中华急诊医学杂志 2017 年 6 月第 26 卷第 6 期 ChinJEmergMed,June2017,Vol 26,No fromtheintensivecareunits(icus)ofchildren'shospital.methods From January2016toDe

Transcription

1 614 中华急诊医学杂志 2017 年 6 月第 26 卷第 6 期 ChinJEmergMed,June2017,Vol 26,No 6 儿童医院重症监护病房金黄色葡萄球菌分子特征的研究 儿科急危重症 刘颖超杨鑫王丽娟宋文琪董方姚开虎钱素云 摘要 目的了解儿童医院重症监护病房 (intensivecareunit,icu) 金黄色葡萄球菌 ( 简称金葡菌 ) 的分子学分型 毒力基因携带及耐药情况 方法收集鉴定 2016 年 1 月至 2016 年 12 月北京儿童医院新生儿及儿童 ICU 患儿临床送检标本中培养出的金葡菌, 采用头孢西丁纸片法和 meca 检测鉴定耐甲氧西林金葡菌 (methicilin resistantstaphylococusaureus,mrsa) 或甲氧西林敏感金葡菌 (methicilin susceptiblestaphylococusaureus,mssa); 对所有菌株进行多位点序列分型 (multilocussequencetyping,mlst) 和 spa 分型, 并对 MRSA 菌株进行葡萄球菌盒氏染色体 (staphylococcalcasetechromosomemec,sccmec) 分型 ; 采用 PCR 方法检测 21 种超抗原基因和杀白细胞素 (Panton Valentineleukocidin,pvl) 基因 ; 采用 E test 方法检测 12 种抗生素药物敏感性 使用 Fisher s 确切概率法比较 MRSA 与 MSSA 菌株在毒力因子携带及耐药方面的差异 结果共收集金葡菌 39 株 ( 其中 MRSA 菌株 18 株 ), 分别来源于肺炎 ( 包括重症肺炎 ) 败血症和皮肤软组织感染 ;ST59 SCCmecⅣa t437(55 6%) 和 ST398 t571(28 6%) 分别是 MRSA 和 MSSA 分离株最常见的流行克隆 26 株 (66 7%) 金葡菌菌株至少携带一种超抗原基因, 最常见的分别是 seb (38 5%) sek(30 8%) 和 seq(20 5%), 最常见的超抗原基因型为 seb sek seq, 占 18 0% 在本研究中,pvl 基因阳性率为 25 6%,MRSA 和 MSSA 分离株 pvl 基因携带率的差异无统计学意义 (P<0 05) 所有菌株的多重耐药率为 79 9%, 红霉素耐药率为 100%, 其次为青霉素 克林霉素和氯霉素, 耐药率分别为 94 9% 53 8% 和 51 3%, 均对复方新诺明 利福平 万古霉素和利奈唑胺敏感 结论儿童医院 ICU 金葡菌分离株主要来源于肺炎 败血症和皮肤软组织感染,MRSA 和 MSSA 分离株最常见的流行克隆分别是 ST59 SCCmecⅣa t437 和 ST398 t571 金葡菌分离株的超抗原基因携带率和多重耐药率较高 关键词 金黄色葡萄球菌 ; 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 ; 儿童 ; 重症监护病房 ; 分子分型 ; 毒力 ; 药物敏感性 ; 多重耐药 MolecularcharacteristicsofStaphylococcusaureusisolatedfrom intensivecareunitsofchildren's hospital LiuYingchao,YangXin,WangLijuan,SongWenqi,DongFang,YaoKaihu, QianSuyunPediatric IntensiveCareUnit, BeijingChildren shospital, CapitalMedicalUniversity, Beijing100045, China (LiuYC,YangX,WangLJ,QianSY); DepartmentofExamination, BeijingChildren shospital, CapitalMedicalUniversity, Beijing100045, China(SongWQ, DongF); KeyLaboratoryofMajor DiseasesinChildrenandNationalKeyDisciplineofPediatrics(CapitalMedicalUniversity),Ministryof Education,BeijingPediatricsResearchInstitute,BeijingChildren shospital,capitalmedicaluniversity, Beijing100045,China(YaoKH) Corespondingauthor:QianSuyun, syqian1211@163 com Abstract Objective TostudythemolecularcharacteristicsoftheStaphylococusaureusisolated DOI: /cma j isn 基金项目 : 国家自然科学基金 ( ); 北京市自然科学基金 ( ) 作者单位 : 北京, 首都医科大学附属北京儿童医院重症医学科 ( 刘颖超 杨鑫 王丽娟 钱素云 ), 检验科 ( 宋文琪 董方 ); 北京, 首都医科大学附属北京儿童医院 北京市儿科研究所 儿科学国家重点学科 教育部儿科重大疾病研究重点实验室, 国家呼吸系统疾病临床医学研究中心, 儿童呼吸道感染性疾病研究北京市重点实验室 ( 姚开虎 ) 通信作者 : 钱素云, syqian1211@163 com

2 中华急诊医学杂志 2017 年 6 月第 26 卷第 6 期 ChinJEmergMed,June2017,Vol 26,No fromtheintensivecareunits(icus)ofchildren'shospital.methods From January2016toDecember 2016,atotalof39S aureusstrainswerecolectedandidentifiedfromvariousclinicalspecimensthatwere obtainedfrompatientswhowereconfinedintheneonatalandpediatricicusofbeijingchildren'shospital. Methicilin resistants aureus(mrsa)andmethicilin susceptibles aureus(mssa)wereidentified usingthecefoxitindiscmethodandthedetectionofthemecagene.multilocussequencetyping(mlst) andspatypingwereanalyzedusingthepcr,andthestaphylococcalchromosomalcasetemec(sccmec) typewasanalyzed forthemrsa isolates. Twenty onesuperantigen genesand thepanton Valentine leukocidin(pvl)genewerealsodetectedbypcr.theirsusceptibilityto12antibioticswasevaluatedusing thee testmethod.thediferencesinprevalenceofvirulencegenesandantimicrobialresistancewere comparedbetweenthemrsaandmssaisolatesbyfisher'sexacttest.results AltheS aureusstrains wereisolatedfrom secretioninsidetheairwayofpneumonia(includingseverepneumonia),thebloodof patientswithbacteremia,andexudateofskinandsofttisueinfections.st59 SCCmecⅣa t437(55 6%) andst398 t571(28 6%)werethemostpredominantclonesofMRSAandMSSA,respectively.Ofthe39 isolates,26strains(66 7%)hadatleastonesuperantigengene,andseb(38 5%),sek(30 8%),and seq(20 5%)werethemostcommongenes;seb sek seq(18 0%)wasthemainvirulencegenotype.The pvlgene'spositiveratewas25 6%,andnosignificantdiferencebetweenMRSAandMSSAwasobserved (P>0 05).Notably,79 9% ofthes aureusisolatesweremultidrugresistant,and94 9%,53 8%,and 51 3% oftheisolateswereresistanttoerythromycin,clindamycin,andchloramphenicol,respectively.the testedisolatesweresusceptibletotrimethoprim/sulfamethoxazole,rifampicin,andvancomycin.conclusions TheS.aureusstrainsfromtheICUsofchildren'shospitalwereisolatedfromthesecretioninsidetheairway ofpneumonia(includingseverepneumonia),thebloodofpatientswithbacteremia,andexudateofskinand softtisueinfections.st59 SCCmecⅣa t437(55 6%)andST398 t571(28 6%)werethecommonclones ofmrsaandmssa,respectively.theprevalenceofsuperantigengenesandthemultidrugresistantrate wererelativelyhigh. Keywords Staphylococusaureus;Methicilin resistantstaphylococusaureus;pediatric;intensive careunit;molecularcharacteristics;virulence;antimicrobialsusceptibility;multidrugresistance 金黄色葡萄球菌 (staphylococusaureus, S aureus, 简称金葡萄 ) 是一种重要的人类病原菌, 它可以引起多种疾病, 从皮肤软组织感染到脓毒症 坏死性肺炎 骨髓炎等致死性疾病 [1] 20 世纪 60 年代, 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 (methicilin resistantstaphylococusaureus,mrsa) 的出现, 更是给临床治疗金葡菌感染带来了极大的挑战 金葡菌致病力强 耐药率高, 是儿童医院重症监护病房 (intensivecareunit,icu) 中最常见的革兰阳性致病菌, 且呈逐年上升的趋势 [2] 为了解儿童医院 ICU 金葡菌分离株的分子特征, 本研究对 2016 年度北京儿童医院新生儿和儿童 ICU 分离的金葡菌分离株进行了分子学分型 毒力基因分布和抗生素耐药性分析, 以期为防治 ICU 金葡菌感染提供理论依据 1 材料与方法 1 1 菌株的来源和鉴定所用菌株为 2016 年 1 月至 2016 年 12 月从首都医科大学附属北京儿童医院新生儿和儿童 ICU 临床送检标本中培养分离的金葡菌共 39 株 标本 来源为呼吸道 脓液 伤口 血液 穿刺液和分泌物 同一病例检测出的相同菌株作为 1 株 对各类临床标本进行培养, 通过菌落形态学鉴定出金葡菌, 然后通过凝固酶试验和 PCR 方法检测 nuc 基因进一步再确认 按照 2013 年美国临床实验室标准化研究所推荐的头孢西丁纸片 ( 英国 Oxoid 公司 ) 法及使用 PCR 方法检测 meca 基因进行 MRSA 菌株的筛选 以金葡菌标准株 ATCC25923 作为对照质控菌株 1 2 方法 DNA 提取溶葡萄球菌素 ( 加拿大 BBI 公司 ),1200U/mg; 硅胶模型 TM 基因组 DNA 提取试剂盒 ( 北京赛百盛公司 ), 严格按照试剂盒说明书操作 所提 DNA 作为所有 PCR 的模板 多位点序列 (multilocussequencetyping, MLST) 分型使用 PCR 扩增金葡菌的 7 个管家基因 :arcc aroe glpf gmk pta tpi 和 yqil 扩 [3] 增引物参考 Enright 等的设计 扩增出来的目的片段由北京天一辉远生物技术有限责任公司进行测序 测序结果在 MLST 数据网站 (htp: // www mlst net/) 上比对等位基因的序列型, 从而

3 616 中华急诊医学杂志 2017 年 6 月第 26 卷第 6 期 ChinJEmergMed,June2017,Vol 26,No 6 判定本株菌的 ST 类型 葡萄球菌盒氏染色体 (staphylococcal casetechromosomemec,sccmec) 及其亚型分型 [4 5] 采用 Milheirico 等提出的多重 PCR 的方法对所有的分离株进行 SCCmec 分型及亚型的检测 PCR 产物在含溴乙锭的 1 5% 的琼脂凝胶中电泳, 用凝胶成像仪观察和保存扩增结果 SCCmec 分型的标准菌株由日本顺天堂大学 TeruyoIto 教授馈赠 spa 分型 spa 分型的 PCR 扩增引物 : 上游引物 spaf: 5 GACGATCCTTCAGTGAGCAAAG 3 ; 下游引物 spar: 5 GCAGCAATTTTGTCAGCAGTAG 3 扩增的目的片段由北京天一辉远生物技术有限责任公司进行测序, 测序结果通过 spa 分型数据库 (htp: // spaserver ridom de/) 进行分型 [6] 毒力基因检测按照 Holtfreter 等的试验方法依次进行 5 组多重 PCR 反应 检测的基因为 19 种肠毒素基因和两种剥脱毒素基因 : (1) sea seh sec 和 tst 1;(2) sed etd eta 和 sek; (3) see seb sem sel 和 seo; (4) sen seg seq 和 [7] sej;(5)sei ser seu 和 sep 参照 Lina 等提供的方法检测杀白细胞素 (Panton Valentine leukocidin,pvl) 基因 PCR 产物在含溴乙锭的 1 5% 的琼脂凝胶中电泳, 用凝胶成像仪观察和保存扩增结果 药物敏感性实验根据 2013 年美国临床实验室标准化研究所制定的标准, 采用 E test 法 ( 法国梅里埃公司 ) 检测所有菌株对青霉素 (PEN) 头孢呋辛 (CXM) 红霉素 (ERY) 克林霉素 (CLI) 庆大霉素 (GEN) 复方新诺明 (SXT) 环丙沙星 (CIP) 氯霉素 (CHL) 四环素 (TCY) 利福平 (RIF) 万古霉素 (VAN) 利奈唑胺 (LNZ) 这 12 种抗生素的药物敏感性, 以金葡菌 ATCC29213 作为对照质控菌株, 记录所测菌的最低抑菌浓度 (minimalinhibitoryconcentration, MIC), 并计算 MIC 50 同时对 3 类或 3 类以上抗生素耐药的金黄色葡萄球菌菌株定义为多重耐药 [8] 1 3 统计学方法 使用 SPSS19 0 软件进行统计分析 正态分布且方差齐的计量资料用均数 ± 标准差 (x±s) 表示, 组间比较采用成组 t 检验 ; 非正态分布 方差不齐的计量资料用中位数 [M (P 25,P 75 ] 表示, 组间比较采用秩和检验 ; 计数资料用例数或菌株数 表示, 因总样本量小于 40, 故用 Fisher s 确切概率法 P<0 05 为差异具有统计学意义 2 结果 2 1 一般资料本研究共收集 39 株金葡菌感染分离株, 其中男性患儿 28 例, 女性患儿 11 例 ; 有 18 例来自城市,21 例来自农村 ; 中位年龄是 4 个月 (3d~8 岁 ); 入住 ICU 天数中位数为 13d(1d,57d), 总住院天数中位数为 17d(1d,60d) 从病种来源看, 肺炎以 27 例居首位 (69 2%), 其中重症肺炎占 48 1%, 共 13 例, 其次为败血症,7 例 (17 9%), 最后为皮肤软组织感染, 5 例 (12 8%), 包括结膜炎 2 例, 鼻部蜂窝织炎 1 例, 脐炎 1 例, 右臂蜂窝织炎 1 例 从治疗转归方面看, 好转出院 24 例, 自动出院 8 例, 转院 6 例, 死亡 1 例 39 株金葡菌分离株中,18 株为 MRSA, 21 株为甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌 (methicilin susceptiblestaphylococusaureus,mssa),mrsa 和 MSSA 分离株在患儿性别 居住地 总住院天数 入住 ICU 天数及病种方面的差异无统计学意义 (P >0 05) 2 2 分子分型在 18 株 MRSA 分离株中, 共检测出 5 种 ST 型, 最主要的是 ST59(13/18,72 2%), 其次为 ST22(2/18,11 1%),ST121 ST338 ST1224 均各 1 株 ( 分别占 5 6%) SCCmec 分型共检测出 2 种型别, 分别为 Ⅳa 型 (14/18,77 8%) 和 Ⅴ 型 (4/18,22 2%) spa 分型则以 t437 为主 (12/ 18), 占 66 7%, 其次为 t309 (2/18,11 1%), t441 t3485 t1765 各 1 株 ( 分别占 5 6%), 此外还有 1 株 spa 无法分型 ( 表 1) 综上所述, 在本研究中 MRSA 的流行克隆是 ST59 MRSA SCCmecⅣ a t437, 共 10 株, 所占比例为 55 6% 在 21 株 MSSA 分离株中则表现出更多样化的遗传背景 共检测出 10 种 ST 型, 以 ST398 为主 (6/21, 28 6%), 其次分别为 ST22 (3/21, 14 3%), ST59 ST15 ST6 ST5 各 2 株 (9 5%), ST188 ST88 ST25 ST1 各 1 株 (4 8%) spa 分型共有 11 种, 其中 6 株属于 t571 型 (28 6%),3 株属于 t309(14 3%), 各有 2 株属于 t084 t701 (9 5%), 而 t163 t437 t002 t1818 t189 t660 t127 各 1 株 (4 8%), 此外还

4 中华急诊医学杂志 2017 年 6 月第 26 卷第 6 期 ChinJEmergMed,June2017,Vol 26,No 有 1 株 spa 无法分型 ( 表 2) 综合上述基因分型, 在本研究中 MSSA 的流行克隆是 ST398 MSSA t571, 共 6 株, 所占比例为 28 6% ST59 t437 型,ST22 t309 型在 MRSA 与 MSSA 分离株中均存在 2 3 超抗原毒力基因及 pvl 基因携带情况在检测的 21 种超抗原基因中, 26 株 (66 7%) 至少携带一种超抗原基因,MRSA 和 MSSA 分离株超抗原基因的整体携带率分别为 83 3% (15/18) 和 52 3% (11/21), 两者差异无统计学意义 (P>0 05) 本研究中, 最常见的是 seb (15/39, 38 5%) sek (12/39, 30 8%) seq(8/39,20 5%), 最常见的超抗原基因型为 seb sek seq, 占 18 0% (7/39) 所所有菌株均未发现携带 see sen 基因 MRSA 分离株的 seb sek seq 基因携带率明显高于 MSSA 分离株 (P 值 <0 05)( 表 3) 不同 ST 分型分离株超抗原基因谱各有特点 ( 表 1 2) 15 株 ST59 型金葡菌分离株中有 10 株 (66 7%) 为 seb sek seq 和 seb sek 型, 占这两种型别的 91 0% (10/11) ST188 ST6 和 ST88 型分离株仅携带 1 种超抗原基因 而 ST5 ST25 型分离株则携带同时携带 6 种及以上超抗原基因, 且均 包含 sei sem seo 基因 ST398 和 ST15 型分离株未发现任何毒力基因 在本研究中共检测到 10 株 pvl 阳性金葡菌分离株 (10/39,25 6%) ( 表 3), 其中 5 株均属于 ST22 t309 型 (5/10,50%),3 株属于 ST59 t437 (3/10, 33 3%), 1 株属于 ST88 NT (1/10, 10%),1 株属于 ST338 t437(1/10,10%) ( 表 1 2) MRSA 和 MSSA 分离株的 pvl 携带率的差异无统计学意义 (27 8% vs 23 8%,P<0 05) 2 4 药物敏感性比较所有菌株均对复方新诺明 利福平 万古霉素和利奈唑胺敏感 红霉素耐药率为 100%, 其次为青霉素 克林霉素和氯霉素, 耐药率分别为 94 9% 53 8% 51 3% MRSA 对头孢呋辛和克林霉素的耐药率高于 MSSA, 且差异具有统计学意义 (P<0 05) 所有菌株的多重耐药率为 79 9% (30/39),MRSA 与 MSSA 的多重耐药率分别为 88 9% 66 7%, 两者差异无统计学意义 (P< 0 05) ( 见表 4) MRSA 菌株最常见的耐药表型是 CLI CHL PEN ERY (5/18,27 8%),MSSA 最常见的耐药表型是 PEN ERY (5/21,23 8%)( 见表 1 2) 表 1 18 株 MRSA 分离株分子学分型及超抗原基因型 耐药表型分布 Table1 Distributionofmolecularcharacterization,superantigengenotypesanddrug resistantphenotypesin18mrsaisolates MLST 分型 SCCmec 分型 spa 分型 pvl+ 超抗原基因型耐药表型 CLI PEN ERY (4),CLI CXM CHL PEN ERY (3), ST59(13) Ⅳa(13) t437(10) 2 seb sek seq(5),seb sek(3),nt a (2) CLI CHL PEN ERY (2),CLI CXM PEN ERY (1) t441(1) 0 seb sek seq(1) CLI CHL PEN ERY (1) t3485(1) 0 seb sek(1) CLI PEN ERY TCY (1) t1765(1) 0 NT a (1) CLI CHL PEN ERY (1) ST22(2) Ⅴ (2) t309(2) 2 sei(1),sei sem seo(1) PEN ERY (2) ST121(1) Ⅴ (1) NT(1) 0 sei sem seu eta(1) GEN CLI CHL PEN ERY (1) ST338(1) Ⅴ (1) t437(1) 1 sec sel tst 1(1) PEN ERY TCY (1) ST1224(1) Ⅳa(1) t437(1) 0 seb sek seq(1) CLI CHL PEN ERY (1) 注 : a NT 为未检测出 表 2 21 株 MSSA 分离株分子学分型及超抗原基因型 耐药表型分布 Table2 Distributionofmolecularcharacterization,superantigengenotypesanddrug resistantphenotypesin21mssaisolates MLST 分型 spa 分型 pvl+ 超抗原基因型耐药表型 ST398(6) t571(6) 0 NT a (6) CHL PEN ERY (1),GEN CLI CHL PEN ERY (2),PEN CIP ERY (1),ERY (2) ST22(3) t309(3) 3 sem seo(1),sei sem seo(1),nt a (1) CHL PEN ERY (2),PEN ERY TCY (1) ST59(2) t163(1) 0 seb(1) GEN CLI PEN ERY (1) t437(1) 1 NT a (1) CLI CHL PEN ERY TCY (1) ST15(2) t084(2) 0 NT a (2) CHL PEN CIP ERY (1),CLI PEN ERY TCY (1) ST6(2) t701(2) 0 sea(1),seb(1) CHL PEN ERY (1),PEN ERY (1)

5 618 中华急诊医学杂志 2017 年 6 月第 26 卷第 6 期 ChinJEmergMed,June2017,Vol 26,No 6 续表 1 MLST 分型 spa 分型 pvl+ 超抗原基因型 耐药表型 ST5(2) t002(1) 0 sec sed sei sej sel sem seo ser(1) GEN CLI CHL PEN ERY (1) t1818(1) 0 sec sed sei sel sem seo ser(1) GEN CLI CHL PEN CIP ERY (1) ST188(1) t189(1) 0 seb(1) PEN ERY (1) ST88(1) NTa(1) 1 sep(1) PEN ERY (1) ST25(1) t660(1) 0 seb seg sei sem seo etd(1) PEN ERY (1) ST1(1) t127(1) 0 sea seh sek seq(1) PEN ERY (1) 注 : a NT 为未检测出 表 3 39 株金葡菌分离株超抗原基因携带情况 ( 株,%) Table3 Detectionofsuperantigengenesof39S aureusisolates(strain,%) 组别 sea seb sec sed se seq seh sei sej sek sel sem sen seo sep seq ser seu eta etd tst 1 pvl MRSA (n=18) 0 11(61 1)1(5 6) (16 7) 0 11(61 1)1(5 6)2(11 1) 0 2(11 1) 0 7(62 7) 0 1(5 6) 1(5 6) 0 1(5 6)5(27 8) MSSA 3(14 3)4(19 0)2(9 5) 2(9 5) 0 1(4 8) 1(4 8)4(19 0)1(4 8) 1(4 8) 2(9 5)5(23 8) 0 5(23 8)1(4 8) 1(4 8) 2(9 5) 0 0 1(4 8) 0 5(23 8) (n=21) 合计 3(7 7)15(38 5)3(7 7) 2(5 1) 0 1(2 6) 1(2 6)7(17 9)1(2 6)12(30 8)3(7 7)7(17 9) 0 7(17 9)1(2 6)8(20 5)2(5 1) 1(2 6) 1(2 6) 1(2 6) 1(2 6) 10(25 6) (n=39) P 值 a 注 : a MRSA 与 MSSA 比较 抗生素 耐药率 (%) 表 4 39 株金葡菌分离株药物敏感性结果 Table4 Resultsoftheantimicrobialsusceptibilityof39S aureusisolates MIC 范围 (mg/l) MRSA (n=18) MIC 50 (mg/l) 耐药株数 耐药率 (%) MIC 范围 (mg/l) MSSA (n=21) MIC 50 (mg/l) 耐药株数 耐药率 (%) 青霉素 ~ ~ 头孢呋辛 ~ ~ 红霉素 ~512 > ~512 > 克林霉素 ~512 > ~ 庆大霉素 ~ ~ 复方新诺明 ~ ~ 环丙沙星 ~ ~ 氯霉素 ~ ~ 四环素 ~ ~ 利福平 ~ ~ 万古霉素 0 0 5~ ~ 利奈唑胺 0 2~ ~ 多重耐药 注 : a MRSA 与 MSSA 比较 a P 值 3 讨论重症监护病房的患者具有住院时间长 外科干预多 侵入性操作多的特点 [9], 再加上儿童的免疫系统相对发育不成熟, 均是导致 ICU 患儿发生感染的高危因素 而金葡菌是 ICU, 特别是儿童医院 ICU 常见的病原菌之一, 占革兰阳性球菌的 19 3%, 其次为大肠杆菌和表皮葡萄球菌 [2,10 11] 分子生物学分型对监测菌株遗传背景 同源性, 确定爆发流行菌株的基因型及扩散趋势具有十分重要的意义 在世界不同地区的重症监护病房,MRSA 的流行克隆不同, 在欧洲以 ST8 和 ST22 为主 [12], 在美国以 ST5 (USA100) 和 ST8 (USA300) 为主 [13], 我国台湾地区以 ST59 为主 [14], 而在我国成人重症监护病房 MRSA 分离株则以 ST239 为主 [15 16] 在本研究中, 儿童医院重症监护病房 MRSA 分离株最常见的 ST 型为 ST59, 这与 2012 年本课题组的报道相一致 [17] 与 MRSA 相比,MSSA 感染分离株通常表现出更多样化的基因背景, 在本研究中共发现 10 种 ST 分型, 最主要的是 ST398 MSSA t571( 占 28 6%), 这一结果与王辉等人的报道相一致, 但与我国南方

6 中华急诊医学杂志 2017 年 6 月第 26 卷第 6 期 ChinJEmergMed,June2017,Vol 26,No 及世界其他地区, 如巴西 荷兰 中国台湾地区等地不同 [18 21] 值得注意的是,ST398 型是 21 世纪初在 MRSA 菌株中发现的一类特殊 ST 型别, 它与牲畜和从事与牲畜相关工作的人群有关 [22], 可造成人类皮肤软组织感染 感染性心内膜炎 骨髓炎等 2012 年对我国七城市儿童 MRSA 感染分离株的研究中曾发现 2 株 ST398 MRSA t034 菌株, 且该患儿均来自农村 [17] 在本研究中儿童医院 ICU 的 MSSA 菌株以 ST398 型为流行克隆, 除一例患儿来自农村外, 其余均来自城市 近期有研究显示 MSSAST398 型菌株的来源更加多样化, 除猪 牛等牲畜外, 在从事牛乳 牛肉 烧烤等相关制品的人群中也发现了该型别, 且 ST398 克隆的 MSSA 菌株对四环素 大环内酯类 / 林可酰胺类抗生素 氨基糖苷类抗生素 环丙沙星 壮观霉素 奎奴普汀 / 达福普汀的耐药率较非 ST398 克隆菌株更高 [23], 因此该克隆的出现应当引起重视并密切观察 既往通常认为 MRSA 的出现是由于 MSSA 获得了 SCCmec 从而形成了 MRSA [24], 因此这可能揭示了 MSSAST398 克隆作为 MRSA ST398 克隆出现的 储蓄池 的作用 SCCmec 是 MRSA 特征性分子结构, 根据 mec 复合体和 ccr 复合体的不同, 可将 SCCmec 分为 Ⅰ ~Ⅺ 型, 根据 J 区不同, 又可分为许多亚型 [25] 既往 SCCmec 分型被认为是区分医院获得性 (hospital asociated, HA ) 和社区获得性 (community asociated,ca )MRSA 的一项重要分子标志 有研究证实, 在我国儿童 CA MRSA 菌株的流行克隆是 ST59 SCCmecⅣ /Ⅴ 和 ST338 SCCmec Ⅳ /Ⅴ (ST59 和 ST338 仅有一个位点变异 ) [26], 而 HA MRSA 菌株的主要流行克隆是 ST239 SCCmec Ⅲ [27] 在本研究中, 儿童医院 ICUMRSA 分离株的流行克隆是 ST59 MRSA SCCmecⅣa, 这与之前的报道相一致, 这说明本研究中的 MRSA 菌株可能属于社区获得性 但近期一些研究在 HA MRSA 菌株中发现了 Ⅳ 型 SCCmec, 而 Ⅲ 型 SCCmec 在 HA MRSA 和 CA MRSA 中均被发现 [28 29], 说明这两种 SCCmec 型别可能在社区和院内相互传播 因此 HA 和 CA MRSA 之间的界限越来越模糊了 应该通过临床特征, 而不是分型来定义 MRSA 菌株 有研究在中国台湾地区发现 ST59 Ⅳ 和 ST59 Ⅴ 克隆可导致院内获得性感染, 并且该克隆占院内血流感染的 25% [30] ; 在韩国,24% 的院内相关菌 血症主要由 CA MRSA 相关 ST72 SCCmecⅣ 克隆造成的 [31] ; 在我国大陆, 在社区最常见的克隆型 ST59 SCCmecⅣ /Ⅴ, 可导致儿童院内感染, 且患儿年龄更小 侵入性感染更多见 [27] 在本研究中, 儿童重症监护病房 MRSA 感染分离株的流行克隆是 ST59 MRSA SCCmecⅣa, 而未发现 HA MRSA 菌株的代表 ST239 SCCmecⅢ 菌株 HA MRSA 菌株的逐渐减少, 这可能是由于 CA MRSA 携带基因片段短的 Ⅳ Ⅴ Ⅶ 型 SCCmec, 与 HA MRSA 相比更易适应外界环境, 生长率更高且更易于在人体内繁殖 ; 同时 CA MRSA 菌株比 HA MRSA 具有更强的毒力和菌落蔓延能力, 致病性 侵袭性更强 [32] 因此, 加强对金葡菌感染分离株基因型的监测, 有助于对菌株致病力 耐药性变化的了解 金葡菌通过释放多种细胞外毒素, 如超抗原毒素 PVL 等而表现出较强的致病性 PVL 是属于双组份毒素家族的一种金黄色葡萄球菌特有的外毒素, 由 lukf PV luks PV 基因编码, 通过在细胞膜上产生孔来杀伤白细胞, 是导致坏死性肺炎 皮肤软组织感染的重要毒素 [33] 以往曾认为 PVL 是 CA MRSA 特征性的分子标志, 在我国儿童 CA MRSA 分离株中 pvl 基因携带率达 58 6% [26], 在本研究中, 儿童重症监护室 MRSA 分离株的 pvl 基因携带率较低, 占 27 8% 近期不断有研究证实 pvl 基因也存在于 MSSA 中, 如在我国重庆,MSSA 菌株的 pvl 基因携带率为 27 4%, 与本研究相似 [34] 超抗原毒素的基因位于可移动基因元件上, 如致病岛 噬菌体和质粒上, 其编码的超抗原毒素包括肠毒素 (enterotoxin) 中毒性休克综合征毒素 (toxicshocksyndrometoxin,tsst) 剥脱性毒素 (exfoliativetoxin), 能够显著改变宿主的免疫功能, 诱发高热 增强宿主对毒素杀伤效应的敏感性, 并诱导 T 淋巴细胞增殖 [35] 超抗原毒素基因在不同地理来源的菌株中呈现多样性分布 在韩国的金葡菌分离株中, 有 50 8% 的菌株携带至少一种超抗原基因, 最常见的是 tst 1, 其次是 seb sea sed see sec [36] ; 在美国, 有超过 99% 的伤口和血液分离的金葡菌分离株携带至少一种超抗原基因, 最常见的是 ser, 其次是 sep sek sem sei [37] ; 在我国, 儿童金葡菌菌株中有 88 9% 携带毒力基因, 最常见的依次为 sek seq 和 seb [38] 在本研究中, 儿童医院 ICU 金葡菌分离株超抗原基因携带率稍低, 占 66 7%, 最主要的毒力基因与之前的报道

7 620 中华急诊医学杂志 2017 年 6 月第 26 卷第 6 期 ChinJEmergMed,June2017,Vol 26,No 6 一致 超抗原基因谱在不同 ST 分型金葡菌中亦各具特点 ST59 型菌株最常见的基因谱为 seb sek seq; 在日本和中国台湾地区则以 seb 为主 [39 40] 此外,ST5 和 ST25 菌株携带同时携带 7 种及以上超抗原基因, 且均包含 sei sem seo 基因 sei sem seo 是肠毒素基因簇一部分, 它包括 seg sei sem sen seo, 被认为可能在菌株致病中发挥重要作用, 该克隆菌株均来自肺炎及败血症患者, 因此以上两种克隆需引起重视 ICU 是医院中抗生素使用率最高和抗生素耐药情况最严重的地方 自从世界上第一例耐万古霉素的金黄色葡萄球菌出现, 更是给金葡菌感染的治疗造成了新的挑战 在本研究中, 儿童医院 ICU 金葡菌菌株的多重耐药率达 79 9%, 且所有菌株均对红霉素耐药, 对青霉素耐药率为 94 9%, 对克林霉素和氯霉素的耐药率也均大于 50%, 和 Geng [26] 等的研究一致, 但高于欧洲地区 [41] 值得注意的是, 在本研究中 MSSA 菌株的多重耐药率也达到了 66 7%, 这比之前重庆地区 MSSA 的耐药率 44 4% 和北京地区 MSSA 多重耐药率 22 6% 均高 [34,42] 其中 ST5 型 MSSA 菌株均对 5 种及以上抗生素耐药, 同时携带多种毒力基因, 因此多重耐药的 MSSA 也应该引起高度重视 总之, 了解儿童医院 ICU 金葡菌分离株的分子学特征, 有助于发现菌株流行的重要环节线索, 为进一步采取有效的感染控制措施阻断其传播及爆发流行提供分子流行病学依据 在 ICU 病房更要做好金葡菌感染, 特别是多重耐药菌株患者的隔离并加强院感控制措施, 尽可能避免交叉感染及暴发流行 参考文献 [1] LowyFD.Staphylococcusaureusinfections[J].NEnglJMed, 1998, 339 ( 8 ): DOI: / NEJM [2] LeeCY,ChenPY,HuangFL,etal.Microbiologicspectrum and susceptibilitypaternofclinicalisolatesfromthepediatricintensive careunitinasinglemedicalcenter 6years'experience[J].J MicrobiolImmunolInfect,2009,42(2): [3] EnrightMC,DayNP,DaviesCE,etal.Multilocussequence typingforcharacterizationofmethicilin resistantandmethicilin susceptibleclonesofstaphylococcusaureus[j].jclinmicrobiol, 2000,38(3): [4] MilheiricoC,OliveiraDC,deLencastreH.MultiplexPCRstrategy forsubtypingthestaphylococcalcasetechromosomemectypeivin methicilin resistantstaphylococcusaureus:'sccmecivmultiplex' (vol60,pg42,2007) [J].JAntimicChemother,2007,60 (3): DOI: /jac/dkm112. [5] MilheiricoC,OliveiraDC,deLencastreH.Updatetothemultiplex PCRstrategyforasignmentofmecelementtypesinStaphylococcus aureus(vol51,pg3374,2007) [J].AntimicrobialAgentsand Chemotherapy,2007,51 (12): DOI: / AAC [6] HoltfreterS,GrumannD,SchmuddeM,etal.Clonaldistribution ofsuperantigen genesin clinicalstaphylococcusaureusisolates [J].JClinMicrobiol,2007,45 (8): DOI: /JCM DOI: / [7] LinaG,PiemontY,Godail GamotF,etal.InvolvementofPanton Valentineleukocidin producingstaphylococcusaureusinprimary skininfectionsandpneumonia[j].clininfectdis,1999,29 (5): DOI: / [8] MagiorakosAP, Srinivasan A, CareyRB, etal. Multidrug resistant,extensivelydrug resistantandpandrug resistantbacteria: aninternationalexpertproposalforinterim standarddefinitionsfor acquiredresistance[j].clinmicrobiolinfect,2012,18 (3): DOI: /j x. [9] ChenM,ZhuRJ,ChenF,etal.Clinicalanalysisofcentralvenous catheter relatedinfectionsinpatientsintheemergencyicu [J]. WorldJEmergMed,2013,4 (3): DOI: / wjem.j.isn [10] 王远芳, 康梅. 急诊科感染患者微生物标本送检及临床分离菌分布和耐药分析 [J]. 中华急诊医学杂志,2016,25(4): DOI: /cma.j.isn [11] 邓医宇, 申凤彩, 林琼瑜, 等. 重症监护病房内血流感染危险因素及预后分析 [J]. 中华急诊医学杂志,2015,24 (12): DOI: /cma.j.isn [12] HetemDJ,DerdeLP,EmpelJ,etal.Molecularepidemiologyof MRSA in 13 ICUs from eighteuropean countries[j]. J AntimicrobChemother,2016,71(1):45 52.DOI: / jac/dkv298. [13] NairN,KourbatovaE,PooleK,etal.Molecularepidemiologyof methicilin resistantstaphylococcus aureus (MRSA) among patientsadmitedtoadultintensivecareunits:thestar ICU trial[j].infectcontrolhospepidemiol,2011,32 (11): DOI: / [14] KuoCY,HuangYC,HuangDT,etal.Prevalenceandmolecular characterization of Staphylococcus aureus colonization among neonatalintensivecareunitsintaiwan[j].neonatology,2014, 105(2): DOI: / [15] 秦永新, 李青栋, 万献尧, 等. 重症医学科内耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的分子流行病学调查 [J]. 中华医学杂志, 2016,96 (41): DOI: /cma. j. isn [16] WiliamsonK,BisagaA,PaqueteK,etal.Theprevalenceof methicilin resistant Staphylococcus aureus colonization in emergencydepartmentfasttrackpatients[j].worldjemerg Med,2013,4 (4): DOI: /wjem. j. isn [17] 刘颖超, 耿文静, 吴德静, 等. 中国七城市儿童耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染分离株分子学特征的研究 [J]. 中华儿科杂志,2012,50(1):38 44.DOI: /cma.j.isn [18] Andrade FigueiredoM,Leal BalbinoTC.Clonaldiversityand epidemiologicalcharacteristicsofstaphylococcus aureus: high prevalenceofoxacilin susceptiblemeca positivestaphylococcus aureus(os MRSA) asociatedwithclinicalisolatesin Brazil [J].BMCMicrobiol,2016,16 (1):115.DOI: / s [19] ChiuYK,LoWT,WangCC.Riskfactorsandmolecularanalysis of Panton Valentine leukocidin positive methicilin susceptible Staphylococcusaureuscolonizationandinfectioninchildren[J]. JMicrobiolImmunolInfect,2012,45(3): DOI:10.

8 中华急诊医学杂志 2017 年 6 月第 26 卷第 6 期 ChinJEmergMed,June2017,Vol 26,No /s [20] RijndersMI,DeurenbergRH,BoumansML,etal.Population structureofstaphylococcusaureusstrainsisolatedfrom intensive careunitpatientsinthenetherlandsoveran11 yearperiod(1996 to2006) [J].JClinMicrobiol,2009,47(12): DOI: /JCM [21] LiuC,ChenZJ,SunZ,etal.Molecularcharacteristicsand virulence factors in methicilin susceptible, resistant, and heterogeneousvancomycin intermediatestaphylococcusaureusfrom central southernchina[j].jmicrobiolimmunolinfect,2015, 48(5): DOI: /j.jmi [22] SmithTC,PearsonN.TheemergenceofStaphylococcusaureus ST398[J].VectorBorneZoonoticDis,2011,11 (4): DOI: /vbz [23] VandendriescheS,VanderhaeghenW,LarsenJ,etal.High geneticdiversityofmethicilin susceptiblestaphylococcusaureus (MSSA) from humansand animalson livestock farmsand presenceofsccmecremnantdna in MSSA CC398 [J]. J AntimicrobChemother,2014,69 (2): DOI: /jac/dkt366. [24] Hasman H, Moodley A, GuardabasiL, etal. Spa type distributioninstaphylococcusaureusoriginatingfrom pigs,catle andpoultry[j].vetmicrobiol,2010,141 (3 4): DOI: /j.vetmic [25] LiuJ,ChenD,PetersBM,etal.Staphylococcalchromosomal casetes mec (SCCmec): A mobile genetic element in methicilin resistantstaphylococcusaureus[j].microbpathog, 2016,101:56 67.DOI: /j. micpath [26] GengW,YangY,WuD,etal.Molecularcharacteristicsof community acquired,methicilin resistantstaphylococcusaureus isolated from Chinese children [J]. FEMS ImmunolMed Microbiol,2010,58(3): DOI: /j X x. [27] NingX,SunM,QiaoY,etal.Characterizationofpediatric hospital asociated infection caused by methicilin resistant Staphylococcusaureus in mainland China [J]. InfectDis (Lond),2015,47(6): DOI: / [28] OrendiJM,CoetzeeN,ElingtonMJ,etal.Communityand nosocomialtransmision ofpanton Valentine leucocidin positive community asociatedmeticilin resistantstaphylococcusaureus: implicationsforhealthcare[j].jhospinfect,2010,75(4): DOI: /j.jhin [29] HetemDJ,WesthH,BoyeK,etal.Nosocomialtransmisionof community asociatedmethicilin resistantstaphylococcusaureus indanishhospitals[j].jantimicrobchemother,2012,67 (7): DOI: /jac/dks125. [30] HuangYC,SuLH,WuTL,etal.Changingmolecularepidemiology ofmethicilin resistantstaphylococcusaureusbloodstream isolates fromateachinghospitalinnortherntaiwan[j].jclinmicrobiol, 2006,44(6): DOI: /JCM [31] ParkSH,ParkC,YooJH,etal.Emergenceofcommunity asociatedmethicilin resistantstaphylococcusaureusstrainsasa causeofhealthcare asociated bloodstream infectionsin Korea [J].InfectControlHospEpidemiol,2009,30 (2): DOI: / [32] KaitoC,SaitoY,NaganoG,etal.Transcriptionandtranslation productsofthecytolysingenepsm meconthemobilegenetic elementsccmecregulatestaphylococcusaureusvirulence[j]. PLoSPathog,2011,7(2):e [33] GravetA,ColinDA,KelerD,etal.Characterizationofanovel structural member, LukE LukD, of the bi component staphylococcalleucotoxinsfamily[j].febslet,1998,436 (2): DOI: /S (98) [34] YangY,HuZ,ShangW,etal.MolecularandPhenotypic CharacterizationRevealedHighPrevalenceofMultidrug Resistant Methicilin Susceptible Staphylococcus aureus in Chongqing, SouthwesternChina[J].MicrobDrugResist, (2): DOI: /mdr [35] SauerP,SilaJ,StosovaT,etal.Prevalenceofgenesencoding extracelular virulence factors among meticilin resistant Staphylococcusaureus isolates from the University Hospital, Olomouc,CzechRepublic[J].JMedMicrobiol,2008,57(Pt 4): DOI: /jmm [36]ChungJW,KarauMJ,Grenwod QuaintanceKE,etal.Superantigen profilingofstaphylococusaureusinfectiveendocarditisisolates[j]. DiagnMicrobiolInfectDis,2014,79(2): DOI: /j. diagmicrobio [37] VarshneyAK,MediavilaJR,RobiouN,etal.Diverseenterotoxin geneprofilesamongclonalcomplexesofstaphylococcusaureusisolates fromthebronx,newyork[j].applenvironmicrobiol,2009,75 (21): DOI: /AEM [38] WuD,LiX,YangY,etal.Superantigengeneprofilesand presence of exfoliative toxin genes in community acquired meticilin resistantstaphylococcusaureusisolated from Chinese children[j].jmedmicrobiol,2011,60(pt1):35 45.DOI: /jmm [39] HiguchiW,HungWC,TakanoT,etal.Molecularcharacteristics ofthetaiwanesemultipledrug resistantst59cloneofpanton Valentine leucocidin positive community acquired methicilin resistantstaphylococcusaureusfrom pediatriccelulitis[j].j InfectChemother,2010,16 (2): DOI: / s [40] TakanoT,HiguchiW,ZaraketH,etal.Novelcharacteristicsof community acquired methicilin resistantstaphylococcus aureus strainsbelongingtomultilocussequencetype59intaiwan[j]. AntimicrobAgentsChemother,2008,52(3): DOI: /AAC [41] HanbergerH,ArmanD,GilH,etal.Surveilanceofmicrobial resistanceineuropeanintensivecareunits:afirstreportfromthe Care ICUprogrammeforimprovedinfectioncontrol[J].Intensive CareMed,2009,35 (1): DOI: /s y. [42] ZhaoC,LiuY,ZhaoM,etal.Characterizationofcommunity acquiredstaphylococcusaureusasociatedwithskinandsofttisue infectioninbeijing:highprevalenceofpvl+st398[j].plos One,2012,7 (6):e38577.DOI: /journal. pone ( 收稿日期 : ) ( 本文编辑 : 何小军 )