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1 第卷第期燕山大学学报年月文章编号 : X (2013) 一株高产碱性蛋白酶海洋细菌的筛选及发酵条件的优化 崔洪霞, 李春林, 钱龙, 孙滢, 周艳艳, 史云柯 ( 燕山大学环境与化学工程学院, 河北秦皇岛 ; 河北省应用化学重点实验室, 河北秦皇岛 ; 燕山大学里仁学院, 河北秦皇岛 ) 摘要 : 为了获得碱性蛋白酶高产菌株, 从采集的海泥中筛选得到株具有一定产碱性蛋白酶能力的菌株, 经过复筛得到株产酶能力较高的菌株, 其中菌株产碱性蛋白酶能力强 耐受范围广 考察了培养基初始值 培养温度 培养时间 装液量 接种量等单因素对菌株产酶能力的影响, 然后进行正交试验分析, 得出该菌的较佳发酵条件为值 发酵时间 培养液三角瓶和接种量 影响产酶的强弱顺序为 : 值 培养时间 接种量 装液量, 菌株在较佳发酵条件下的发酵液的最大达 本研究表明从秦皇岛海域可以获得碱性蛋白酶高产菌株, 丰富了菌种资源 关键词 : 碱性蛋白酶 ; 筛选 ; 海泥 ; 菌株中图分类号 :Q939 文献标识码 :A DOI: /j.issn X 引言近年来, 碱性蛋白酶由于与传统的化学催化剂相比具有催化能力强 底物专一性高等优点, 已被广泛应用于制革 银回收 医药 食品 饲料 化学工业 废物处理等生产及行业 其最早发现于猪胰脏中, 而年又发现于地衣芽孢杆菌中, 开辟了微生物碱性蛋白酶的来源 在碱性蛋白酶的应用过程中, 发现存在一些弊端, 如对表面活性剂 氧化剂 热 酸 碱等稳定性差和培养基成本较高等 因此, 寻找能产生具有良好酶学特性并能大规模生产的碱性蛋白酶高产菌株, 具有重要的理论应用价值 世界各国的微生物工作者在碱性蛋白酶产生菌筛选等方面已经做了大量工作, 邱秀宝 等人在碱性蛋白酶产生菌株的筛选 发酵条件等方面有大量卓有成效的研究 而且有学者对来自盐碱湖 温泉 极地 海洋等极端环境下的碱性蛋白酶菌株进行了研究, 经过分离纯化得到了具有对热 氧化剂 值等稳定性较好的菌株 虽然在这方面国内外均已取得许多成就, 但是由于全球范围内对碱性蛋白酶的需求日益增加, 碱性蛋 白酶仍供不应求 国内大规模工业用碱性蛋白酶主要依赖于进口, 从自然界中筛选高产碱性蛋白酶仍然任重道远 海洋以其独特和多样的生态自然环境, 形成了丰富的海洋微生物资源, 并产生了种类繁多功能优良的生物活性物质 国内对产碱性蛋白酶海洋微生物的研究, 主要集中在青岛海域 南海海域 红树林海域等地区, 渤海海域特别是秦皇岛海域研究较少, 筛选到高产碱性蛋白酶产生菌的可能性较大 本文以从秦皇岛海域鸽子窝公园采集到的泥样为实验对象, 通过菌株的初筛 复筛, 筛选出了一株具有较好产酶能力的菌株, 通过发酵条件考察等实验对该菌的产酶特性有了初步了解, 为后续实验奠定基础 材料实验材料为份泥样 分离纯化用培养基 : 蛋白胨, 牛肉膏, 磷酸铁, 琼脂, 值, 海水配制 ( 加入制霉素抑制真菌和放线菌的生长 ), 灭菌 初筛用培养基( 脱脂牛奶琼脂平板培养 收稿日期 : 基金项目 : 河北省自然科学基金资助项目 ( ) 作者简介 : 崔洪霞 ( ), 女, 黑龙江尚志人, 博士, 副教授, 主要研究方向为微生物与生化药学, :

2 第期崔洪霞等株高产碱性蛋白酶海洋细菌的筛选及发酵条件的优化 基 ): 蛋白胨, 牛肉膏, 磷酸铁, 琼脂, 脱脂牛奶 ( 用总体积 蒸馏水 配置, 混合后一起灭菌 ), 海水配制, 值, 灭菌 酚购于上海荔达生物科 技有限公司, 其他试剂均为国产分析纯 实验方法 取样 从秦皇岛鸽子窝海域浅滩采取下层泥土 份 ( 挖去上层 土层 ), 用无菌手套装取, 冷藏备用 菌株的分离纯化方法参考文献 取 土样于无菌试管中, 加入无菌生理盐水, 充分振荡混匀, 然后采 用 倍稀释法, 稀释比例分别为,,, 然后取 个试管中样液 菌液涂布于 相应分离纯化用培养基平皿上 培养, 观 察并挑选出单个菌落, 用三段划线法对分离得到的 菌株进一步分离纯化 产碱性蛋白酶细菌的初筛 将划线分离纯化的菌株以点种 的形式接种 于筛选用培养基 ( 脱脂牛奶琼脂培养基 ) 平板上, 培养, 如果点种的菌株能够产生碱性蛋白 酶, 则在平板上会产生水解圈 通过测定水解圈直 径 ( ) 和菌落直径 ( ) 的大小, 并求得其比值, 即可确定该菌株产酶能力的相对大小 挑选出水解 脱脂牛奶能力较强的菌株, 并将其保存在牛肉膏蛋 白胨试管斜面上 产碱性蛋白酶细菌的复筛 测定 测定方法参考文献 ) 标准曲线的制作 配制浓度分别为 的标准酪氨酸溶液, 用 酚测定标准酪氨酸溶 液浓度与吸光度值之间的关系 ) 测定 用 酚法测定, 将 测定样品与底物酪蛋白混合一定时间, 根据产生的 酪氨酸的量求出碱性蛋白的大小 实验中设 对照组, 以其调零, 用型可见光分光光度计在处, 测定实验组的吸光度值 每分钟水解酪蛋白产生酪氨酸的酶量为一个单位 计算公式为, 其中, 为实验组吸光度 ; 为酪氨酸标准曲线纵截距 ; 为测量体积 ; 为酶液体积 ; 为酪氨酸标准曲线斜率 ; 为酶反应时间 发酵液测定将初筛得到的具有明显产酶能力的菌株接入发酵培养基 ( 牛肉膏蛋白胨培养基用自然海水配制 ) 中,, 振荡培养, 用酚法测定发酵液的 选出产酶能力较强的菌株进行重复性实验 培养条件对菌株产酶能力的影响单因素实验方法参考文献 以菌种复筛培养条件为基础, 分别考察发酵液不同起始值 ( ), 不同温度 ( 和 ), 不同培养时间 ( ), 每个三角瓶 ( ) 不同装液量 ( ) 和不同接种量 ( ) 对菌株发酵产酶能力的影响, 控制摇床转速为 用酚法测定发酵液的 正交试验采用四因素三水平正交试验设计, 确定起始 值 培养温度 培养时间 装液量个因素的最佳组合和对该菌发酵产酶能力影响主次 按照正交设计表要求配制不同培养基并用酚测定发酵液的 实验结果菌株的分离纯化在分离纯化用培养基平板上根据菌落表面是否光滑 是否透明 菌落颜色等条件挑选出株细菌, 并经多次三段划线分离, 使菌株得到纯化,

3 燕山大学学报 斜面保存备用 初筛将已经分离纯化的 菌株用点种法接入脱脂 碱性蛋白酶产生菌的复筛标准曲线的制作酚和标准酪氨酸溶液反应, 产生墨绿色 牛奶琼脂平板筛选用培养基, 在 培养箱中培 物质, 在 波长下具有最大吸收, 以蒸馏水 养 平板上得到 株 ( 代替酪氨酸溶液作为对照组, 用 型分光光度仪 ) 能明显水解脱脂牛奶产生水解圈的菌株 ( 如 测定标准酪氨酸溶液的吸光度值 ( ), 酪氨 图 所示, 对角为相同菌株 ), 水解圈直径 ( ) 和 酸浓度和吸光度值的关系如表 所示, 根据表 中 菌落直径 ( ) 比值的大小见表, 其中 株菌 的数据, 以酪氨酸的浓度为横坐标, 吸光度值为纵 ( 坐标, 绘制标准曲线 ( 图 ), 经线性回归分析可 ) 的 均大于 说明该 株菌产酶能力 知,,, 说明应用此 相对较大, 选其进行复筛 法测定酪氨酸浓度与吸光度值的关系时, 酪氨酸浓 度介于 范围内具有良好的线性关系 表标准酪氨酸溶液的值 酪氨酸浓度 酪氨酸浓度 图菌株和的水解圈 表 菌落直径和水解圈直径 菌株菌落直径水解圈直径 图 酪氨酸浓度 酪氨酸标准曲线 产酶菌株的复筛 将初筛得到的 株菌接入 值为 的发 酵培养基中, 发酵液 三角瓶 振荡培养, 得培养液, 离心去除菌 体, 用 酚法测定上清液的, 结果如表 所示 表 菌株产碱性蛋白酶能力的复筛结果 菌株菌株

4 第期崔洪霞等株高产碱性蛋白酶海洋细菌的筛选及发酵条件的优化 由表 可知, 菌株 株菌产酶能力明显高于其他菌株, 故选定 这 株菌进行产碱性蛋白酶能力的再次筛选, 结果 见表 表 菌株产碱性蛋白酶能力的再次筛选结果 菌株由表 的数据可知, 菌株 和 产酶能力明显低于 和, 且 和 菌株的与表 中的相差很大, 推测可能是菌 株的生产能力或酶不稳定 虽然 产酶能力略 高于, 但 具有广泛的 耐受范围, 故本文选定 作为研究对象 ) 培养温度对菌株产酶能力的影响 每三角瓶装培养液, 值为,, 的接种量在设定的两个温度下对菌株进行发酵培养, 测定上清液对酪蛋白的水解能力, 由计算公式计算出大小, 得不同培养温度和大小的关系, 并得培养液的菌体浓度, 结果如表所示 由表可知菌株产碱性蛋白酶能力受培养温度影响不明显, 培养温度为 和 时该菌产酶能力基本保持不变, 最高达到 在 时菌体的生长量明显低于, 从节约能源方面考虑, 菌株发酵温度选为 表培养温度对发酵液中菌体生长和的影响 培养条件对菌株 产酶能力的影响 温度 单因素实验 ) 培养基起始 值对菌株 产酶能力 的影响 配制不同起始 值 ( ) 的发酵培养基, 培养, 得菌株 的发酵液, 测定各 值的菌体量并用 酚测 定发酵液的, 得不同培养基起始 值与菌 体量和大小的关系图 ( 图 ) 由图可知培 养基的初始 值会影响菌株 的生长及产碱 性蛋白酶的能力, 当 值从 增加到 时, 产酶能力明显提高, 以后产酶能力下降明显, 以 值 时的最大, 为 而当初始 值为 时, 对菌株的生长基本 无没有影响, 推知该菌株产酶最适 值在 左 右, 选定正交试验 值的三水平为 ) 培养时间对菌株发酵产酶的影响 将菌株用发酵培养基培养后, 每隔用酚测定发酵液的 得不同培养时间和大小的关系图, 同时测定各时间段的菌体浓度, 结果见图 由图知, 菌株产碱性蛋白酶受培养时间影响明显, 培养时间由到时产酶能力明显增加, 以后产酶量变化不大, 一直到, 期间最高为 菌体在后进入对数期, 在时进入稳定期, 且持续到 菌体生长与产酶量成正比, 故选定正交试验中培养时间的三水平分别为 培养时间 图 培养时间对产酶和菌体生长的影响 值 图培养基初始值对产酶和菌体生长的影响 ) 装液量对菌株发酵产酶的影响 每 个三角瓶 ( ) 的装液量分别为

5 燕山大学学报 培养, 得发酵液 用 正交试验 酚测定发酵液的, 得不同装液量和大小的关系, 同时测定各条件下的菌体浓度, 通过单因素实验, 确定起始 值, 培养时间, 结果见图 由图 可知, 装液量在 范 装液量和接种量 个因素分别对应的水平为 值 围内, 产酶量较大且变化不大, 装液量达到, 培养时间为, 装 时下降, 最大出现在装样量为 液量为每个三角瓶 ( ) 装液 时, 为 菌体生长量则随着装液量的, 接种量为 和 增加而减少 故交正实验中选定装液量的三水平分 根据正交试验设计原理, 配制发酵培养基, 别为 和 号为不同培养条件, 得发酵液, 用 酚法测定 各三角瓶中发酵液的, 得不同培养条件下菌 株的大小 ( 表 ) 其中, 每一列中的 为 第列中所有对应吸光度值的和 极差 三角瓶装样量 图 装液量对产酶和菌体生长的影响 ) 接种量对菌株 发酵产酶的影响 每 个三角瓶 ( ) 的装液量 接种量为, 培养, 得发酵液 用 酚测定发 酵液的, 并测定各接种量条件下的菌体浓 度, 得不同接种量与和菌体生长关系 ( 图 ) 由图 可知, 接种量为 至 时产酶量较 大, 接种量提高到 时开始明显降低, 以 接种量为 时的最大, 达到 接种量为 时, 菌体量在 达到最大, 接种量 在 到 时, 菌体量变化不大 故选定正交试 验中接种量的三水平分别为 和 由值的大小可以确定每一 因素中的最佳水平, 同一水平下, 值越大, 表示 该水平对产酶影响越大 ; 由极差值可以确定各个 因素对发酵产酶能力影响的顺序, 值越大, 表示 该因素对产酶影响越明显 由表 中的数据可知, 菌株 产酶较佳 值 接种量 装液量 发酵时间这 个因素的 最佳组合是 值 接种量 三角瓶 培养 且 个因素对发酵产酶影响的 主次顺序为 : 值 培养时间 接种量 装液量 在较佳发酵条件下对菌株 进行培养发酵, 得 到发酵液的达 表 培养条件的正交试验 序号起始 值时间 装样量 接种量 图 接种量 接种量对产酶和菌体生长的影响 讨论本实验从秦皇岛鸽子窝公园采集到份泥样, 经分离纯化得到细菌株, 初筛得到有产碱性蛋

6 第期崔洪霞等株高产碱性蛋白酶海洋细菌的筛选及发酵条件的优化 白酶能力的菌株株 (, ), 选取其中产碱性蛋白酶能力较强的株 ( 结论 ) 进行 本文从海泥中获得 株高产碱性蛋白酶菌株 复筛, 发现菌株 和, 经优化可知其较佳发酵条件为 值 产酶能力较强 鉴于菌株 具有较广的 耐 发酵时间 培养液 三角瓶和接 受范围, 选其作为后续研究对象 从秦皇岛鸽子窝 种量 在此条件下, 发酵液的可达 公园湿地筛选到产碱性蛋白酶的菌株的大致比例 菌株 产的碱性蛋白酶具有较 是, 黄志强等人 报道福建沿海海域 高 耐受能力, 相信经过后期对菌株 进行 产碱性蛋白酶菌株的比例是, 说明在 驯化处理, 其产酶能力还有可能大大提高, 酶的性 秦皇岛海域筛选到产碱性蛋白菌株的比例可能高于福建海域, 该海域具有较大的研究意义 考察起 能更加适合工业化应用, 本文为该菌株的进一步研究和应用奠定基础 始 值 培养温度 发酵时间 每个三角瓶 ( ) 装液量 接种量对 产碱性蛋白酶能 参考文献 力的影响, 较佳发酵条件为起始 值 培养 温度 发酵时间 和每个三角瓶 ( ) 胡学智 王俊 蛋白酶生产和应用的进展 工业微生物 装液量, 接种量 选定正交试验各因素方海红胡好远黄红英的水平分别为值, 培养时间 微生物学通报 等 微生物碱性蛋白酶的研究进展, 每个三角瓶 ( ) 装液 邓菊云微生物碱性蛋白酶研究进展 现代食品科技, 接种量 正交试验 结果显示较佳发酵条件为 值, 培养时间 邱秀宝程秀兰袁影嗜碱性芽孢杆菌碱性蛋白酶的研究 Ⅰ, 培养液 三角瓶, 接种量 菌种分离 筛选及发酵条件的研究 微生物学通报 菌株 在较佳条件下发酵, 得发酵液的 高达, 说明在此较佳发酵条件下菌株 具有较高的产酶能力 台湾学者 等人年的研究得到的最大梅承芳江晓路牟海津等碱湖高产碱性蛋白酶菌的选育, 巴西学者等人对细小和产酶条件研究中国海洋大学学报 杆菌属的研究得到的最大为, 本 文中菌株 产碱性蛋白酶的能力与其相似 经 过革兰氏染色和简单形态学观察, 该菌为革兰氏阴 性杆菌, 结合生理生化实验 基因测序 分析, 初步判定菌株可能为嗜麦芽窄食单胞菌种, 该部分实验结果将另文发表 目前仅闫志勇等报道获得一株产碱性蛋白酶的嗜麦芽寡养单胞菌 ( 嗜麦芽窄食单胞菌 ), 并且获得一项专利 其分离到的菌株产生的碱性蛋白酶在值范围内有活性, 最适值为, 而菌株的发酵液经盐析处理, 得到粗酶液, 经考察其在值下的, 发现该酶在值下保存仍然具有较高的酶活性, 最适值为 说明菌株所产酶具有更广泛的耐受性, 在工业领域可能有较大的应用价值 沈萍陈向东微生物学实验 版北京高等教育出版 社孙同毅 殷向斌 郝继兴 等 高活力碱性蛋白酶产生菌的选 育与发酵放大 辽宁工程技术大学学报自然科学版 黄志强林白雪谢联辉产碱性蛋白酶海洋细菌的筛选与鉴 定 福建农林大学学报自然科学版

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