2014,34(9) 李恒等 : 褐藻胶裂解酶产生菌的分离鉴定及产酶发酵优化 95 胨 5.0, 酵母粉 1.0,NaCl30,pH 实验材料主要试剂 : 细菌基因组提取试剂盒 PCR 产物回收试剂盒购自上海捷瑞生物工程有限公司 ; 扩增及克隆实验所用试剂均购自 Takara 公司

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宥戚
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1 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology,2014,34(9): DOI: /j.cb 褐藻胶裂解酶产生菌的分离鉴定及产酶发酵优化李恒朱思婷刘旭梅龚劲松蒋敏许正宏史劲松 ( 江南大学药学院无锡 ) 摘要对一株从腐烂海带中筛选得到的产褐藻胶裂解酶的菌株进行鉴定, 并对其产酶条件进行发酵优化经形态学生理生化特征和分子生物学鉴定, 将其鉴定为盐单胞菌属, 并命名为 Halomonassp.WF6 通过在摇瓶培养水平上进行单因素和多因素正交试验, 确定褐藻胶裂解酶产生菌 WF6 的最适产酶培养基为 : 褐藻酸钠 6.0g/L, 蛋白胨 5.0g/L, 酵母粉 2.5g/L,NaCl30g/ L,K + 5mmol/L 进而采用最适培养基进行产酶条件的优化, 优化后的发酵产酶条件为 : 初始 ph 8.0, 培养温度 25, 接种量为 2%, 摇瓶装液量 30ml/250ml, 培养时间 39h 优化后的褐藻胶裂解酶酶活达 U/ml, 是优化前的 2.1 倍该酶对褐藻酸钠的酶解产物主要由聚合度为二和三的褐藻寡糖组成关键词褐藻胶裂解酶 Halomonassp. 鉴定发酵优化中图分类号 Q93 近年来, 随着人们对褐藻寡糖结构与活性认识的不断深入, 其特殊的生物活性及药用价值得到了广泛的开发褐藻寡糖在医药食品化工农业等领域均有应用, 其中在抗肿瘤抗凝血免疫调节及促进生长等方面更是掀起了研究热潮 [1 3] 目前, 褐藻寡糖主要由褐藻胶降解制备常用的降解方法主要有物理降解法 [4] [5] 化学降解法以及生物降解法 [6] 物理法主要采取辐射的方式, 操作复杂, 且降解条件难以控制 ; 化学法是目前采用最多的方法, 但由于本质是一种非特异性降解方法, 因而存在目标寡糖的产量少, 副产物多以及回收率低等问题, 受到越来越多的质疑利用酶的特异性降解褐藻胶是生物降解法的主要原理, 该法具有专一性强寡糖得率高且条件温和等优点, 这些显著的优越性使生物降解法备受青睐作为褐藻胶生物降解的主体, 褐藻胶裂解酶通过 [7] β 消去机制催化褐藻胶降解并直接决定着降解效率及产物分布褐藻胶裂解酶具有广泛的生物来源, 可从多种海洋微生物土壤微生物噬菌体病毒海洋软收稿日期 : 修回日期 : 十二五国家科技支撑计划资助项目 (2012BAD33B06) 通讯作者, 电子信箱 :shijs@163.com 体动物和海藻中分离得到目前已报道的多种褐藻胶裂解酶大都来自于海洋微生物 [8], 主要有弧菌 (Vibrio) [9], 假单胞菌 (Pseudomonasaeruginosa) [10], 固氮菌 (Azotobactervinelandi) [11] 交替假单胞菌 (Pseudoaltermonas elyakovi) [12] 及交替单胞菌 (Alteromonas) [13] 等褐藻胶裂解酶已被普遍认为是定向制备褐藻寡糖的有力工具, 因此, 不断扩大褐藻胶裂解酶的菌种资源, 进而实现褐藻寡糖的高效高值化应用成为目前研究的趋势和热点从腐烂的海带中筛选得到一株产褐藻胶裂解酶的菌株, 依次对其进行了形态学生理生化特性以及分子鉴定, 并对培养基组成及培养条件进行了优化, 为褐藻胶裂解酶的酶学性质研究及应用提供参考和借鉴 1 材料与方法 1.1 材料与仪器样品来源腐烂的海带, 来源于连云港中大海藻工业有限公司, 低温保存培养基 [14] (1) 富集和初筛培养基 (g/l): 褐藻酸钠 5.0,MgSO 4 7H 2 O 1.0,K 2 HPO 4 1.0, (NH 4 ) 2 SO 4 5, 琼脂 18,NaCl30,pH7.5 (2) 种子和发酵培养基 (g/l): 褐藻酸钠 5.0, 蛋白

2 2014,34(9) 李恒等 : 褐藻胶裂解酶产生菌的分离鉴定及产酶发酵优化 95 胨 5.0, 酵母粉 1.0,NaCl30,pH 实验材料主要试剂 : 细菌基因组提取试剂盒 PCR 产物回收试剂盒购自上海捷瑞生物工程有限公司 ; 扩增及克隆实验所用试剂均购自 Takara 公司, 蛋白胨购自上海生工公司, 其他试剂均为购自国药试剂公司的分析纯级以上的试剂主要仪器 :PCR 扩增仪购自 Bio Rad 公司 ;UV 2100 分光光度计购自上海尤尼科仪器有限公司 ; 核酸电泳系统购自 CosmoBioCo LTD; 精密 ph 计购自上海 Metler Toledo 1.2 实验方法 [14] 菌株的筛选培养液用无菌生理盐水进行梯度稀释, 涂布于初筛培养基平板上 30 恒温培养 48h 后观察菌落形态, 选取生长良好且具有透明水解圈的菌株, 接种到种子培养基中,30,180r/min 培养, 测定发酵上清液中的酶活力菌株的鉴定形态学观察 : 固体平板培养基上观察菌落形态, 经 2% 乙酸固定脱盐后采用革兰氏染色, 在光学显微镜下观察菌体形态生理生化特征鉴定 : 将菌株 WF6 涂布于初筛培养基平板上,30 培养 72h, 观察细胞形态和菌落特征部分生理生化试验鉴定参照常见细菌系统鉴定手册 16SrDNA 的克隆与序列分析 [15] : 采用细菌基因组试剂盒提取菌株 WF6 的基因组, 采用碱裂解法提取质粒, 参照文献进行感受态制备酶切连接转化等 [16] 以菌株 WF6 基因组 DNA 为模板, 利用通用引物 (5 ATTCCGGTTGATCCTGC 3 ;5 AGGAGGTGATC CAGCCGCAG 3 ) 扩增 16SrDNA 将克隆后的样品进行测序, 测序结果在 GenBank 中进行序列比对以确定种属遵循邻接法和最大相似法原则, 应用 CLUSTAL MEGA5.0 等软件进行聚类分析与同源性分析, 构建系统发育树酶活测定方法采用 DNS(3,5 二硝基水杨酸 ) 法取 0.2ml 发酵液上清与 1ml1% 褐藻酸钠溶液 (50mmol/L, 用 ph7.0 的 Na 2 HPO 4 NaH 2 PO 4 缓冲液配制 ) 混合,45 反应 15min 后, 迅速加入 1mlDNS 溶液, 沸水浴 3min 后迅速冷却, 定容到 10ml, 测定 520 nm 下的吸光值每个样品做三个平行 1 个酶活力单位 (U) 定义为 :1mL 酶液在上述条件下参与反应, 每分钟产生 1μg 还原糖所需要的酶量生物量的测定通过比浊法测定生物量取菌悬液 0.5ml, 加入 2.5ml 去离子水, 以去离子水作空白对照, 于 600nm 处测定吸光值每个样品做三个平行产酶条件优化依次进行培养基成分的优化和培养条件的优化以筛选液体培养基作为出发培养基, 优化结果用于后续试验顺序开展碳源氮源 NaCl 及无机盐的浓度等因素的考察在单因素实验的基础上进行四因素三水平的正交试验, 确定最佳培养基组成在最佳培养基组成下, 分别对培养基初始 ph 值培养温度接种量装液量等进行优化, 检测不同培养条件对菌株产酶能力的影响酶解产物分析采用薄层色谱法 (TLC) 对褐藻胶的酶解产物进行分析将 1.0ml 褐藻酸钠底物 (1%) 和 1ml 适当浓度的酶液于 35 反应 24h, 沸水浴 3min 终止反应,8000r/min 离心 20min, 上清液为降解产物取 5.0μl 上清液做薄层层析将降解得到的样品点样后, 放入层析缸中进行层析, 待层析结束后, 将硅胶板放在通风处晾干均匀喷洒显色剂在硅胶板上, 自然烘干后于 105 显色 10 min, 其中展开剂为乙酸水正丁醇 =2 2 3, 显色剂为乙醇浓硫酸 =9 1 2 结果与讨论 2.1 褐藻胶裂解酶产生菌株的筛选通过初筛与富集培养, 从腐烂的海带中筛选出 8 株能在以褐藻酸钠为唯一碳源的平板上生长且形成透明水解圈的菌株依据透明圈直径与菌落直径的比值大小进行褐藻胶裂解酶活力的初步判断结果表明, 菌株 WF6 发酵液酶活较高, 且发酵时间较短, 经 5 代遗传稳定性培养证明该菌株产酶能力稳定, 故作为后续试验的研究对象 2.2 菌株 WF6 的鉴定形态学特征菌株 WF6 在初筛平板上培养 72h 后, 菌落呈乳白色, 圆形, 不透明, 饱满, 表面湿润有光泽, 中心突起挑取菌体进行革兰氏染色, 在光学显微镜下观察, 菌株显革兰氏阴性菌落形态及革兰氏染色镜检结果如图 1 所示生理生化特征菌株 WF6 能在 1.0% ~ 30.0% NaCl(W/V) 浓度的培养基中生长, 当 NaCl 浓度在 2.0% ~7.0% 之间菌体生长情况较好菌株 WF6 可在 ph3.5~9.0 的条件下生长, 尤其 5.5~8.5 生长良好, 菌株 WF6 能在 15~45 生长,25~30 生长较好, 最适生长温度为 25 进一步考察了菌株的部分

96 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.34No.92014 图 1 菌株 Halomonassp.WF6 形态学特征 Fig.1 Morphologicalcharacteristicsof Halomonassp.WF6 (a) The colony image ofhalomonas sp.

wf6 鉴定项目鉴定结果鉴定项目鉴定结果革兰氏染色 1) V P 实验 - 葡萄糖 + 2) 甲基红试验 + 蔗糖 + H 2 O 2 酶 + 硝酸盐还原性 + 乙醇的氧化 + 淀粉水解 + 乙酸的氧化明胶液化脲酶 + 1) Thenegativeresult 2) Thepositiveresult 2.2.3 分子生物学鉴定经测序, 菌株 WF6 的 16S rdna 基因序列含有 1501bp 在 GenBank 数据库中进行 BLAST 比对并构建系统发育树 ( 图 2) 结果显示, 菌株 WF6 与 Halomonassp.

3 96 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.34No 图 1 菌株 Halomonassp.WF6 形态学特征 Fig.1 Morphologicalcharacteristicsof Halomonassp.WF6 (a) The colony image ofhalomonas sp. WF6 (b) The microphotographofhalomonassp.wf6 特殊生理生化性质, 如表 1 所示表 1 菌株 WF6 的部分生理生化特征 Table1 Thephysiologicalandbiochemical characteristicsofstrainhalomonassp.wf6 鉴定项目鉴定结果鉴定项目鉴定结果革兰氏染色 1) V P 实验 - 葡萄糖 + 2) 甲基红试验 + 蔗糖 + H 2 O 2 酶 + 硝酸盐还原性 + 乙醇的氧化 + 淀粉水解 + 乙酸的氧化明胶液化脲酶 + 1) Thenegativeresult 2) Thepositiveresult 分子生物学鉴定经测序, 菌株 WF6 的 16S rdna 基因序列含有 1501bp 在 GenBank 数据库中进行 BLAST 比对并构建系统发育树 ( 图 2) 结果显示, 菌株 WF6 与 Halomonassp.JL 81(AY ) 亲缘关系最近,16SrDNA 序列相似性为 98% 结合菌株的形态学特征和生理生化特性, 将其归类为盐单胞菌属 (Halomonassp.), 命名为 Halomonassp.WF6 2.3 培养基组成的优化碳源对产酶的影响选用几种单糖二糖和多糖分别代替褐藻酸钠作为菌株 Halomonassp.WF6 生长的唯一碳源, 研究不同碳源对菌株产酶的影响 ( 表 2) 结果表明, 菌株以甘油和葡萄糖为碳源时, 未检测出酶活, 在以蔗糖麦芽糖以及淀粉为碳源的培养基中检测到少量酶活, 而只有以褐藻酸钠为唯一碳源时酶活最高因此推测菌株 Halomonassp.WF6 所产褐藻胶裂解酶为诱导酶这与大多数褐藻胶裂解酶类似 [17] 图 2 菌株 WF6 的 16SrDNA 的比对分析 Fig.2 16SrDNABlastanalysisofstrainWF6 进一步对褐藻酸钠浓度进行优化如图 3 所示, 随着褐藻酸钠浓度的增加, 酶活与生物量均随之提高, 但是当浓度超过 6.0g/L 时, 尽管生物量继续增长, 酶活反而逐渐下降, 这可能是由于高浓度的褐藻酸钠影响菌体代谢和酶的生成因此, 选择 6.0g/L 作为褐藻酸钠的最适浓度表 2 不同碳源对菌株 WF6 产酶的影响 Table2 Efectofcarbonsourcesontheenzyme activityofhalomonassp.wf6 碳源种类酶活 (U/ml) 葡萄糖 0 甘油 0 蔗糖 7.70±1.34 麦芽糖 6.10±0.61 淀粉 14.55±0.88 褐藻酸钠 51.18±6.02 图 3 褐藻酸钠浓度对菌株 WF6 生长及产酶的影响 Fig.3 Efectofsodium alginateconcentrationon growthandenzymeactivityofhalomonassp.wf 氮源对产酶的影响考察不同无机氮源有机氮源和复合氮源对菌株 WF6 的生长和产酶情况的影响实验发现, 在含无机氮源的培养基中菌株生长缓慢且未检测出酶活 ; 而在含蛋白胨酵母粉等有机氮源

4 2014,34(9) 李恒等 : 褐藻胶裂解酶产生菌的分离鉴定及产酶发酵优化 97 的培养基中能检测出一定酶活, 结果如表 3 所示其中以蛋白胨 (5.0g/L) 和酵母粉 (2.5g/L) 为复合氮源时, 菌株酶活最高表 3 氮源对菌株 WF6 生长及产酶的影响 Table3 Efectofnitrogensourcesonenzymeactivity ofhalomonassp.wf6 氮源种类及其浓度 (g/l) 酶活 (U/ml) 生物量 (OD 600 ) 酵母粉 (5) 36.89± ±0.027 蛋白胨 (5) 53.93± ±0.046 蛋白胨 + 酵母粉 ( ) 42.97± ±0.037 蛋白胨 + 酵母粉 ( ) 67.70± ±0.020 蛋白胨 + 酵母粉 ( ) 34.90± ±0.048 蛋白胨 + 酵母粉 ( ) 32.63± ± NaCl 浓度对产酶的影响不同浓度的 NaCl 对菌株 WF6 的生长和产酶均有显著影响, 结果如图 4 所示该菌株在低浓度的 NaCl 环境下生长缓慢, 产酶能力低 ; 随着 NaCl 浓度的增加, 酶活大幅提升, 当 NaCl 浓度为 25g/L 时, 菌株产酶能力最强这可能与菌株来源于海洋环境有关, 海洋较高盐度的环境赋予其不同 [18] 于陆地微生物的特殊生存特性 ElAhwany 等指出 NaCl 的加入使得褐藻胶裂解酶与底物结合充分, 从而明显促进酶活进一步提高 NaCl 浓度会对酶活有抑制作用产酶能力最强表 4 不同金属离子对菌株 WF6 生长及产酶的作用 Table4 Efectofmetalionsongrowthand enzymeactivityofhalomonassp.wf6 金属离子相对酶活 (%) 生物量 (OD 600 ) 作用效果对照 100± ±0.039 K ± ± ) Ca ± ± ) Mg ± ±0.028 Mn ± ±0.038 Fe ± ±0.030 Fe ± ±0.021 Zn ± ± ) Thestimulationefect 2) Theinhibitionefect 图 5 K + 的浓度对 WF6 生长及产酶的影响 Fig.5 EfectofK + concentrationongrowth andenzymeactivityofhalomonassp.wf6 图 4 NaCl 浓度对 WF6 生长及产酶的影响 Fig.4 EfectofNaClconcentrationongrowth andenzymeactivityofhalomonassp.wf 金属离子对产酶的影响各种金属离子对菌株 WF6 的生长和产酶的影响如表 4 所示 Mg 2+ 可显著促进菌体生长, 生物量提高了 1.7 倍, 但对酶活有少量的抑制作用 ; 只有 K + 表现出少量的酶活促进作用, 提高幅度 10.9% 进一步探究 K + 对菌株生长及产酶的影响 ( 图 5), 结果表明, 其浓度在 3mmol/L 时, 菌株正交实验结果依据单因素试验确定对菌株 WF6 产酶有主要影响的因素包括褐藻酸钠浓度复合氮源浓度 NaCl 浓度及 K + 浓度, 进而利用正交试验综合考察这 4 个因素对菌体产酶的交互影响设计四因素三水平的正交试验 L9(3 4 )( 表 5) 实验结果如表 6 所示通过极差分析, 各因素对菌株 WF6 产酶影响的大小程度依次为褐藻酸钠浓度 NaCl 浓度复合氮源浓度 K + 浓度, 其中有显著影响的因素是褐藻酸钠浓度与 NaCl 浓度根据正交实验结果, 确定产酶培养基最优化的水平组合为 A2B2C3D3, 即褐藻酸钠 6.0g/L, 蛋白胨 5.0 g/l, 酵母粉 2.5g/L,NaCl30g/L,K + 5mmol/L 在该条件下, 菌株培养 42h 后酶活达 U/ml, 为初始酶活的 1.87 倍

98 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.34No.92014 表 5 菌株 WF6 产酶培养基优化正交实验因素水平表 Table5 Factorsandlevelsoftheorthogonaltestformedium optimization 水平褐藻酸钠浓度 g/l 复合氮源浓度 g/l NaCl 浓度 g/l K + 浓度 mm 1 3.0 2.5+2.

5 98 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.34No 表 5 菌株 WF6 产酶培养基优化正交实验因素水平表 Table5 Factorsandlevelsoftheorthogonaltestformedium optimization 水平褐藻酸钠浓度 g/l 复合氮源浓度 g/l NaCl 浓度 g/l K + 浓度 mm 表 6 菌株 WF6 发酵优化 L9(3 4 ) 正交结果表 Table6 Resultsoftheorthogonaltestformedium optimization 实验号因素生物量褐藻酸钠浓度复合氮源浓度 NaCl 浓度 K + 浓度 (OD 600nm ) 酶活 (U/mL) A B C D ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ±1.49 K K K 极差显著性 1) 2) 1) significantatp<0.02; 2) significantatp< 培养条件对产酶的影响初始 ph 对菌株产酶的影响培养基的初始 ph 可能影响菌体细胞膜的氧化还原电位, 从而影响菌株对培养基中营养物质的吸收以及酶的分泌和活性 [19] 初始 ph 对菌株产酶的影响如图 6 所示, 当初始 ph 为 8.0 时最有利于菌株产酶这与文献报道的适宜 ph 范围 6.0~8.0 的结果相符 [8] 温度对产酶的影响温度直接影响菌体的生长及产酶考察不同培养温度对菌株 WF6 的生长及产酶情况影响如图 7 所示, 菌株在 25 时, 酶活力最高当温度超过 35 o C 时, 酶活迅速下降这与文献中大部分来源于海洋环境的褐藻胶降解菌发酵产酶的最适温度范围相一致 [20] 接种量对产酶的影响实验进一步考察了不同接种量对菌株生长及产酶的影响, 结果如图 8 所示结果表明, 接种量对菌株 WF6 产酶影响不显著, 适当地增加接种量可提高菌株产酶量接种量为 2% 时, 检测到的酶活最高装液量对产酶的影响发酵过程的溶氧情况图 6 ph 对菌株 WF6 生长及产酶的影响 Fig.6 EfectofpH ongrowthandenzyme activityofhalomonassp.wf6 影响菌株的生长和产酶由图 9 所示, 采用 250ml 三角瓶, 分别装入 30,40,50,60,70ml 培养基随装液量的上升, 菌株生物量和产酶量都有下降趋势, 说明该菌株好氧, 适当提高溶氧量有利于菌体生长和酶的合成, 菌株在 30ml/250ml 装液量时酶活力最高

2014,34(9) 李恒等 : 褐藻胶裂解酶产生菌的分离鉴定及产酶发酵优化 99 已报道的产褐藻胶裂解酶的菌株相比, 菌株 WF6 所需产酶时间显著较短 [21,22], 且与优化前相比, 菌株较快进入生长对数期, 生物量也有所增加, 褐藻胶裂解酶酶活力为初始的 2.1 倍图 7 培养温度对菌株 WF6 生长及产酶的影响 Fig.

6 2014,34(9) 李恒等 : 褐藻胶裂解酶产生菌的分离鉴定及产酶发酵优化 99 已报道的产褐藻胶裂解酶的菌株相比, 菌株 WF6 所需产酶时间显著较短 [21,22], 且与优化前相比, 菌株较快进入生长对数期, 生物量也有所增加, 褐藻胶裂解酶酶活力为初始的 2.1 倍图 7 培养温度对菌株 WF6 生长及产酶的影响 Fig.7 Efectoftemperatureongrowthand enzymeactivityfrom Halomonassp.WF6 图 10 优化后菌株 WF6 的生长及产酶曲线 Fig.10 Thecurveofgrowthandenzymeactivityof Halomonassp.WF6undertheoptimizedconditions 图 8 接种量对菌株 WF6 生长及产酶的影响 Fig.8 Efectofinoculumssizeongrowthand enzymeactivityfrom Halomonassp.WF6 2.6 酶解产物分析采用 TLC 初步分析该褐藻胶裂解酶对底物褐藻酸钠的降解产物由图 11 可以看出, 酶解反应产物主要由聚合度为二和三的褐藻寡糖组成与文献报道结果相比, 经 Halomonassp.WF6 褐藻胶裂解酶酶解所得的寡糖聚合度更低, 且成分更为单一 [14,23], 由此可见该酶在制备低聚合度的褐藻寡糖方面具有潜在的应用价值图 9 装液量对菌株 WF6 生长及产酶的影响 Fig.9 Efectofliquidvolumeongrowthand enzymeactivityfrom Halomonassp.WF6 2.5 优化后菌株 WF6 的生长及产酶曲线在优化后的最佳培养基组成和最适培养条件下, 菌株的生长及产酶状况如图 10 所示菌株生物量在 30h 达到最大,39h 产酶活力达到最高, 约 U/ml 与图 11 褐藻胶降解产物的 TLC 分析 Fig.11 TLCanalysisoftheenzymatic hydrolysatesofsodium alginate 1:Dimer;2:Trimer;3:Tetramer;4:Theenzymatichydrolysates ofsodiumalginate 3 结论对一株产褐藻胶裂解酶的菌株进行鉴定, 并对其

7 100 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.34No 产酶条件进行发酵优化经形态学生理生化特征和分子生物学鉴定, 将其鉴定为盐单胞菌属, 并命名为 Halomonassp.WF6 通过在摇瓶培养水平上进行单因素和多因素正交试验, 确定褐藻胶裂解酶产生菌 WF6 的最适产酶培养基为 : 褐藻酸钠 6.0g/L, 蛋白胨 5.0g/ L, 酵母粉 2.5g/L,NaCl30g/L,K + 5mmol/L 进而采用最适培养基进行产酶条件的优化, 优化后的发酵产酶条件为 : 初始 ph8.0, 培养温度 25, 接种量为 2%, 摇瓶装液量 30ml/250ml, 培养时间 39h 优化后的褐藻胶裂解酶酶活达 U/ml, 是优化前的 2.1 倍该酶对褐藻酸钠的酶解产物主要由聚合度为二和三的褐藻寡糖组成菌株 Halomonassp.WF6 的产酶培养基成分简单, 培养周期短, 酶解产物较为单一且聚合度低, 是一株有潜在应用价值的褐藻胶裂解酶生产新菌株参考文献 [1]FujibaraM,NagumoT.Aninfluenceofthestructureofalginate onthechemotacticactivityofmacrophagesandtheantitumer activity.carbohydrateresearch,1993,243(1): [2] WalD,DouglasS,FeroV,etal.Characterisationofthe anticoagulantpropertiesofarangeofstructuralydiversesulfated oligosaccharides.thrombosisresearch,2001,103(4): [3] NatsumeM, KamoY, HirayamaM, etal. Isolation and characterization ofalginate derived oligosaccharideswith root growthpromotingactivities.carbohydrateresearch,1994,258: [4] Holme H K, Lindmo K, Kristiansen A, etal. Thermal depolymerizationofalginate in the solid state. Carbohydrate Polymers,2003,54(4): [5] 杨钊, 张真庆, 管华诗. 一种新的褐藻胶寡糖制备方法氧化降解法. 海洋科学,2004,28(7): YangZ,ZhangZQ,GuanH S.Oxidationdepolymerization a newmethodforpreparationofalginateoligosaccharides.marine Sciences,2004,28(7): [6] ZhangZ,YuG,GuanH,etal.Preparationandstructure elucidationofalginateoligosaccharidesdegradedbyalginatelyase fromvibrosp.510.carbohydrateresearch,2004,339(8): [7]HaugA,MyklestadS,LarsenBR,etal.Corelationbetween chemicalstructureand physicalpropertiesofalginates. Acta ChemicaScandinavica,1967,21(3): [8] 李丽妍, 管华诗, 江晓路, 等. 海藻工具酶褐藻胶裂解酶研究进展. 生物工程学报,2011,27(6): LiLY,GuanH S,JiangX L,etal.Advancesinalgaetool enzymes:alginatelyase.chinesejournalofbiotechnology,2011, 27(6): [9] Tang J C, TaniguchiH, Chu H, etal. Isolation and characterization ofalginate degrading bacteria fordisposalof seaweedwastes.letersinappliedmicrobiology,2009,48(1) : [10]FarelEK,TiptonPA.FunctionalcharacterizationofAlgL,an alginate lyase from Pseudomonas aeruginosa. Biochemistry, 2012,51(51): [11] Gimmestad M, Ertesvag H, HeggesetT M B, etal. Characterization ofthree new Azotobactervinelandialginate lyases,oneofwhichisinvolvedincystgermination.journalof Bacteriology,2009,191(15): [12]MaLY,ChiZM,LiJ,etal.Overexpresionofalginatelyase ofpseudoaltetmonaselyakoviinescherichiacoli,purification, andcharacterizationoftherecombinantalginatelyase.world JournalofMicrobiologyandBiotechnology,2008,24(1): [13]MathR K,JinH M,Kim JM,etal.Comparativegenomics revealsadaptationbyalteromonassp.sn2tomarinetidal flat conditions:coldtoleranceandaromatichydrocarbonmetabolism. PloSOne,2012,7(4):e [14] 魏丹, 窦文芳, 李恒, 等. 高效降解褐藻胶新菌种的筛选, 鉴定及产酶条件优化. 食品与发酵工业,2012,38(7): WeiD,DouW F,LiH,etal.Isolation,identification,and fermentation optimization ofa high eficientnovelalginate degradingstrain.foodandfermentationindustries,2012,38 (7): [15]WeisburgW G,BarnsSM,PeletierDA,etal.16Sribosomal DNA amplification for phylogenetic study. Journal of Bacteriology,1991,173(2): [16] CeloFD,BevivinoA,ChiariniL,etal.Biodiversityofa Burkholderia cepacia Population Isolated from the Maize RhizosphereatDiferentPlantGrowth Stages. Applied and EnvironmentMicrobiology,1997,63(11): [17]MommaK,OkamotoM,MishimaY,etal.A novelbacterial ATP bindingcasetetransportersystem thatalowsuptakeof macromolecules.journalofbacteriology,2000,182(14) : [18] ElAhwanyA M D, ElboraiA M. Optimization ofmedium composition for extra celular alginate lyases of a marine bacterium.africanjournalofmicrobiologyresearch,2012,6 (10): [19] 侯保兵, 刘书来, 张建友, 等. 褐藻胶裂解酶产生菌的发酵优化研究, 水产科学.2009,28(11): HouBB,LiuSL,ZhangJY,etal.Optimizationofalginate

8 2014,34(9) 李恒等 : 褐藻胶裂解酶产生菌的分离鉴定及产酶发酵优化 101 degrading bacterial fermentation proces for alginate lyase production.fisheriesscience,2009,28(11): [20] Moo K I. Optimization ofculturing condition and medium compositionfortheproductionofalginatelyasebyamarinevibrio sp.ykw 34.JournalofOceanUniversityofChina,2008,7 (1): [21] 郭恩文, 王亚, 于文功, 等. 产双功能褐藻胶裂解酶菌株的筛选与初步研究, 现代生物医学进展,2013,13(29): Guo E W, Wang Y, Yu W G, et al. Screening and characterization of a bifunctional alginate lyase producing bacterium strain.progresinmodernbiomedicine,2013,13 (29): [22] 王霁宁, 严孝强, 杜宗军. 一株高效褐藻胶降解菌的筛选及其发酵条件的优化. 中国酿造,2012,31(5):7 10. WangJN,YanXQ,DuZJ.Screeningofalginatedegrading bacteria and optimization offermentation conditions. China Brewing,2012,31(5):7 10. [23]SimSJ,BaikKS,ParkSC,etal.Characterizationofalginate lyasegeneusingametagenomiclibraryconstructedfrom the434 gutmicrofloraofabalone.journalofindustrialmicrobiologyand Biotechnology,2012,39(4): IdentificationofanAlginateLyaseProducingStrainHalomonassp. WF6andFermentationOptimization LIHeng ZHUSi ting LIUXu mei GONGJin song JIANGMin XUZheng hong SHIJin song (SchoolofPharmaceuticalScience,JiangnanUniversity,Wuxi ,China) Abstract Aneficientalginate degradingstrainisolatedfrom rotenseaweedwasidentified.withthe resultsofmorphologicalproperties,physiologicalcharacteristicsaswelas16srdnasequencing,thestrainwas identifiedashalomonassp.wf6.thefermentationmediumcomponentwasoptimizedbybothsinglefactorand orthogonaltest,whichwascomposedofsodiumalginate6.0g/l,peptone5.0g/l,yeastextract2.5g/l,nacl 30g/L,K + 5mmol/L.Thisstrainwascultivatedat25 for39hwithoptimizedconditionsofinitialph8.0, inoculumsize2% andliquidvolume30ml/250ml,thealginatelyaseactivitywasincreasedto117.66u/ml, whichwas2.1 foldcomparedwiththecontrol.theenzymatichydrolysatesofsodiumalginatemainlyincludeddi andtri alginateoligosaccharides. Keywords Alginatelyase Halomonassp. Idendification Optimization

( H2 H4 H5), 1% 20 ml, 28, 150 r/min, 12 h, 620 nm 540 nm 1.4 褐藻酸裂解酶酶活的测定, DNS [10] 1.0 ml 10 ml, 1.0 ml ph %, min, 1.5 ml DNS, 5 min,,

( H2 H4 H5), 1% 20 ml, 28, 150 r/min, 12 h, 620 nm 540 nm 1.4 褐藻酸裂解酶酶活的测定, DNS [10] 1.0 ml 10 ml, 1.0 ml ph %, min, 1.5 ml DNS, 5 min,, 一株高效褐藻酸降解菌的筛选鉴定及其发酵条件的优化侯士昌 1, 温少红 1, 唐志红 1, 崔玉琳 2 2, 秦松 (1., 264003; 2., 264003) 摘要 : 以褐藻酸钠为唯一碳源, 从腐烂海带中筛选得到褐藻酸钠降解能力较强的菌株 H4, 经生理生化和 16S rdna 序列分析鉴定该菌株属于交替单胞菌属 (Alteromonas) 对菌株 H4 的发酵条件优化研究表明, H4 的较优培养基组成为