Microsoft Word - CyDye mono-reactive NHS Esters

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急刘
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1 CyDye mono-reactive NHS Esters( 菁染料琥珀酰亚胺酯 ) 1. 产品简介 : 菁染料是性能优良的荧光标记染料, 摩尔吸光系数在荧光染料中是最高的, 其琥珀酰亚胺酯是最常用的脂肪氨基标记试剂, 广泛用于蛋白抗体核酸及其他生物分子的标记和检测通过改变次甲基链的长度, 可改变其荧光发射波长, 每增加一个双键, 按照 Huoffman 规则正好红移约 100nm 菁染料 Cy3 和 Cy5 已成为基因芯片的首选荧光标记物 ; 另外,Cy5, Cy5.5 和 Cy7 的吸收在近红外区背景非常低, 是荧光强度最高最稳定的长波长染料特别适合于活体小动物体内成像代替放射性元素但由于菁染料, 尤其是不对称菁染料的合成副反应多, 副产物极性相近, 产物的分离提纯相当困难菁染料特别是水溶性菁染料分子极性大, 分离提纯越加困难图 1. 脂溶性菁染料琥珀酰亚胺酯的结构式图 2. 水溶性菁染料琥珀酰亚胺酯的结构式图 3 菁染料琥珀酰亚胺酯的激发和发射波长光谱图

表 1. 菁染料琥珀酰亚胺酯的性质参数 Cy3 Cy3.5 Cy5 Cy5.5 Cy7 脂溶性菁染料 SE 分子量 568.73 668.84 594.76 694.88 620.80 水溶性菁染料 SE 分子量 765.95 1234.54 791.99 1260.58 818.

2 表 1. 菁染料琥珀酰亚胺酯的性质参数 Cy3 Cy3.5 Cy5 Cy5.5 Cy7 脂溶性菁染料 SE 分子量水溶性菁染料 SE 分子量最大吸收波长 (nm) 摩尔吸光系数 (M -1 cm -1 ) 最大发射波长 (nm) A 280nm /A max 8% 24% 5% 18% 11% 2. 菁染料琥珀酰亚胺酯 (CyDye NHS) 的标记菁染料和生物分子的比例 F/P=4~12 之间荧光强度最高, F/P 值过高荧光探针会自我淬灭并影响生物分子的生物活性, 标记生物分子最好是用单琥珀酰亚胺酯, 但是用双修饰的 CyDye NHS 并没有发现交联 CyDye NHS 标记抗体在 ph (8.5~9.4) 时 10 分钟 F/P 可达 5~6, 而在 ph 7.0 几乎不反应我们用不同比例的 Cy3 标记 anti-glutathione-s-transferase (GST) 多克隆抗体发现用 1:1, 5:1, 10:1 和 20:1 标记时得到的 F/P 值分别是 0.28:1, 1.16:1, 2.3:1 和 4.6:1 3. 操作步骤 3.1 水溶性 Cy3 NHS 标记 anti-gst 多克隆抗体市场上买到的抗体如果含有其它蛋白 ( 例如 serum albumin 或 gelatin 等 ) 或带氨基的缓冲液会影响标记, 在标记前需纯化 1. 在 1 L 0.15 M NaCl 溶液中透析 anti-gst 抗体 ( 浓度为 0.5 ml at 3 mg/ml), 常温透析 4 小时 2. 在 4 C 用新鲜的 1 L 0.15 M NaCl 溶液再透析过夜 3. 第二天用 1 L 0.1 M NaHCO 3 (ph 8.3) 透析 4 小时 4. 用 0.22 μm 注射器过滤头过滤抗体溶液 5. 用 0.1 M NaHCO 3 稀释少量的抗体, 在 280nm 处测其紫外吸收值计算标记抗体的总量 (IgG antibody 摩尔吸光系数 M -1 cm -1 at 280 nm). 6. 用 DMSO 配置 Cy3 NHS (MW ) 溶液浓度为 10 mg/ml; 计算所需体积以得到想要的 CyDye

3 NHS 和抗体的比值 ( 例如 20:1), 然后慢慢将其加入到抗体溶液中, 同时在暗处常温缓慢搅拌 45 分钟 7. 用 1 L 0.15 M NaCl 溶液常温避光透析 4 小时除去未标记上的 Cy3 8. 在 4 C 用新鲜的 1 L 0.15 M NaCl 溶液再避光透析过夜 9. 用 1 L of 0.01 M PBS/ 0.01% 叠氮化钠溶液常温避光透析 4 小时, 在 4 C 常温避光再次透析过夜 10. 用 0.22 μm 注射器过滤头过滤抗体溶液 11. 用 0.01 M PBS/0.01 % 叠氮化钠整数倍稀释标记抗体溶液, 测量 280nm( 蛋白 ) 和 552nm(Cy) 处的紫外可见吸光度 12. 产品冷冻干燥成粉末或在 0.01 M PBS/ 0.01% 叠氮化钠溶液中,-20 避光储存 F/P 计算 : Cy3 在 552nm 摩尔吸光系数为 M -1 cm -1 ; 此蛋白在 280nm 的摩尔吸光系数为 M -1 cm -1 ; 不同蛋白的摩尔吸光系数不一样 ;.Cy3 染料本身在 280 nm 的吸收是 552nm 处的 8% 按以下公式计算 F/P 值 [Cy3] = A 552 / [antibody] = {A (0.08 A 552 )}/ F/P final = [Cy3]/[antibody]= {1.13 A 552 }/ {A (0.08 A 552 )} 3.2 水溶性 Cy5 NHS 标记 (D-ser 2 )-leucineenkephalin 1. Cy5 NHS 1.0 mg 溶解于 400 μl DMSO 后, 加入到 1mL 的玻璃瓶中盛有 (D-ser 2 )-leucine-enkephalin acetate (YSGFLT, 0.75 mg) 的 400 μl DMSO 溶液 (Dye 和 peptide 投料比是 1:1) 2. 然后加入 15 μl 三乙胺, 常温避光搅拌反应混合物过夜 3. 用 HPLC 纯化蛋白, 使用蛋白 C18 柱子 (25 cm 10 mm), 每次上样注入 μl,30 分钟梯度洗脱从 0.1% TFA 水溶液到 MeCN H 2 O(0.1% TFA)=70 30, 流速 4mL /min ( 对不同的蛋白选择不同的合适 HPLC 梯度流动相 ) 4. 收集适当的色带峰, 标记多肽的保留时间比未标记的多肽长 5. 产品冷冻干燥成粉末或在水溶液中,-20 避光储存 ; 必要时可用质谱表征 6.CyDye 标记的蛋白稳定性取决于蛋白本身例如标记的 IgG 在 4 可避光保存 2 月 ; 更长期的保存需加入等体积的甘油 -20 避光保存 F/P 计算 : Cy5 在 650 nm 的摩尔吸光系数为 M -1 cm -1, 所用蛋白在 280 nm 处的摩尔吸光系数为 M -1 cm -1 ;Cy5 在 280nm 处的吸收是 650nm 处的 5% 按以下公式计算 F/P 值 [Cy5 dye] = (A 650 )/ [peptide] =[A 280 -(0.05 A 650 )]/

F/P final = [dye]/[peptide]= {0.68 A 650 }/ {A 280 - (0.05 A 650 )} 3.3 水溶性 CyDye SE 标记 OLIGO 氨基封端的 OLIGO 可以标记 CyDye SE, 但是非常困难 ; 标记前因为 OILGO 经氨水脱保护, 请务必洗涤掉所有的残余氨水然后将样品真空干燥 ; 然后溶于 0.25 ml 的 0.

4 F/P final = [dye]/[peptide]= {0.68 A 650 }/ {A (0.05 A 650 )} 3.3 水溶性 CyDye SE 标记 OLIGO 氨基封端的 OLIGO 可以标记 CyDye SE, 但是非常困难 ; 标记前因为 OILGO 经氨水脱保护, 请务必洗涤掉所有的残余氨水然后将样品真空干燥 ; 然后溶于 0.25 ml 的 0.5 M NaCl 溶液中, 用 Sephadex G-50 脱盐, 用 5.0 mm borate 缓冲液平衡到 ph=8.0, 然后用以上硼酸缓冲液冲下 OLIGO 然后浓缩至干的样品溶于 0.1 M carbonate buffer (ph ); 在 0.5mL 碳酸缓冲液中 30 nmoles 的 OLIGO 加入到 CyDye SE 的玻璃瓶中室温避光, 密闭搅拌反应 60min 反应物经 Sephadex G-50 或 RP-HPLC 过柱纯化, 冷冻干燥后避光保存注意 :Oligonucleotides 和 oligopeptides 由于太小经常会留在过滤膜上或在冻存管内贴壁成膜, 而无法标记 3.4 小动物活体成像领域的应用活体动物体内成像技术是指应用影像学方法, 对活体状态下的生物过程进行组织细胞和分子水平的定性和定量研究的技术小动物活体成像是近年来在生物医药方面非常活跃和前沿的领域, 在研究细胞行为, 药物活性和代谢, 疾病的进展等方向取得了革命性的进步分为生物发光成像 ( 以 Caliper 和 Xengon 仪器为代表 ) 和荧光成像 ( 以 KODAK 和 CRI 仪器为代表 ) 上海俊晟生物科技有限公司提供近红外的荧光成像染料及其与小分子药物和生物大分子的荧光标记服务, 并提供生物发光底物虫荧光素 (D-luciferin) 和腔肠素 (coelentarizine) 1. 荧光成像的推荐步骤 : 1)SPF 级 BALB/C 裸鼠,6~8 周龄,18~20 克, 实验前 24 h 自由进食饮水 2) 于实验裸鼠腹腔内注射 2% 戊巴比妥钠 300μL(215 mg/ kg) 麻醉动物将裸鼠俯卧位平放于小动物多光谱活体成像系统的记录暗箱中实验时将 Cy7 或 Cy7 标记的生物分子或药物最好溶于水 ( 或甲醇 / 乙醇 / 乙二醇, 有时 DMSO 200uL 能把小鼠杀死 ) 稀释后, 于裸鼠尾静脉注射 200μL( 浓度 0.5 mg/ml)[ 最佳用量和时间需要客户根据自己的仪器和药物试剂等条件优化 ] 每 5min 记录 1 张动物在体内发射荧光的成像图片, 分析荧光药物的分布情况对照鼠不注射药物, 进行同时记录记录结束后迅速解剖裸鼠的心肝脾肺肾等脏器, 进行成像

5 3)Cy7 检测时激发波长 700~770 nm 带通, 发射波长 790 nm 长通液晶可调谐滤光片扫描范围 780~ 950 nm, 扫描步进 10 nm 曝光时间为 500 ms 不同的药物代谢时间不一样, 注射入裸鼠体内, 荧光立即分布全身, 然后逐步向膀胱聚集, 呈现显著的肾排泄的特点一般 4~6 小时, 快的只有 30 分钟 ; 如果是骨骼和鼻腔等部位靶点的 Cy7 标记药物, 有客户反映一周后活体成像系统仍能检测到荧光成像器官切片观察 : 将解剖的器官迅速放置于 4% 多聚甲醛固定 4 小时以上,0%,20%,30%PBS 蔗糖依次沉底,20μm 切片, 多聚赖氨酸洗过的载玻片贴片, 晾干,DAPI 染色共聚焦显微镜观察, 激光器为氦氖 633 nm 2. 荧光成像常见问题 1) 什么类型的小鼠适合活体成像? 毛发对光有散射, 建议用裸鼠 2) 给裸鼠注射的最佳和最大注射试剂体积? 试剂的体积用量根据所采取的方式不同而不同, 下面是体重 25g 的裸鼠注射量 Route Recommended Maximal 静脉注射 Intravenous (IV) 50~125 µl 200 µl 腹腔注射 Intraperitoneal (IP) 500 µl 2 ml 皮下注射 Sub-cutaneous (SC) 100~250 µl 1 ml 3) 注射针头的尺寸是多少? 推荐使用具有固定针头的 28~32 号结核菌素或胰岛素注射器 (0.3 或 1mL) 4) 肿瘤成像需要注射多大剂量的标记抗体? 推荐起始用量 50µg 来优化最佳用量 5) 未标记的染料在老鼠体内如何代谢? 未标记水溶性染料通过膀胱排泄, 静脉注射后最快能在 3min 检测到膀胱内的荧光信号 6) 注射后多长时间开始成像? 成像时间和成像持续时间与注射试剂有关血管示踪剂注射后马上即可成像并持续成像数小时注射标记的抗体 IgG 到达靶点需要数小时, 而后才成像并持续成像数天 7)Super Fluor dyes 的荧光寿命是多少? Super Fluor 647 在 20 C 水中 τ=1 ns Super Fluor 680 在 20 C 水中 τ=1.2 ns Super Fluor 750 在 20 C 水中 τ=0.7 ns 8) 推荐小动物活体成像的网站

6 4. 稳定性与储存 : 未开封的粉末在避光干燥 -20 存放 12 月 CyDye NHS 水溶液现配现用不能储存任何溶解后的 CyDye NHS 粉末最好立即使用 ; 绝对无水的 DMSO 溶液 -20 C 保存最多 2 个星期相关产品 : Cy 系列 : 目录号产品名称 Ex(nm) Em(nm) 产品描述 1050 Cy mg 1051 Cy3, SE mg 1053 Cy 活体成像用试剂 5 mg 1054 Cy5, SE 活体成像用试剂 1 mg 1056 Cy 活体成像用试剂 5 mg 1057 Cy5.5, SE 活体成像用试剂 1 mg 1058 Cy 活体成像用试剂 5 mg 1059 Cy7, SE 活体成像用试剂 1 mg 规格 Super Fluor 系列 :Cy 系列升级产品 ( 与 Invitrogen 的 Alexa Fluor 系列完全相同 ) 目录规格产品名称 Ex(nm) Em(nm) 产品描述号 1003 Super Fluor FAM 的升级产品 5 mg 1023 Super Fluor 488, SE FITC 的升级产品 1 mg 1006 Super Fluor Cy3 的升级产品 5 mg 1028 Super Fluor 555, SE Cy3, SE 的升级产品 1 mg 1009 Super Fluor Cy5 的升级产品 5 mg 1031 Super Fluor 647, SE Cy5, SE 的升级产品 1 mg 1012 Super Fluor Cy5.5 的升级产品 5 mg 1035 Super Fluor 680, SE Cy5.5, SE 的升级产品 1 mg 1015 Super Fluor Cy7 的升级产品 5 mg 1037 Super Fluor 750, SE Cy7, SE 的升级产品 1 mg

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Microsoft Word - Cy.SE 系列说明书-2016 Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd Tel: 010-56371207 Solarbio Fax: 010-56371281/82 Http://www.solarbio.cn CyDye mono-reactive NHS Esters 菁染料琥珀酰亚胺酯产品说明菁染料是性能优良的荧光标记染料摩尔吸光系数在荧光染料中是最高的其琥珀酰亚胺酯是