2010,30(8) 张海涛等 : 几丁质酶产生菌筛选鉴定及产酶性能研究产酶菌株的筛选将采自青岛等地的土样加无菌生理盐水并用玻璃珠打散, 稀释, 分别涂布于 LB 培养基,PDA 培养基, 高氏一号培养基,30, 培养 24h 仔细观察各平板上长出的菌落, 小心挑出单菌落并重新划线

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裟蓬
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1 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology,2010,30(8):82 87 几丁质酶产生菌筛选鉴定及产酶性能研究张海涛王婷田囡刘新利 ( 山东轻工业学院山东省微生物工程重点实验室济南 ) 摘要从土壤样品中筛选得到一株高产几丁质酶菌株 C65 2, 经形态学观察和 18SrDNA 序列测定, 鉴定为 Aspergilusfumigatus, 对产酶培养基进行初步优化, 测得最高酶活可达 6.9U/ml, 酶活力较优化之前提高了 210% 酶学性质研究表明该几丁质酶分子量约为 20kDa, 酶在 60 下保温 50min 酶活降为 0, 最适酶反应温度是 55, 酶反应最适 ph 为 7.0,Mg 2+,Cu 2+ 对酶反应有促进作用,Fe 3+ 对酶反应有抑制作用关键词几丁质几丁质酶烟曲霉产酶特征中图分类号 Q93 3 几丁质 (Chitin) 又称甲壳素甲壳质, 是以 β 1,4 N 乙酰氨基葡萄糖为基本单位的直链多聚物, 其含量居天然聚合物第二位, 每年生物合成量约为 100 亿吨 [1] 几丁质的降解产物几丁寡糖壳低聚糖和 N 乙酰氨基葡萄糖具有抗菌抗肿瘤等活性, 因而具有广泛的应用前景 [2 3] 利用化学方法对几丁质进行降解, 其工艺过程中产生大量的酸碱废液, 不仅会对环境造成较大的污染, 而且工艺过程较难控制高分子聚合物降解的程度, 造成产物混杂, 产物生物学活性难以保证生物酶法降解利用甲壳素生物质资源是人类目前在新材料新医药等领域的研究热点之一尽管已有文献报道, 产生几丁质酶的微生物种类很多, 许多细菌真菌还有放线菌均可以产生几丁质酶, 其中芽孢杆菌 (Bacilus) 是一类重要的几丁质酶生产菌 [4] 但是, 目前还没有高效菌株在工业生产上广泛使用, 自然界存量较大的几丁质资源亟待降解利用, 因此, 几丁质酶产生菌的筛选和产酶条件研究工作具有重要的意义 1 材料与方法 1.1 培养基菌种分离和保藏培养基 :LB 培养基,PDA 培养基, 收稿日期 : 修回日期 : 山东省中青年科学家科研奖励基金 (2007BSB01350) 山东省教育厅科技计划 (J07YGO4) 资助项目通讯作者, 电子信箱 :vip.lxl@163.com 高氏一号培养基几丁质酶筛选培养基 ( 胶体几丁质培养基 ): 胶体几丁质 1.5%,KH 2 PO 4 0.1%, 酵母粉 0.3%, 琼脂 1.5%,(NH 4 ) 2 SO 4 0.1%,MgSO 4 5H 2 O 0.03%,pH7.0 胶体几丁质制备 : 将 5g 细粉几丁质溶于 88ml 浓盐酸中, 此几丁质成胶状, 在 4 放置 24h 然后用玻璃纤维过滤到 500ml 去离子水中, 同时搅拌, 离心, 将其洗至中性, 最后加适量去离子水高压灭菌后保存种子培养基 : 葡萄糖 0.2%, 蛋白胨 0.5%, 酵母膏 0.2%,K 2 HPO %,KH 2 PO %,NaCl0.05%, MgSO 4 7H 2 O0.05%,pH7.0 发酵培养基 :NH 4 NO %,NaCl0.05%, KH 2 PO %,MgSO 4 7H 2 O0.05%,FeSO 4 7H 2 O 0.001%, 粉末几丁质 1% 1.2 几丁质酶活力测定方法酶活单位定义 :45 水浴保温条件下, 每小时产生 1 μmol 乙酰氨基葡萄糖所需酶量定为一个酶活力单位测定方法 : 发酵液 5000r/min 离心 10min, 取上清液 ( 粗酶液 )1ml, 加入 1mlpH6.0 磷酸缓冲液中, 然后向酶液中加入 1ml1% 胶体几丁质,45 水浴保温 60min 后迅速煮沸终止酶反应,5000r/min 离心 10 min, 取 1ml 上清液加入 2mlDNS 放入 100 沸水浴中加热 10min, 冰水迅速冷却, 加 9ml 蒸馏水, 以灭活的酶液为空白,540nm 测 OD 值根据 DNS 法作 N 乙酰氨基葡萄糖标准曲线计算出酶活力

2 2010,30(8) 张海涛等 : 几丁质酶产生菌筛选鉴定及产酶性能研究产酶菌株的筛选将采自青岛等地的土样加无菌生理盐水并用玻璃珠打散, 稀释, 分别涂布于 LB 培养基,PDA 培养基, 高氏一号培养基,30, 培养 24h 仔细观察各平板上长出的菌落, 小心挑出单菌落并重新划线接入原相应培养基中继续培养, 重复直至镜检为纯种为止, 接入相应斜面培养基,4 冰箱保藏将纯化后的菌种, 分别接入胶体几丁质筛选培养基中,30, 培养 24h, 挑选透明圈较大的菌株作为初筛菌株然后将初筛菌株接入种子培养基中,30, 培养 24h, 然后 2% 接种量接入发酵培养基中进行产酶能力的验证,30, 培养 48h, 测定酶活力 1.4 产酶菌株的鉴定针对产酶活力最高的菌株进行菌落及细胞形态观察, 然后检测其 18SrDNA 序列进行种属鉴定将实验菌株的菌丝体冻干, 液氮研磨后转移至 EP 管中, 参考 [5] Laura 等的方法提取基因组 DNA 作为 PCR 反应的模板, 采用真菌 18S rdna 通用引物 NS1(5 GTAGTCATATGCTTGTCTC 3 ) 及 NS8 ( 5 TCCGCAGGTTCACCTACGGA 3 ) 通过标准的 PCR 反应体系扩增供试菌的 18SrDNA 片段用 1% 的琼脂糖电泳,EB 染色后, 观察 18SrDNA 条带采用 pgem T easyvectorsystem 将 18SrDNA 与 pgem T 连接连接产物转化 DH5α, 挑取转化子, 阳性质粒送上海生工测序中心测序 1.5 产酶条件的初步优化将鉴定的菌种接种种子培养基, 在 30,150r/min 转速条件下培养 36h, 接入发酵培养基中进行产酶条件优化在 30,150r/min 转速条件下, 发酵培养基依次采用几丁质几丁糖和胶体几丁质作为底物, 试验其诱导产酶效果 ; 依次变换发酵培养基的氮源为玉米浆酵母浸粉硝酸铵, 试验不同氮源对产酶的影响 ; 试验装液量培养基初始 ph 以及培养时间对产酶的影响, 以上优化实验均做三个平行实验, 以本文 1.2 节中的方法检测最终发酵液的几丁质酶活力作为判定指标 1.6 酶的分离纯化及部分酶学性质研究酶的分离及纯化将发酵液用布氏漏斗过滤, 收集滤液, 加 40% 硫酸铵,4000r/min 离心, 取清液并向清液内追加硫酸铵到 70%, 放入 5 冰箱内过夜, 4000r/min 离心, 用 ph6.0 磷酸缓冲液溶解沉淀, 用截留分子量 8000~14000D 透析袋透析 48h, 然后用旋转蒸发器 50 浓缩, 再进行 SephadexG100 柱层析, 凝胶柱床体积 400ml, 上样量 4ml, 流动相 ph6.0 磷酸缓冲液, 流速 1ml/min, 检测波长 280nm, 收集出峰组分, 分别检测各组分的酶活力, 然后将有活性的组分浓缩进行 SDS PAGE 电泳检测酶的热稳定性和酶解最适温度检测将收集的酶液分别在 60,65,70,75,80 水浴下保温, 从 10min 开始每隔 10min 检测不同温度条件下的酶活, 试验酶的热稳定性取 1ml 酶液分别加入 1ml ph6.0 磷酸缓冲液中和 2ml2% 胶体几丁质, 分别在 30,35,40,45,50,55,60,65,70 条件下反应, 测不同温度条件下的酶活, 试验酶解最适温度金属离子浓度和 ph 值对酶活力的影响取 1ml 酶液加入 1mlpH6.0 磷酸缓冲液中和 2ml2% 胶体几丁质, 然后加入一定量金属盐, 使 Mg 2+,Cu 2+,Fe 3+ 金属离子浓度达到 50mmol/L,55 水浴 1h 后迅速冷却,6000r/min 离心 10min, 取上清测酶活取 1ml 酶液加入 1mlpH 为 1 至 10 的不同磷酸缓冲液中, 然后分别加入 2ml2% 胶体几丁质,55 水浴 1h 后迅速冷却,6000r/min 离心 10min, 取上清测酶活 2 结果 2.1 产酶菌株的筛选从土壤样品中分离保藏了 156 种菌株, 根据形态学判定其中细菌 38 株, 放线菌 67 株, 真菌 51 株利用胶体几丁质筛选平板检测能产透明圈的菌株共 35 种, 其中透明圈较大的有 4 株, 分别为 C65 2,G15 2,L63 4,G38 4, 其菌落形态如图 1 所示进一步在胶体几丁质培养基中比较其透明圈直径, 在产酶培养基中验证其产酶能力,DNS 法测酶活, 实验结果如表 1 所示表 1 产酶菌株筛选平板透明圈大小和酶活力 Table1 Transparentzonesizeofchitinaseproducer onscreeningplateandenzymaticactivity 菌种编号透明圈直径和菌落直径比酶活 (U) C G L G 实验数据显示, 与 G15 2,L63 4,G38 43 个菌株相比, 菌株 C65 2 产几丁质酶能力最强 2.2 菌种 C65 2 鉴定形态学观察 C65 2 生长速度快, 在 PDA 培养基上培养 3~4 天菌落直径达 2~3cm, 开始菌落呈白

84 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.30No.82010 图 1 4 种产酶菌株的菌落形态 Fig.

图 2 C65 2 分生孢子孢子梗顶囊形态 (bar=5μm) Fig.2 Conidiospore,conidiophoreandacrocyst ofstrainc65 2(bar=5μm) 2.2.2 分子生物学检测以通用的 NS1 和 NS8 作为引物, 通过 PCR 反应, 得到 C65 2 的 18SrDNA 18S 电泳 Marker 为 TRANS 的

3 84 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.30No 图 1 4 种产酶菌株的菌落形态 Fig.1 Colonyoffourchitinaseproducer A:L63 4;B:G38 4;C:C65 2,D:G15 2 色绒毛样, 培养后期菌落逐渐变为烟绿色菌丝无横隔, 不产生菌核, 菌丝直径 4~7μm; 孢子梗直径 5~8 μm; 顶囊烧瓶型, 头部直径 30~35μm; 小梗生于顶囊中上部, 单层, 小梗长 6~8μm, 小梗粗 2.5~3.0μm, 排列紧密 ; 分生孢子近似球形, 大小不均一, 直径 2~3 μm, 孢子颜色浅绿色至灰绿色 ( 图 2) 图 2 C65 2 分生孢子孢子梗顶囊形态 (bar=5μm) Fig.2 Conidiospore,conidiophoreandacrocyst ofstrainc65 2(bar=5μm) 分子生物学检测以通用的 NS1 和 NS8 作为引物, 通过 PCR 反应, 得到 C65 2 的 18SrDNA 18S 电泳 Marker 为 TRANS 的 DL2000Plus, 条带大小依次为 8k,5k,3k,2k,1k,750,500,250,100 18SrDNA 电泳结果见图 3a 将 18SrDNA 序列在 GenBank 中进行 blaster 比对, 找出同源性较高的菌株, 应用 Dnaman6.0 进行同源性比对, 应用 MEGA4.0 软件采用 NJ 临近法构建系统发育树 ( 图 3b) 图 3 18SrDNA 电泳及系统进化树 Fig.3 Electrophoresisresultandphylogenetictree 通过 C65 2 菌株的 18SrDNA 序列比对,C65 2 在进化树中与烟曲霉在同一个分支上, 与烟曲霉 (AspergilusfumigatusALI57) 同源率为 99.87%, 结合 C65 2 菌落及孢子特征可以判定 C65 2 为一株烟曲霉, 并将其定名为 :AspergilusfumigatusC 产酶条件的初步优化根据 DNS 法作 N 乙酰氨基葡萄糖标准曲线 ( 图 4a) 计算不同发酵条件的粗酶液活性, 经比较发酵培养基添加几丁糖诱导产酶效果最好 ( 图 4b); 氮源酵母浸粉比玉米浆和硝酸铵更有利于几丁质酶的产生 ( 图 4d); 摇瓶装液量为 50ml( 图 4f) 培养基初始 ph 为 6 ( 图 4e) 以及培养时间 42h( 图 4c) 时产酶最高, 说明该酶在略酸性条件下较适宜产生经产酶条件初步优化, 测得最高酶活可达 6.9U/ml, 酶活力较优化之前的筛选菌株提高了 210%

2010,30(8) 张海涛等 : 几丁质酶产生菌筛选鉴定及产酶性能研究 85 图 4 C65 2 产酶条件的初步优化结果 Fig.4 PrimaryoptimizingresultsofproducingchitinasebyC65 2 通过实验初步确定最佳产酶培养基为酵母膏 0.

4 酶的分离纯化及部分酶学性质研究对 SephadexG100 柱层析分离后有活性的样品浓缩后进行 SDS PAGE 蛋白质电泳, 实验结果如图 5 所示, 与 Marker 比较可知, 几丁质酶组分分子量约为 20kDa 酶的耐热性能如图 6a 所示, 在 60 保温 50min 酶活降为

4 2010,30(8) 张海涛等 : 几丁质酶产生菌筛选鉴定及产酶性能研究 85 图 4 C65 2 产酶条件的初步优化结果 Fig.4 PrimaryoptimizingresultsofproducingchitinasebyC65 2 通过实验初步确定最佳产酶培养基为酵母膏 0.5%, 壳聚糖 2%, 初始 ph6.0, 接种量 2%,MgSO 4 7H 2 O0.05%,K 2 HPO %,K 2 HPO %,NaCl 0.05%,250ml 三角瓶装液量 50ml, 培养时间 42h 2.4 酶的分离纯化及部分酶学性质研究对 SephadexG100 柱层析分离后有活性的样品浓缩后进行 SDS PAGE 蛋白质电泳, 实验结果如图 5 所示, 与 Marker 比较可知, 几丁质酶组分分子量约为 20kDa 酶的耐热性能如图 6a 所示, 在 60 保温 50min 酶活降为 0, 随着温度升高酶失活加速,80 条件下酶活力随即失去图 6b 显示酶的最适反应温度为 55 Mg 2+,Cu 2+ 对酶反应有促进作用,Fe 3+ 对酶反应有抑制作用 ( 图 6c), 酶反应最适合 ph 为 7.0( 图 6d) 图 5 几丁质酶电泳结果 Fig.5 Electrophoresisresultofchitinasedetecting

5 86 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.30No 图 6 酶学性质初步研究结果 Fig.6 Primarystudyresultsofchitinaseproperty 3 讨论几丁质酶不仅可以降解自然界几丁质产生许多有用的产物, 而且有些几丁质酶自身还兼具溶菌酶活性, 可分解细菌细胞壁的肽聚糖, 从而具有抗菌作用, 几丁质酶对细菌真菌昆虫螨等表现出一定抗性 [6,7], 几丁质酶的来源及性能研究具有重要意义虽然近几年几丁质酶产生菌的相关工作有些报道, 但对人类面临的利用几丁质资源这一艰巨任务来说, 几丁质酶产生菌的筛选及应用研究工作应持续开展本实验通过初筛, 比较了菌株在胶体几丁质筛选培养基中透明圈直径大小, 并测定酶活力进行复筛, 获得了 4 株不同形态特征和降解几丁质能力的菌株 C65 2,G15 2,L63 4, G38 4, 最后根据产酶能力和生长特征选定了菌株 C65 2 作为进一步研究对象经菌落和孢子形态学观察以及 18SrDNA 测序后, 鉴定 C65 2 为烟曲霉, 并将其命名 AspergilusfumigatusC65 2, 拓展了几丁质酶的来源, 为今后开发不同专一性的多样化几丁质酶提供了材料当前国内外报道的几丁质酶酶活差异较大, 各研究机构对几丁质酶活力单位 U 的定义不统一如果统一定义为 : 每小时释放 1μmol 乙酰氨基葡萄糖所需酶量, 将近几年文献报道几丁质酶活经换算酶活性为 : 40.8U/ml [8],51U/ml [9],1.08U/ml [10],23.4U/ml [11], U/ml [12],0.54 U/ml [13],12.0 U/ml [14], 6.0U/ml [15], 各研究之间还存在所用底物几丁质的差异本文筛选的 AspergilusfumigatusC65 2 菌株为野生菌株, 几丁质酶活较高, 而且发酵周期短, 还有较大诱导产酶及菌种选育空间, 有进一步用于工业化生产的潜质另外, 该几丁质酶最适反应温度为 55, 对于开发该温度范围内适用的几丁质酶提供了线索下一步工作应针对该菌株开展驯化产酶诱导和产酶过程的统计学优化以及酶的应用等工作, 为工业化发酵生产几丁质酶及该酶的利用打下基础参考文献 [1] 蒋挺大. 甲壳素. 北京 : 中国环境科学出版社,1999. JiangTD,Chitin.Beijing:ChinaEnvironmentalSciencePres, [2]HakiGD,RakshitSK.Developmentinindustrialyimportant thermostableenzymes.bioresourcetechnology,2003,89(1): [3]CarliniCR,GrosiD S,MariaF.Planttoxicproteinswith insecticidalproperties.toxicon,2002,40(11): [4] 林毅, 陈金辉. 芽孢杆菌几丁质酶及其在植物病虫害生物防治中的应用. 福建农业科技,1998( 增刊 ):32 33.

6 2010,30(8) 张海涛等 : 几丁质酶产生菌筛选鉴定及产酶性能研究 87 LinY,ChenJH.FujianAgriculturalScienceandTechnology, 1998(supple): [5]LauraEV,JosephOF.Comparisonofmethodsforisolationof Mycobacteriumavium complexdna foruseinpcr andrapd fingerprinting.microbiolmethods,1995,21(2): [6] ColingeD B, Kragh K M, Mikkelsen JD, etal. Plant chitinases.theplantjournal,1993,3(1): [7]SchlumbrumA,MauchF.Plantchitinasesarepotentinhibitorsof fungalgrowth.nature,1986,324(4376): [8] 潘志强, 黄惠琴, 单群, 等.SeratiaspPS 2 产几丁质酶发酵条件研究. 工业微生物,2008,38(2):40. PanZQ,HuangH Q,ShanQ,etal.IndustrialMicrobiology, 2008,38(2):40. [9] 苏广宇, 李从发, 高阳, 等. 产几丁质酶海洋细菌筛选及发酵条件优化. 中国新药杂志,2008,17(17): SuGY,LiCF,GaoY,etal.ChineseJournalofNewDrugs, 2008,17(17): [10] 惠丰立, 冯金荣, 杨柯金, 等. 产几丁质酶酵母菌的筛选与鉴定. 东北林业大学报,2007,35(8): HuiFL,FengJR,YangKJ,etal.JournalofNortheastForestry University,2007,35(8): [11] 王海东, 陈飚, 伦镜盛, 等. 产几丁质酶菌 SWCH 6 的筛选鉴定及其产酶条件的优化研究. 微生物学通报,2008,35(5): WangHD,ChenB,LunJS,etal.Microbiology,2008,35(5): [12] 杨水英, 李振轮, 青玲, 等. 产几丁质酶内生细菌的筛选及对烟草赤生病菌的抑制作用. 河南农业科学,2007,6: YangSY,LiZL,QingL,etal.JournalofHenanAgricultural Sciences,2007,6: [13] 杨水英, 李振轮, 青玲, 等. 产几丁质酶烟草内生菌的筛选及产酶条件研究. 西北农业学报,2007,16(4): YangSY,LiZL,QingL,etal.ActaAgriculturaeBoreali occidentalissinica,2007,16(4): [14] 邱立友, 汪世山, 余功德, 等. 几丁质酶产生菌的筛选及产酶条件的研究. 微生物学报,2000,27(4): QiuLY,WangSS,YuGD,etal.Microbiology,200,27(4): [15] 田强, 张彩, 吴子健. 几丁质酶产生菌的诱变育种及摇瓶发酵条件优化. 食品科学,2007,28(9): TianQ,ZhangC,WuZJ.FoodScience,2007,28(9): ResearchonScreening,IdentificationandEnzymeProducing CharacteristicsofChitinaseProducer ZHANGHai tao WANGTing TIANNan LIUXin li (ShandongProvincialKeyLaboratoryofMicrobialEngineering,ShandongInstituteofLightIndustry,Jinan ,China) Abstract C65 2strainwithhighchitinaseproducingabilitywasisolatedfrom soilandidentifieditas Aspergilusfumigatusbyobservingitsmorphologycharacterandmeasuringits18SrDNAsequence.Thechitinase producingconditionswasoptimized.themaximum activitycouldbeupto6.9u/mlandtheenzymeactivity increased210% thanbefore.thestudyofenzymaticpropertiesofthechitinaseshowedthatthemolecularweight was20kda.thermostablestabilityofthechitinasewasnotgoodandtheenzymeactivityreducedto0at60 for 50min.Theoptimalenzymereactiontemperaturewas55 andtheoptimalphofenzymereactionwas7.0.the chitinaseactivitycanbeenhancedbymg 2+,Cu 2+ andinhibitedbyfe 3+. Keywords Chitin Chitinase Aspergilusfumigatus Enzymeproducingcharacteristics

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材料! 方法! # 基因的扩增及其序列分析生物技术通报黄艳燕黄靖华卢福芝孙靓彭立新周兴黄日波利用的方法从鼠李糖乳杆菌基因组中扩增到乳酸脱氢酶基因并连接到载体上构建表达质粒将重组质粒转化大肠杆菌重组菌株经诱导表达电泳分析表明在大肠杆菌中实现了表达表达产物的分子量约为同时采用紫外分光光度法测定乳酸脱氢酶的酶活测得重组菌株的乳酸脱氢酶活力为最适反应温度为最适乳酸脱氢酶克隆表达鼠李糖乳杆菌