j.ajcem

American Journal of Clinical and Experimental Medicine 2015; 3(6): 338-343 Published online December 5, 2015 (http://www.sciencepublishinggroup.com/j/ajcem) doi: 10.11648/j.ajcem.20150306.11 ISSN: 2330-8125 (Print); ISSN: 2330-8133 (Online) The Interaction Between Recombinant Protein F Derived from Nontypeable Haemophilus influenzae and Lipoprotein(a) Liu En 1, 2, Li Weng-long 1, 2 1, 2, *, Han Run-lin 1 College of Veterinary Science, Inner Mongolia Agriculture University, Hohhot, China 2 Research Center of Plasma Lipoprotein Immunology, Inner Mongolia Agriculture University, Hohhot, China Eamil address: han-runlin@163.com (Han Run-lin), liuen1989xiaoxiang@163.com (Liu En) To cite this article: Liu En, Li Weng-long, Han Run-lin. The Interaction Between Recombinant Protein F Derived from Nontypeable Haemophilus influenzae and Lipoprotein(a). American Journal of Clinical and Experimental Medicine. Vol. 3, No. 6, 2015, pp. 338-343. doi: 10.11648/j.ajcem.20150306.11 Abstract: Protein F (PF) is a surface plasminogen (Plg) receptor on the nontypeable Haemophilus influenzae (NTHi). Plg via its lysine binding sites (LBS) can bind to PF. Apolipoprotein(a) [Apo(a)] is one component of Lipoprotein(a) [Lp(a)]. It has Kringle (K) domains, which contain LBS and has a high homology with Plg. Therefore, we speculated that Lp(a) might bind to Plg receptor on the surface of NTHi, subsequently competitively inhibiting the interaction of NTHi with Plg. In this study, recombinant PF (rpf) and its C-terminal lysine residue-deleted variant (rpf K) were expressed in E. coli BL21. The interactions of rpf with Plg and Lp(a) were tested by ELISA. The results showed that rpf could bind to Plg and Lp(a). The binding capacity of rpf was significantly higher than that of rpf K. The interactions of rpf with Plg and Lp(a) could be inhibited by EACA. 2 mmol/l of EACA significantly inhibited the binding of rpf to Plg, while 0.2 mmol/l of EACA could significantly reduce the binding of rpf to Lp(a). 50 ng/100 µl Lp(a) could significantly inhibit the interaction of rpf with Plg. In addition, affinity chromatography assay followed by Western biotting was also used to study the interaction. In overall, C-terminal lysine residue of rpf and the lysine binding sites (LBS) of Plg and Lp(a) should be responsible for these specifically bindings. Lp(a) could combine with rpf consequently inhibiting the interaction of Plg with rpf. This revealed that Lp(a) might play a role in anti-nthi infection. Keywords: Nontypeable Haemophilus Influenzae, Plasminogen, Lipoprotein(a), Recombinant Protein F 重组不可分型流感嗜血杆菌 F 蛋白与脂蛋白 (a) 的相互作用 1,2 1,2 刘恩, 李文龙, 韩润林 1 1,2,* 兽医学院, 内蒙古农业大学, 呼和浩特, 中国血浆脂蛋白免疫学研究中心, 内蒙古农业大学, 呼和浩特, 中国 2 邮箱 han-runlin@163.com( 韩润林 ),liuen1989xiaoxiang@163.com( 刘恩 ) 摘要 :F 蛋白 (Protein F, PF) 是不可分型流感嗜血杆菌 (nontypeable Haemophilus influenzae, NTHi) 表面的一种纤溶酶原 (Plg) 受体 Plg 利用自身的赖氨酸结合位点 (LBS) 与 PF 结合 脂蛋白 (a)[lipoprotein(a), Lp(a)] 中的载脂蛋白 [Apolipoprotein(a), Apo(a)] 与 Plg 都具有 K 结构域, 两者高度同源 基于此, 本实验研究了 PF 与 Plg Lp(a) 的相互作用, 并推测 Lp(a) 通过与 NTHi 上的 Plg 受体结合, 竞争性抑制 NTHi 与 Plg 的结合 本实验利用大肠杆菌 BL21 表达得到重组 PF(rPF) 及缺失末端赖氨酸残基的 PFΔk(rPFΔk) 通过 ELISA 试验检测 rpf 与 Plg Lp(a) 的相互作用, 结果显示 :rpf 能够与 Plg Lp(a) 结合, 且 rpf 组与 Plg Lp(a) 的结合显著高于 rpfδk 组 6- 氨基己酸 (EACA) 能够抑制 rpf 与 Plg Lp(a) 的结合, 当浓度达到 2 mmol/l 时 EACA 对 rpf 与 Plg 结合的抑制作用显著增强 对 rpf 与 Lp(a) 结合的抑制在浓度为 0.2 mmol/l 时明显增强 Lp(a) 浓度达到 50 ng/100 μl 时, 能够显著的抑制 rpf 与 Plg 结合 此外, 亲和色谱层析和 Western blot 也证明 rpf 与 Plg Lp(a) 的特异性结合主要是通过 Plg Lp(a) 的 LBS 与 rpf 羧基末端的赖氨酸残基作用进行的 Lp(a) 对 rpf 与 Plg 结合的竞争性抑制作用表明 Lp(a) 在抗 NTHi 感染过程中可能具有重要作用 关键词 : 不可分型流感嗜血杆菌, 纤溶酶原, 脂蛋白 (a), 重组 F 蛋白

339 刘恩等 : 重组不可分型流感嗜血杆菌 F 蛋白与脂蛋白 (a) 的相互作用 1. 引言 流感嗜血杆菌 (Haemophilus influenzae, Hi) 发现于 1892 年, 是一种革兰阴性球杆菌, 可以引起不同的疾病 根据荚膜多糖的有无可以分为荚膜型 ( 可分型 ) 及非荚膜型 ( 不可分型 ) 荚膜是侵袭性 Hi 主要的毒力因子, 荚膜型菌株又分为六个型 (a-f), 其中 b 型 (Hib) 毒力最强 [1] 二十世纪九十年代 Hib 结合疫苗的应用使得由 Hib 引起的侵袭性疾病的发病率显著降低 [2] 和荚膜型 Hi 不同, 不可分型流感嗜血杆菌 (nontypeable Haemophilus influenzae,nthi) 是人体特别是儿童呼吸道内的共栖菌, 很少引起侵袭性疾病 [3] NTHi 也是一种条件致病菌, 当宿主免疫机能降低时能够造成感染 NTHi 主要引起呼吸道局限性疾病如急性中耳炎 支气管炎 鼻窦炎等 [4-5] 和许多病原菌一样,NTHi 能够利用 Plg 黏附到宿主的胞外基质 (ECM) 对其进行破坏, 进而对宿主造成损伤 Plg 是一种单链糖蛋白, 是人体纤溶系统的重要组成成分 Plg 由 791 个氨基酸构成, 分子量大约为 90 kd, 具有 7 个结构域 [6] 构成 Plg 的 7 个结构域中有 5 个 Kringle 结构域 (Kl,K2,K3,K4,K5), 这 5 个结构域中都包含 LBS, 此位点可识别 Plg 受体羧基末端的赖氨酸残基, 而赖氨酸或赖氨酸类似物 ( 如 EACA, 氨甲环酸等 ) 可竞争性抑制 Plg 与其受体的结合 [7] 包括铜绿假单胞菌, 伯氏疏螺旋体, 肺炎链球菌, 金黄色葡萄球菌和白色念珠菌在内的大多数病原微生物都能同时表达几种不同的 Plg 受体 已有的研究发现,NTHi 表面的 E 蛋白 [8] 天冬氨酸酶 [9] 及新发现的 P4 蛋白 [10] 都是 NTHi 上的 Plg 受体 PF 是 NTHi 菌体细胞表面的结构蛋白, 由 293 个氨基酸残基组成, 成熟的 PF 分子量为 30.1 kd[11], 其羧基末端具有一个赖氨酸残基 研究表明 PF 参与了 NTHi 逃避宿主补体免疫的过程, 促进了 NTHi 与 Plg 层粘连蛋白 (Laminin, Ln) 玻粘连蛋白 (Vitronectin, Vn) 及支气管上皮细胞的结合 [12] Lp(a) 是一种特殊的血浆脂蛋白, 由 Apo(a) 和 LDL 通过二硫键连接而成 Apo(a) 中的 K 结构域与 Plg 的 K 结构域高度同源 Apo(a) 中也具有很强的 LBS, 能够结合赖氨酸及其类似物 韩润林教授提出的 Lp(a) 抗感染假说指出 :Lp(a) 可能竞争性的抑制细菌与 Plg 的结合, 从而抑制病原菌在宿主中的扩散 [13] 本研究将从 NTHi 基因组中扩增出的 hpf 片段连入 pgex-6p-1 表达载体并将其转入 E. coli BL21 中, 诱导表达出 rpf 及缺失羧基末端赖氨酸残基的 rpfδk 在此基础上对 rpf 与 Plg Lp(a) 的相互作用进行初步研究, 为进一步证实 Lp(a) 抗感染机制提供了依据 2. 材料与方法 2.1.1. 菌株和试剂 NTHi ATCC49247 购自卫生部临床检验中心 ; 表达载体 pgex-6p-1 购自上海林渊生物科技有限公司 ; 限制性内切 酶 BamH I Not I DL 5 000 DNA Marker 均购自宝生物工程 ( 大连 ) 有限公司 ;T4 DNA 连接酶购自 Promega 公司 ; 细菌基因组 DNA 提取试剂盒购自北京天根生物科技有限公司 ; Lp(a) 羊抗人 Apo(a) 多抗购自购自 Biomedical Technologies Inc 公司 ;EACA 羊抗人 LDL 多抗购自 Sigma 公司 ;Plg 鼠抗人纤溶酶原单抗 驴抗山羊 IgG-HRP 购自 R&D Systems 公司 ; 山羊抗鼠 IgG-HRP 购自北京博奥森生物技术有限公司 ; Pierce Glutathione Agarose GST-probe-HRP Pierce BCA 蛋白测定试剂盒购自 Thermo 公司 ; 大肠杆菌 E. coli BL21 Prescission 酶 引物合成均购自生工生物工程 ( 上海 ) 股份有限公司 所用引物见下表 : Target gene 表 1 引物列表 Primer: Secquence(5-3 ) F :CGCGGATCCAAATTTAAAGTCGTAACCACT Hpf R1:ATTTGCGGCCGCTCATTTTCCGAATCCTTTAAC 837 hpfδk R2:ATTTGCGGCCGCTCATCCGAATCCTTTAACAATGG 834 PCR product/bp 注 : 上游引物为共用引物 ; 下划线处为 BamH I 及 Not I 酶识别位点 2.2.2. 目的基因的克隆克隆及连接转化 按照细菌基因组 DNA 提取试剂盒操作说明进行 NTHi 基因组 DNA 的提取 以提取的基因组 DNA 为模板, 利用引物 F R1 扩增 hpf 基因 ; 利用引物 F R2 扩增 hpfδk 基因 PCR 扩增条件为 :94 预变性 3 min;94 变性 30s;55 退火 30s; 72 延伸 1min,30 个循环 ;72 总延伸 2min 将 PCR 扩增得到的产物纯化后进行双酶切 将酶切产物进行纯化, 连接到 pgex-6p-1 表达载体上, 构建 pgex-6p-1-hpf pgex-6p-1-hpfδk 重组表达载体, 并转入感受态 E. coli BL21 中 利用通用引物进行菌落 PCR 鉴定, 并将阳性菌送交生工生物工程 ( 上海 ) 股份有限公司测序, 对测序结果正确的菌株进行冻存保菌 2.3.3.rPF rpfδk 的诱导表达 鉴定及纯化 2.3.1.3.1.rPF rpfδk 的诱导表达 取含有 pgex-6p-1-hpf pgex-6p-1-hpfδk 重组表达载体的工程菌 E. coli BL21 接种于 20 ml LB/Amp(Amp 含量为 100 μg/ml) 液体培养基中, 于恒温摇床上 37,200 rpm 振荡培养 16 h; 转接至 400 ml 培养基中,37 200 rpm 振荡培养至 0.6 OD600 nm 0.8; 向培养基中加入 IPTG( 终浓度为 1 mmol/l),30 300 rpm, 恒温摇床振荡 3 h 进行诱导培养 将诱导后的菌液离心收集沉淀并用 PBS 重悬, 置于 -80 冰箱冻融 3 次 ; 将冻融的菌悬液融化后加入 PMSF ( 1 mmol/l), 溶菌酶 (0.2 mg/ml),dna 酶 (20 μg/ml), 震荡 30 min;4 10 000 rpm 离心 20 min, 收集破碎后的菌沉淀和菌上清

American Journal of Clinical and Experimental Medicine 2015; 3(6): 338-343 340 2.3.2.3.2.SDS SDS-PAGE 鉴定 取样制备诱导前 诱导后及诱导破碎后菌上清 菌沉淀的电泳样品并进行 SDS-PAGE 电泳 (4% 浓缩胶,12% 分离胶 ) 电泳完成后, 经考马斯亮兰染色 脱色 照相 2.3.3.3.3. 重组蛋白 rpf rpfδk 的纯化 将得到的裂解后的菌上清用 Wash buffer 稀释后进行过柱 : 上清稀释液穿流 3 次 ; 然后用 Wash buffer 对结合在柱填料上的蛋白进行清洗, 除去杂蛋白 ; 最后加入 2 倍体积的 Elution buffer, 封住出口, 室温孵育 20 min; 然后收集洗脱液并用 6 个柱体积的 Elution buffer 洗脱结合在柱子上的蛋白, 收集洗脱液 得到的洗脱液过夜透析去除杂质 将透析得到的 rpf rpfδk 用 PEG 20 000 进行浓缩后测定蛋白含量, 并分装保存 2.4.4.rPF rpfδk 标签 (GST GST) 的切除 按照 2 U/100 µg 的量向已知含量的 rpf 和 rpf k 蛋白液中加入 Prescission 酶,4 孵育 24 h; 然后将蛋白液加入已经用 Cut buffer 平衡的柱子中, 封住出口在室温下孵育 30 min; 打开出口收集流出液, 并用 4 个柱体积的 Cut buffer 洗脱目的蛋白进行收集 将切除标签后的蛋白过夜透析 浓缩并测定含量, 分装保存 2.5.5. 标签切除效果的 Western-blot 检测 rpf rpf-gst rpfδk rpfδk-gst 原液各取 10 μl 用 PBS 进行如下稀释 :rpf rpfδk 为 20 μg/ml;rpf-gst rpfδk-gst 为 37.3 μg/ml( 同摩尔数 ) 取上述各浓度的蛋白液作样后进行 SDS-PAGE 电泳 ( 浓缩胶 4%, 分离胶 10%) 电泳后利用半干转法将蛋白转移到 NC 膜上, 将 NC 膜放入 5% 的脱脂乳 -TBST 中室温封闭 1.5 h; 加入用 2% 脱脂乳 -TBST 稀释 (1:2 500) 的 GST 标签抗体, 室温孵育 1.5 h; 加入发光试剂, 然后进行成像操作 2.6.6. 酶联免疫吸附试验 (ELISA ELISA) 检测 rpf rpfδk 与 Plg Lp(a) 的结合 2.6.1.6.1.ELISA 检测 rpf rpfδk 与 Plg 的结合 将 rpf rpfδk 稀释为 20 μg/ml, 按照 100 μl/ 孔将 rpf rpfδk 包被在酶标板中室温孵育 1.5 h;tbst 洗板 3 次,5 min/ 次 ; 向酶标板各孔中加入 1%BSA-TBST 室温封闭 1.5 h; 对应各孔加入不同浓度的 Plg(10 50 100 ng/100 μl)100 μl/ 孔, 室温孵育 1.5 h; 将鼠抗人 Plg 单抗 (TBST 1:2 000 稀释 ) 加入对应各孔,100 μl/ 孔, 室温孵育 1.5 h; 将山羊抗鼠 IgG-HRP(TBST 1:3 000 稀释 ) 加入对应孔中,100 μl/ 孔, 室温孵育 1.5 h; 加入四甲基联苯胺 (TMB) 显色液, 室温作用 5 min; 加入终止液, 于酶标仪上测定 OD450 nm 2.6.2.6.2.ELISA 检测 rpf rpfδk 与 Lp(a) 的结合 实验方法如 1.6.1 所述 rpf rpfδk 浓度为 20 μg/ml, Lp(a) 浓度梯度为 10 50 100 ng/100 μl 使用一抗山 羊抗人 Apo(a) 多抗 (TBST 1:4 000 稀释 ); 二抗驴抗山羊 IgG-HRP(TBST 1:1 000 稀释 ) 2.6.3.6.3. 亲和色谱层析层析检测 rpf rpfδk 与 Lp(a) 的结合 在三根已加入 GST 填料的层析柱中分别加入 50 μg 的 rpf rpfδk 以及相应的 PBS 然后向每个层析柱中加入 1 ml 血浆, 作用 30 min 后用 Wash buffer 洗去未结合的杂蛋白 向三根层析柱中加入 10U 的 Prescission 酶,4 孵育 24 h, 用 Cut buffer 洗脱目的蛋白 将上述得到的洗脱液处理后作样进行 SDS-PAGE, 而后用湿转电转仪将蛋白转移到 NC 膜上, 剩余操作同 1.5 检测 Lp(a) 使用的一抗为羊抗人 Apo(a), 二抗为驴抗羊 IgG-HRP; 检测 rpf/rpfδk 使用的是 GST-probe-HRP 抗体 2.7.7.ELISA 检测 EACA 对 rpf 与 Plg Lp(a) 结合的抑制 2.7.1.7.1.ELISA 检测 EACA 对 rpf rpfδk 与 Plg 结合的抑制 实验步骤及抗体使用与 1.6.1 操作一致 Plg 的浓度为 100 ng/100 μl,eaca 终浓度为 0 0.2 2.0 mmol/l 剩余步骤同 1.6.1 2.7.2.7.2.ELISA 检测 EACA 对 rpf rpfδk 与 Lp(a) 结合的抑制 实验步骤及抗体使用与 1.6.2 一致 Lp(a) 的浓度为 100 ng/100 μl,eaca 终浓度依次为 0 0.2 2.0 mmol/l 剩余步骤同 1.6.2 2.8.8.ELISA 检测 Lp(a) 对 rpf 与 Plg 结合的抑制 实验步骤与 1.6.1 一致 Plg 的浓度为 100 ng/100 μl, Lp(a) 终浓度为 0 50 100 200 ng/100 μl 一抗 二抗的使用及稀释比例均与 1.6.1 所述一致 注 :ELISA 检测结果采用 SAS 软件进行统计分析, 并进行 t 检验 3. 结果 3.1.1. 标签切除效果的 Western-blot 检测 由于标签蛋白本身分子量过大 (26 kd), 为了不影响后续对目的蛋白的研究, 使用 Prescission 酶对标签蛋白进行剪切 利用 GST 标签抗体对重组蛋白标签的切除效果进行检测,rPF-GST rpfδk-gst 大小为 56 kd, 切除标签后的 rpf rpfδk 大小为 30 kd rpf-gst rpfδk-gst 在预期位置均有明显条带, 而 rpf rpfδk 预期大小处完全没有条带 ( 见图 1) 说明利用 Prescission 酶对重组蛋白实施的标签切除很干净 3.2.ELISA 检测 rpf rpfδk 与 Plg Lp(a) 的结合 3.2.1.ELISA 检测 rpf rpfδk 与 Plg 的结合 ELISA 检测纯化后的 rpf rpfδk 与 Plg 之间的相互作用, 结果 ( 见图 2A) 表明 :rpf rpfδk 与 Plg 的结合均具有一定的浓度依赖性, 随着 Plg 浓度的升高结合值也在增大 ; 同 Plg 浓度下, 相比于 rpfδk,rpf 与 Plg 的结合能力显著增强 (p<0.01)

341 刘恩等 : 重组不可分型流感嗜血杆菌 F 蛋白与脂蛋白 (a) 的相互作用 3.2.2.ELISA 检测 rpf rpfδk 与 Lp(a) 的结合 rpf rpfδk 与 Lp(a) 的 ELISA 检测结果 ( 见图 2B) 表明 :rpf rpfδk 与 Lp(a) 的结合具有浓度依赖性, 在 10-100 ng/100 μl 浓度范围内 rpf rpfδk 与 Lp(a) 的结合值随 Lp(a) 浓度的增高而增高 相比于 rpfδk,rpf 与 Lp(a) 的结合值在各浓度水平下均明显升高 (p<0.01) 图 1 重组蛋白标签切除的 Western-blot 分析 图 2 ELISA 检测 rpf rpfδk 与 Plg Lp(a) 的结合 3.2.3.2.3. 亲和色谱层析检测 rpf rpfδk 与 Lp(a) 的结合 将亲和色谱层析得到的洗脱液进行 Western 检测, 由结果 ( 见图 3) 可知 :rpf rpfδk 与 Lp(a) 均结合, 但在 亮度上具有明显的差异 这表明 rpf 羧基末端的赖氨酸残基是主要的结合位点 图 3 Western blot 检测 rpf rpfδk 与 Lp(a) 的结合

American Journal of Clinical and Experimental Medicine 2015; 3(6): 338-343 342 3.3.3.ELISA 检测 EACA 对 rpf rpfδk 与 Plg Lp(a) 结合的抑制 3.3.3.1.1.ELISA 检测 EACA 对 rpf rpfδk 与 Plg 结合的抑制 ELISA 检测 EACA 对 rpf rpfδk 与 Plg 结合的抑制结果 ( 见图 4A) 表明 : 随着 EACA 浓度的增高,rPF 与 Plg 的结合值在不断降低, 当 EACA 浓度为 2.0 mmol/l 时, 其抑制作用较浓度为 0 mmol/l 时具有显著性差异 (p<0.01) 3.3.3.2.2.ELISA 检测 EACA 对 rpf rpfδk 与 Lp(a) 结合的抑制 ELISA 检测 EACA 对 rpf rpfδk 与 Lp(a) 结合的抑制, 结果 ( 见图 4B) 表明 : 随着 EACA 浓度的增高,rPF 与 Lp(a) 的结合值在不断降低, 当 EACA 浓度为 0.2 mmol/l 时, 其抑制作用较 EACA 浓度为 0 mmol/l 时具有显著性差异 (p< 0.01) 图 4 EACA 对 rpf,rpfδk 与 Plg Lp(a) 结合的抑制 图 5 Lp(a) 对 rpf 与 Plg 结合的抑制 ***:p<0.01 3.4.4.ELISA 检测 Lp(a) 对 rpf 与 Plg 结合的抑制 ELISA 检测 Lp(a) 对 rpf 与 Plg 结合的抑制作用试验结果 ( 见图 5) 表明 :Lp(a) 对 rpf 与 Plg 结合的抑制具有一定的浓度依赖性, 当 Lp(a) 浓度达到 50 ng/100 μl 时, 抑制作用显著增强 (p<0.01) 4. 讨论 PF 是一种羧基末端含有赖氨酸残基的菌体表面蛋白 Plg Lp(a) 均具有 LBS, 能够与赖氨酸及其类似物相结合 [14], 由本实验的研究结果可知,rPF 能够与 Plg Lp(a) 结合, 并且 EACA 能够抑制这种结合作用 rpfδk 与 Plg Lp(a) 的结合值明显降低, 说明 rpf 与 Plg Lp(a) 的结合作用主要是通过 rpf 羧基末端的赖氨酸残基与 Plg Lp(a) 上的 LBS 特异性结合而形成的 此外, 本研究发现 rpfδk 与 Plg Lp(a) 仍然具有结合值 这说明 rpf 内部的其他赖氨酸残基也参与了与 Plg Lp(a) 的结合作用, 但发挥主要作用的是羧基末端的赖氨酸残基, 这一点通过 ELISA 及亲和色谱层析等检测方法均得到了证实 Lp(a) 抑制 rpf 与 Plg 结合作用的研究表明,Lp(a) 能够竞争性的抑制 Plg 与 rpf 的结合, 当 Lp(a) 浓度达到 50 ng/100μl 时, 就能够产生显著的抑制作用 人们对于 Lp(a) 与肾脏疾病及动脉粥样硬化等疾病关系的研究有所突破 [15], 但 Lp(a) 具体的生理作用仍不明确 通过本实验的研究可知 Lp(a) 能够抑制细菌表面 PF 与 Plg 的结合, 由此推断 Lp(a) 能够阻断细菌利用 Plg 侵袭宿主的途径, 在抵抗 NTHi 感染方面具有重要作用 参考文献 [1] Watt JP, Wolfson LJ, Henkle E, et al. Burden of disease caused by Haemophilus influenzae type b in children younger than 5 years: global estimates[j]. Lancet, 2009, 374(9693); 903 911.

343 刘恩等 : 重组不可分型流感嗜血杆菌 F 蛋白与脂蛋白 (a) 的相互作用 [2] Morris SK. Moss WJ, Halesa N, et al. Haemophilus influenzae type b conjugate vaccine use and effectiveness[j].lancet Infectious Diseases, 2008, 8(7); 435 443. [3] Erwin AL, Smith AL. Nontypeable Haemophilus influenzae: understanding virulence and commensal behavior[j]. Trends Microbiol, 2007, 15(8); 355 362. [4] Murphy TF, Faden H, Bakaletz LO, et al. Nontypeable Haemophilus influenzae as a pathogen in children[j]. Pediatric Infectious Diseases, 2009, 28(1); 43 48. [5] Turk DC. The pathogenicity of Haemophilus influenzae[j]. J Med Microbiol, 1984, 18:1 16. [6] Lahteenmaki K, Kuusela P, Korhonen TK. Bacterial plasminogen activators and receptor[j]. FEMS Microbiology Reviews, 2001, 25(5):531-552. [7] Redlitz A, Plow EF. Receptors for plasminogen and t-pa: an update[j]. Baillieres Clinical Haematology, 1995, 8(2):313-327. [8] Barthel D, Singh B, Riesbeck K, et al. Haemophilus influenzae uses the surface protein E to acquire human plasminogen and to evade innate immunity[j]. Immunology, 2012, 188(1); 379-385. [9] Sjostrom I, Grondahl H, Falk G, et al. Purification and characterisation of a plasminogen-binding protein from Haemophilus influenzae. Sequence determination reveals identity with aspartase[j]. Biochimica et Biophysica Acta, 1997, 1324(2); 182 190. [10] Su YC, Mukherjee O, Singh B, et al. Haemophilus influenza P4 interacts with extracellular matrix proteins promoting adhesion and serum resistance[z]. http://jid.oxfordjournals.org, 2015-8-7. [11] Jalalvand F, Su YC, Mörgelin M, et al. Haemophilus influenzae protein F mediates binding to laminin and human pulmonary epithelial cells[j]. Infectious Diseases, 2013, 207(5); 803-813. [12] Su YC, Jalalvand F, Mörgelin M, et al. Haemophilus influenza acquires vitronectin via the ubiquitous protein F to subvert host innate immunity[j]. Molecular Microbiology, 2013, 87 (6); 1245 1266. [13] Han RL. Plasma lipoproteins are important components of the immune system[j]. Microbiol Immunol. 2010, 54 (4); 246-253. [14] Boeryd B. Action of heparin and plasminogen inhibitor (EACA) on metastatic tumour spread in an isologous system[j]. Acta pathologica et microbiologica Scandinavica. 1965, 65(3):395-404. [15] Mclean JW, Tomlinson JE, Kuang WJ, et al. cdna secquence of human apolipoprotein(a) is homologous to plasminogen[j]. Nature, 1987, 330(6144):132-137.