短检测周期, 实际样品检测也进一步验证了其灵敏性和准确性关键词 : 超高效液相色谱 ; 线性离子阱 / 静电场轨道阱质谱 ; 高分辨质谱 ; 禁用偶氮染料 ; 同分异构体 ; 纺织品中图分类号 :O658 文献标识码 :A 文章编号 : (2014) Identification of banned aromatic amines and their isomers in textiles by ultra performance liquid chromatography linear ion trap / orbitrap high resolution mass spectrometry YE Xiwen 1, PENG Yan 2, NIU Zengyuan 1, GAO Yonggang 1, LUO Xin 1, ZOU Li 2, ZHOU Minghui 3 (1. Shandong Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau, Qingdao , China; 2. College of Environmental Science and Engineering, Ocean University of China, Qingdao , China; 3. Guangdong Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau, Guangzhou , China) Abstract: A method of ultra performance liquid chromatography linear ion trap / orbitrap high resolution mass spectrometry ( UPLC LTQ / Orbitrap MS) was used to screen and confirm 24 banned aromatic amines and their 14 isomers at the same time. The main factors influencing the separation including the column, and the nature of make up solvent were optimized. Under the optimized experimental conditions, the analytes were reduced to banned aromatic amine with sodium dithionite, extracted by methyl tert butyl ether and loaded onto a ZORBAX SB C 18 col umn (150 mm 2 1 mm, 5 μm) with a gradient elution of methanol and 0 1% formic acid aque ous solution, and finally detected by LTQ / Orbitrap MS. The screening and quantitative analysis were carried out by the accurate mass of quasi molecular ion and the peak in extracted chro matogram with accurate mass. The correlation coefficients were higher than 0 99 and the limits of detection were in the range of μg / kg. The method could screen and confirm the 24 banned aromatic amines and their 14 isomers at the same time. The results were 1 56 mg / kg of 4 chloroaniline, 0 34 mg / kg of o toluidine, and 0 81 mg / kg of 2,6 toluylenediamine with the relative standard deviations ranging from 0 27% to 1 32% in actual samples. The results indi cate that the developed method is simple, efficient and precise, and can be a reliable technique 通讯联系人.E mail:ye.xiwen@ 163.com. 基金项目 : 国家质检公益性行业科研专项基金项目 ( ); 双打中急需的出入境检验检疫技术方法研究项目 ( ); 国家质检总局科研项目 (2013IK015). 收稿日期 :

2 1006 色谱第 32 卷 for the separation of the 24 banned aromatic amines and their 14 isomers in textile samples. Key words: ultra performance liquid chromatography ( UPLC); linear ion trap / orbitrap mass spectrometer ( LTQ / Orbitrap MS); high resolution mass spectrometry ( HRMS); banned azo dyes; isomers; textile 禁用偶氮染料在一定条件下可以还原出致癌芳香胺, 这些致癌芳香胺通过改变人体 DNA 结构, 最终引起人体病变和诱发癌症 [1] 目前, Oeko Tex Standard 100 生态纺织品标准 [2] Eco label 生态纺 [3] 织品标签以及我国 GB 国家纺织产品基本安全技术规范 [4] 等对纺织品中的禁用芳香胺都有明确规定在实际检测中, 这些禁用芳香胺存在多种同分异构体, 然而这些同分异构体不在禁用之列, 异构体的存在带来的假阳性问题, 给日常检测工作增加了困难纺织品中 24 种禁用芳香胺的日常检测主要采用气相色谱质谱联用法 ( GC MS), 且大都采用非极性或极性较弱的色谱柱, 如 HP 5MS 和 DB 5MS 等 [5], 部分禁用芳香胺与其同分异构体在此条件下的色谱保留行为和质谱图都很相似, 很容易导致假阳性问题的产生 GB / T 纺织品禁用偶氮染料的检测 [6] 中规定 : 必要时, 选用另外一种或多种方法对异构体进行确认但对其中的哪些禁用芳香胺检出时可能会因异构体的存在而影响检测结果并未说明 [7] 日常检测中, 通常采用高效液相色谱二极管阵列检测 ( HPLC / DAD) 对检出的禁用芳香胺进一步定性采用两种方法互补分析既延长了检测周期又增加了检验成本, 降低了检验的效率至今, 很多关于禁用芳香胺与其异构体的分 [5,8-10] 离研究都无法在一种条件下将所有禁用芳香胺及其异构体同时分离开来, 因而没有得到全面有效的解决方案本文结合欧盟对纺织品的 REACH( 欧盟法规化学品的注册评估授权和限制 ) 召回案例及国内相关机构检测结果, 统计出近年来检出频率较高的禁用芳香胺主要有 13 种, 这其中 11 种存在异构体, 而市场有售标准品的仅为其中 8 种芳香胺的 14 种异构体本文建立了一套应用超高效液相色谱线性离子阱 / 静电场轨道阱高分辨质谱 ( UPLC LTQ / Orbitrap MS) 同时筛选 24 种禁用芳香胺及其常见的 14 种异构体的方法该方法利用一种检测仪器一次检测实现了禁用芳香胺与非禁用的同分异构体有效分离, 有效消除了同分异构体对检测的干扰该技术应用于实际检测有利于禁用芳香胺的准确定性定量, 有效提高检测效率 1 实验部分 1.1 仪器与试剂 ACQUITY Ultra Performance LC 超高效液相色谱仪 (Waters 公司 ), LTQ Orbitrap XL 线性离子阱静电场轨道阱组合质谱仪 ( Thermo 公司 ), 6890N / 5975C 型气相色谱 / 质谱联用仪 ( 美国 Agi lent 公司 ), SHA B 型恒温振荡器 ( 国华仪器 ), 0 22 μm 聚四氟乙烯 ( PTFE) 滤膜过滤头 ( DIKMA 公司 ), 叔丁基甲醚甲醇 ( 色谱纯,Merck 公司 ), 甲酸 ( 色谱纯, Fluka 公司 ), 芳香胺标准品 ( 纯度 > 99%, 美国 Aldrich 公司 ) 24 种芳香胺及其 14 种异构体标准溶液 : 分别准确称取适量的各标准品, 用甲醇溶解并定容, 配制成有效质量浓度为 mg / L 的标准储备液, 于 -18 下保存, 使用时, 用甲醇逐级稀释成标准中间液, 现用现配 1.2 实验方法样品前处理参照 GB / T 或 EN 对样品进行前处理, 取 10 μl 叔丁基甲醚的最终定容液并用水 / 甲醇 (9 / 1, v / v) 稀释定容至 1 ml, 用于上机检测色谱条件 ZORBAX SB C 18 色谱柱 (150 mm 2 1 mm, 5 μm); 流动相 A 为 0 1% 甲酸水溶液, B 为甲醇 ; 线性梯度洗脱程序 :0 ~ 1 min, 95% A ~ 90% A; 1 ~ 5 min, 90% A ~ 70% A; 5 ~ 6 min, 70% A ~ 5% A, 保持 4 min; 10 ~ 10 1 min, 5% A ~ 95% A, 保持 5 min 流速 :0 25 ml / min; 柱温 :30 ; 样品室温度 :15 ; 进样量 :10 μl 质谱条件可加热的电喷雾离子源 ( HESI Ⅱ); 毛细管温度 350 ; 鞘气 ( N 2 ) 压力 kpa, 辅助气 ( N 2 ) 流量 3 3 L / min; 正离子模式 : 喷雾电压 3 kv, 毛细管电压 30 V, 管状透镜电压 80 V 扫描方式 : 全扫描, 分辨率为 R = 种禁用芳香胺及其 14 种同分异构体的 UP LC LTQ / Orbitrap MS 分析参数见表 1 化合物筛选的离子提取窗口宽度为 (5 号和 6 号经还原后分别分解为邻甲苯胺和 2,4 二氨基甲苯 )

3 第 9 期叶曦雯, 等 : 超高效液相色谱线性离子阱 / 静电场轨道阱高分辨质谱鉴别纺织品中禁用芳香胺及其异构体 1007 表 1 24 种禁用芳香胺及其 14 种同分异构体的 UPLC LTQ / Orbitrap MS 分析参数 Table 1 UPLC LTQ / Orbitrap MS analysis parameters of the 24 banned aromatic amines and their isomers Number Compound CAS number Retention time / min Theoretical exact mass ( m / z) 1 4 aminobiphenyl ,4 benzidine ,3 benzidine ,2 benzidine chloro o toluidine naphthylamine naphthylamine o aminoazotoluene nitro o toluidine chloroaniline chloroaniline chloroaniline ,4 diaminoanisole ,4 diaminoanisole ,4 diaminodiphenylmethane ,3 diaminodiphenylmethane ,3 dichlorobenzidine ,3 dimethoxybenzidine ,3 dimethylbenzidine ,3 dimethyl 4,4 diaminodiphenylmethane p cresidine ,4 methylene bis (2 chloro aniline) ,4 oxydianiline ,4 thiodianiline o toluidine m toluidine p toluidine ,4 toluylenediamine ,6 toluylenediamine ,4 toluylenediamine ,3 toluylenediamine ,4,5 trimethylaniline methoxyaniline methoxyaniline methoxyaniline aminoazobenzene ,4 xylidine ,6 xylidine 结果与讨论 2.1 常见的含异构体的禁用芳香胺自 2005 年 1 月 1 日我国正式实施国家强制标准国家纺织产品基本安全技术规范 [4], 禁用了含有 23 种致癌芳香胺的偶氮染料以来, 整体印染产品的质量得到了全面改观, 禁用偶氮染料的检出率由之前的约 10% 下降到 1% 左右, 检出的芳香胺种类也大大下降 [11] 本文统计了本实验室和 3 家检测机构近 3 年来禁用偶氮染料的检出情况以及 REACH 召回案例中共 89 次阳性检出结果 ( 见表 2), 共计检出禁用芳香胺 13 种, 其中 4 氯邻甲苯胺 (3 号 ) 和 4,4 亚甲基双 (2 氯苯胺 ) (15 号 ) 和 2 甲氧基苯胺 (21 号 ) 仅检出一次, 检出频率低 ; 其他 10 种禁用芳香胺都有不同程度的检出, 检出频率较高 24 种禁用芳香胺中共有 14 种存在同分异构体, 如 4 氨基联苯联苯胺 4 氯邻甲苯胺等结合表 2 列出的日常检出情况, 本文筛选出了日常检测检出频率较高, 同时市场上有售的 8 种禁用芳香胺的 14 种异构体 ( 根据相关报道 [12,13], 将 2 甲氧基苯胺予以保留 ), 并对其在 GC MS( HP 5MS 色谱柱 ) 上的分离情况进行了考察, 结果见表 3 结果发现, 邻甲苯胺与间甲苯胺无法分离, 对氯苯胺与间氯苯胺 2,4 二氨基甲苯与 2,6 二氨基甲苯无法完全分离, 即单独采用 GC MS 分离, 无法达到对所有禁用芳香胺及异构体的一次性分离

4 1008 色谱第 32 卷 Number Table 2 Compound 表 2 禁用芳香胺的检出情况 Detection times of banned aromatic amines Detection times Our laboratory Another three testing institutions REACH recall 1 4 aminobiphenyl benzidine chloro o toluidine naphthylamine chloroaniline ,4 diaminoanisole ,4 diaminodiphenylmethane ,3 dichlorobenzidine ,3 dimethoxybenzidine ,3 dimethylbenzidine ,3 dimethyl 4,4 diaminodiphenylmethane p cresidine ,4 methylene bis (2 chloro aniline) ,4 oxydianiline ,4 thiodianiline o toluidine ,4 toluylenediamine ,4,5 trimethylaniline methoxyaniline aminoazobenzene ,4 xylidine ,6 xylidine : not detected. Table 3 表 3 部分禁用芳香胺及其异构体的 GC MS 分离情况 The detection of some banned aromatic amines and their isomers on GC MS Number Compound Isomer GC MS separation 2 benzidine 2,2 benzidine separated completely 3,3 benzidine 4 2 naphthylamine 1 naphthylamine separated completely 7 4 chloroaniline 2 chloroaniline 3 chloroaniline 8 2,4 diaminoanisole 3,4 diaminoanisole separated completely 9 4,4 diaminodiphenylmethane 3,3 diaminodiphenylmethane separated completely cannot be separated with 3 chloroaniline completely 18 o toluidine p toluidine cannot be separated with m toluidine m toluidine 19 2,4 toluylenediamine 2,6 toluylenediamine 2,3 toluylenediamine 3,4 toluylenediamine 21 2 methoxyaniline 3 methoxyaniline separated completely 2.2 色谱条件的优化色谱柱的优化 4 methoxyaniline 为了实现 24 种芳香胺及其 14 种同分异构体的有效分离, 根据相关文献 [14], 本文采用 0 1% 甲酸水溶液和甲醇为流动相, 比较了在 ZORBAX SB C 18 色谱柱 (15 cm 2 1 mm,5 μm) 和 Thermo C 18 色谱柱 (10 cm 2 1 mm,5 μm) 上的分离效果, 结果发现, 两种不同品牌不同型号的色谱柱仅对邻甲苯胺 2,4 二氨基甲苯 2 甲氧基苯胺及其异构体的分离影响较大, 而对其他芳香胺及其异构体无显著影响, 如图 1 所示, 采用 ZORBAX SB C 18 色谱柱可以更好 cannot be separated with 2,6 toluylenediamine completely 地对该 3 种物质进行分离因此, 本文选用 15 cm 的 ZORBAX SB C 18 色谱柱定容溶剂的选择实际样品检测过程中, 芳香胺的提取试剂是叔 [15] 丁基甲醚据文献报道, 在用液相色谱法检测禁用芳香胺时可以用叔丁基甲醚提取液直接进样分析, 无需更换为甲醇, 既节约成本又提高了检测效率基于此, 本文对比了采用水 / 甲醇 (9 / 1, v / v) 和叔丁基甲醚分别作为溶剂时的色谱分离, 结果发现, 采用叔丁基甲醚作溶剂时,4 号 2 萘胺和 7 号对氯

5 第 9 期叶曦雯, 等 : 超高效液相色谱线性离子阱 / 静电场轨道阱高分辨质谱鉴别纺织品中禁用芳香胺及其异构体 1009 Fig. 1 图 1 采用 ZORBAX SB C 18 和 Thermo C 18 色谱柱时的分离效果 Chromatograms on ZORBAX SB C 18 and Thermo C 18 columns a. o toluidine and its isomers; b. 2,4 toluylenediamine and its isomers; c. 2 methoxyaniline and its isomers. ZORBAX SB C 18 column: 15 cm 2 1 mm, 5 μm; Thermo C 18 column: 10 cm 2 1 mm, 5 μm. 苯胺与其异构体无法分离 3 号对氯邻甲苯胺不出峰因此, 前处理方法中用叔丁基甲醚定容之后, 需用水 / 甲醇 (9 / 1, v / v) 大比例稀释定容, 以消除溶剂效应, 减少基体干扰种芳香胺的色谱分离 24 种禁用芳香胺及其 14 种同分异构体的分离色谱图如图 2 所示采用本方法可以将 24 种禁用芳香胺与其常见异构体一次性分离开来, 表 1 中 18 号 19 号和 21 号芳香胺与其同分异构体没有完全分离, 但仍可以满足定性需要部分芳香胺的保留时间接近, 但因其质量数不同, 高分辨质谱仍可通过提取一级质谱的精确质量数对其进行准确定性整个分离可在 15 min 之内完成, 与 GC MS 和 HPLC 相比, 仅为其检测周期的 1 / 线性关系及检出限采用 Orbitrap 高分辨质谱对 38 种芳香胺进行定量分析, 根据各化合物的响应情况, 将 38 种芳香胺的标准溶液用水 / 甲醇 (9 / 1, v / v) 稀释成合适浓度的系列标准工作液, 以其质量浓度和峰面积绘制标准曲线因高分辨质谱提取精确质量数, 基线噪声低, 以 S / N 计算的检出限和定量限与方法的真实性能可能存在差距, 因此本实验用空白基质提取液逐级稀释标准溶液至仪器所能检出的最低浓度, 换算为方法的检出限 [16], 结果如表 4 所示 2.5 实际样品的检测采用本文方法检测了多个实际阳性样品与 GC MS 检测 HPLC 确证的常规方法相比, 本文利用一种检测仪器一次检测即可同时分离 24 种禁用芳香胺及其同分异构体, 并能准确定性定量, 方法快速有效图 3a c e 分别是含有对氯苯胺邻甲苯胺和 2,6 二氨基甲苯的阳性样品及其同分异构体的标准溶液在 GC MS 上的检测结果图 3a 中样品的色谱峰与标准的对氯苯胺和间氯苯胺有重合, 但对氯苯胺与间氯苯胺在 GC MS 上无法完全分离 ; 图 3c 中邻甲苯胺与间甲苯胺无法分离, 从样品与标准的 GC MS 色谱图对照中无法判别检出物是邻甲苯胺还是间甲苯胺 ; 图 3e 中 2,6 二氨基甲苯与 2,4 二氨基甲苯无法完全分离因此, 单独采用 GC MS 无法准确定性, 常规检测还需要采用 HPLC 进一步确证而采用本方法可以一次性完成上述物质的完全分离, 如图 3b d f 所示, 样品与标准的对照色谱图清晰地显示了结果, 无需再用其他仪器确证样品的检出结果见表 5

6 1010 色谱第 32 卷 Fig. 2 图 2 禁用芳香胺及其同分异构体的色谱分离情况 Chromatograms of banned aromatic amines and their isomers

7 第 9 期叶曦雯, 等 : 超高效液相色谱线性离子阱 / 静电场轨道阱高分辨质谱鉴别纺织品中禁用芳香胺及其异构体 1011 Fig. 3 图 3 阳性样品在 (a,c,e) GC MS 和 (b,d,f) UPLC LTQ / Orbitrap 的检出结果 Chromatograms of the positive samples on (a, c, e) GC MS and (b, d, f) UPLC LTQ / Orbitrap 表 4 禁用芳香胺及其异构体的线性范围相关系数 (R 2 ) 和检出限 Table 4 Linear ranges, correlation coefficients (R 2 ) and LODs of the banned aromatic amines and their isomers Number Compound Linear range / (μg / L) R 2 LOD / (μg / kg) 1 4 aminobiphenyl ,4 benzidine ,3 benzidine ,2 benzidine chloro o toluidine naphthylamine naphthylamine chloroaniline chloroaniline chloroaniline

8 1012 色谱第 32 卷表 4 ( 续 ) Table 4 ( Continued) Number Compound Linear range / (μg / L) R 2 LOD / (μg / kg) 8 2,4 diaminoanisole ,4 diaminoanisole ,4 diaminodiphenylmethane ,3 diaminodiphenylmethane ,3 dichlorobenzidine ,3 dimethoxybenzidine ,3 dimethylbenzidine ,3 dimethyl 4,4 diaminodiphenylmethane p cresidine ,4 methylene bis (2 chloro aniline) ,4 oxydianiline ,4 thiodianiline o toluidine m toluidine p toluidine ,4 toluylenediamine ,6 toluylenediamine ,4 toluylenediamine ,3 toluylenediamine ,4,5 trimethylaniline methoxyaniline methoxyaniline methoxyaniline aminoazobenzene ,4 xylidine ,6 xylidine Not banned aromatic amines. 表 5 阳性纺织样品的检测结果 Table 5 Results of positive textile samples Number Composition Compound Content / (mg / kg) RSD / % (n = 3) % cotton; 11.3% artificial cotton; 24.4% dacron 4 chloroaniline % cotton; 33.5% polyester; 4.9% spandex o toluidine % viscose; 26.1% polyeste; 2.5% spandex 2,6 toluylenediamine 结论本文建立的应用 UPLC LTQ / Orbitrap 同时筛选 38 种芳香胺的方法实现了采用一种方法同时对 24 种禁用芳香胺及其异构体的定性定量, 相比日常检测中 GC MS 和 HPLC 结合的方法, 该方法快速有效, 可以避免更换仪器带来的检测周期延长, 实际样品检测也验证了方法的灵敏性和准确性参考文献 : [1] Cui Q H, Zhao G A, Wang X L. China Fiber Inspection ( 崔庆华, 赵桂安, 王学利. 中国纤检 ), 2011(12): 42 [2] Oeko Tex Standard 100 [3] 2002 / 371 / EC [4] GB [5] Ji H. Dyestuffs and Coloration ( 季浩. 染料与染色 ), 2007, 44(6): 54 [6] GB / T [7] Lu Y, Ye L H, Han G F. China Fiber Inspection ( 卢鸯, 叶琳虹, 韩高锋. 中国纤检 ), 2011(10): 56 [8] Zhao S, Zhang J. Shanghai Silk ( 赵嵩, 张菁. 上海丝绸 ), 2010(1): 7 [9] Cui Q H, Yang X Y, Tian J J. China Textile Leader ( 崔庆华, 杨晓勇, 田金家. 纺织导报 ), 2010(3): 106 [10] Zhu F, Shi D W. Quality and Technical Supervision Research ( 朱峰, 施点望. 质量技术监督研究 ), 2010( 3): 39 [11] Gao M. Dyeing and Finishing ( 高铭. 印染 ), 2011, 37(4): 40 [12] A Y. Progress in Textile Science Technology ( 阿阳. 纺织科技进展 ), 2007(6): 7 [13] Wang C Y, Shen Y L, Lin J F, et al. Shanghai Textile Sci ence & Technology ( 王成云, 沈雅蕾, 林君峰, 等. 上海纺织科技 ), 2013, 41(7): 56 [14] Yun H, Liu X, Wang J, et al. Chinese Journal of Chroma tography ( 云环, 刘鑫, 王静, 等. 色谱 ), 2013, 31(9): 845 [15] Fang R Q, He M C, Ou Y. et al. Journal of Xiamen Univer sity: Natural Science ( 方荣谦, 何明超, 欧延, 等. 厦门大学学报 : 自然科学版 ), 2011, 50(Suppl): 53 [16] Xiu X L, Luo X, Niu Z Y. et al. Chinese Journal of Chroma tography ( 修晓丽, 罗忻, 牛增元, 等. 色谱 ), 2013, 31 (10): 961

DOI /j.issn Food Research And Development UPLC-MS/MS 5 0.

DOI /j.issn Food Research And Development UPLC-MS/MS 5 0. 118 217 5 38 1 DOI 1.3969/j.issn.5-6521.217.1.28 Food Research And Development 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1. 731 2. 731 - UPLC-MS/MS 5. 1 mol/l ProElut PXC 5 % - Thermo Hypersil Gold mm 2.1 mm 1.9 μm ESI