第四章 桂花萃取物及 rutin 護肝功能 之評估 大綱 一 桂花抑制 Acetaminophen 傷肝模式試驗 1. 護肝試驗期間小鼠體重變化 2. 小鼠臟器重量變化 3. 血液生化值檢測 (GOT GPT) 4. 臟器組織病理檢查 5. 脂質過氧化檢測 - 78 -
摘 要 本研究之目的在探討 BALB/c 小鼠先以管灌餵食 75 % 乙醇桂花萃取物及抗氧化成分 rutin 連續 15 天, 於小鼠犧牲前三小時腹腔注射 acetaminophen (1.0 g/kg B.W.), 評估體重 血液分析 (GOT GPT) 臟器脂質過氧化程度及器官組織切片等, 發現可減緩 acetaminophen 之毒性作用 實驗以 6~8 週大之雌性小鼠, 將小鼠隨機分成七組, 發現分別是桂花萃取物組 [ 低劑量 100 mg/kg (LEKF) 中劑量 800 mg/kg (MEKF) 及高劑量 1000 mg/kg (HEKF) ] rutin 組 [ 低劑量 10 mg/kg (LR) 及高劑量 100 mg/kg (HR) ] Positive control (PC) Negative control (NC), 依照組別分別餵食 15 天, 每組六隻小鼠, 投與體積為 1 ml/100g B.W.,15 天後桂花萃取物組 rutin 組及 PC 組小鼠皆在犧牲前三小時腹腔注射 acetaminophen (1.0 g/kg B.W.) 實驗結果顯示, 桂花萃取物能明顯降低 acetaminophen 所導致 GOT 值的上升, 減少肝臟及肺臟脂質過氧化現象 於組織切片檢驗中, 桂花萃取物組及 rutin 組能明顯降低 acetaminophen 所造成小鼠肝臟組織空泡化之損傷現象 綜合以上結果顯示, 桂花及其抗氧化成分 rutin 確實能夠降低過量 acetaminophen 所導致肝臟損害及組織脂質氧化現象, 具有發展成為護肝保健產品的潛力 - 79 -
材料與方法 一 桂花 75 % 乙醇萃取物製備桂花 (Osmanthus fragrans flower;kwei-fah) 75 % 乙醇萃取物 : 處理方法及流程如第二章所述, 管餵用之桂花萃取物於管餵前以 0.9 % normal saline 配製成適當劑量 二 動物實驗設計 ( 一 ) 實驗流程及分組 1. 實驗流程 day 1 d 15 d 16 Sacrifice Oral feeding i.p. APAP 1.0 g/kg rat BW of sacrifice before 3 hours LEKF: 管餵 100 mg kwei-fa extract/kg B.W. /day MEKF: 管餵 800 mg kwei-fa extract /kg B.W. /day HEKF: 管餵 1000 mg kwei-fa extract /kg B.W. /day LR: 管餵 10 mg rutin/kg B.W. /day HR: 管餵 100 mg rutin/kg B.W. /day PC: Positive control 管餵 0.9 % normal saline /day NC: Negative control 管餵 0.9 % normal saline /day - 80 -
2. 實驗分組 Group N Oral feeding Sensitize (i.p.) sacrifice before 3 hours LEKF 6 100 mg KFE/kg mice B.W. APAP 1.0 g/kg mice B.W. MEKF 6 800 mg KFE/kg mice B.W. APAP 1.0 g/kg mice B.W. HEKF 6 1000 mg KFE/kg mice B.W. APAP 1.0 g/kg mice B.W. LR 6 10 mg rutin/kg mice B.W. APAP 1.0 g/kg mice B.W. HR 6 100 mg rutin/kg mice B.W. APAP 1.0 g/kg mice B.W. PC 6 0.9 % normal saline APAP 1.0 g/kg mice B.W. NC 6 0.9 % normal saline 0.9 % normal saline 3. 實驗分析指標 : 體重測定 每週稱量小鼠體重, 並在投予終止日量測為最終 體重重量, 作為體重臟器重量比例之計算基準 血液生化值檢測 組織病理切片 脂質過氧化指標 GOT GPT 肝臟 肺臟 腎臟 TBARs ( 二 ) 試驗動物 1. 動物品系 : BALB/c 小鼠 2. 動物來源 : 財團法人國家實驗研究院國家實驗動物繁殖及研究中心 3. 動物週期及性別 : 四週大, 雌性小鼠 - 81 -
4. 動物重量 : 20 ± 5 克 5. 飼養環境 : 本系之動物房, 飼養於不繡鋼鐵籠中, 以 Lab 5001 之動物飼料及飼養墊料 (BETA CHIP), 空調設備, 房內溫度維持在 25 ± 3 相對溼度 55 ± 5 %, 控制光照 黑暗各為 12 小時循環條件下 試驗期間, 飼料及飲水均採自由攝食 6. 動物實驗模式 : 小鼠飼養於 6 週大時, 將小鼠隨機分成七組分別為桂花萃取物組 ( 低劑量 100 mg KFE/kg B.W. 中劑量 800 mg KFE/kg B.W. 及高劑量 1000 mg KFE/kg B.W.) 抗氧化成分 rutin 組 ( 低劑量 rutin 10 mg/kg B.W. 高劑量 rutin 100 mg/kg B.W.) Positive control 組 (0.9 % norm Negative control 組 (0.9 % normal saline), 等方式餵食, 每組六隻小鼠, 投與體積為 1 ml/100 g B.W., 以 1 ml 塑膠針管套附餵食管 ( 直徑 0.9 mm, 長度 50 mm), 以強迫方式連續管餵小鼠 15 天, 於第 16 天犧牲前三小時以腹腔內注射方式, 分別桂花萃取物組 抗氧化成分 rutin 組 Positive control 組注射 acetaminophen 1.0 g/kg rat B.W.;Negative control 組注射 0.9 % normal saline 三 動物犧牲及實驗檢體收集與分析 ( 一 ) 血液檢體收集 - 82 -
於試驗終了將小鼠犧牲, 分別對小鼠進行眼窩採血 (retro-orbital) 先將小鼠以腹腔內注射麻醉藥 pentobarbital 20 μg/mice in 0.2 ml 0.9 % normal saline, 待小鼠昏迷後以滅菌之玻璃滴管迅速自小鼠眼窩靜脈竇採血, 採血量約 300 μl, 於室溫下靜置 2 3 小時後, 以 1200 rpm (MPW) 轉速離心 20 分鐘, 收集上層之血清, 保存於 -80 待分析 ( 二 ) 血液生化值檢測以眼窩採血方式採取小鼠血液完畢後靜置二小時, 使血漿沉澱, 以 1200 rpm,4,5 分鐘離心後, 取上層之血清, 依 GPT (ALAT) IFCC mod.liquiuv Test GOT (ASAT) IFCC mod.liquiuv Test 套組方法測進行血清生化學分析 ( 三 ) 動物犧牲取樣犧牲過程依序收集小鼠血液 心臟 肝臟 脾臟 肺臟 腎臟 各臟器以冰冷 0.9 % normal saline 洗淨, 棉紙吸乾水分稱重後, 將各臟器區分一半置於離心管, 以石蠟膜包封儲存於 -80 冰箱待後續分析 ; 另一半取出浸於 10 % 福馬林溶液, 以供組織病理切片檢查用 - 83 -
( 四 ) 組織病理切片小鼠之肝臟 肺臟 腎臟儲存於 10 % 福馬林溶液, 委託奇美醫學中心病理部切片及顯微鏡觀察 (H&E 400 ), 並委請李建隆醫師判讀 ( 五 ) 組織脂質過氧化 (TBARs) 測定 實驗試劑 1. Potassium-phosphate buffer (KP buffer): 0.01 M,pH 7.4;K 2 HPO 4 (Riedel-deHaen 31293) 1.053 g,kh 2 PO 4 (J.T. Baker 3246-01) 0.523 g,kcl (J.T. Baker 3040-01) 11.38 g, 以去離子水配製, 調 ph 至 7.4, 定量至 1 L 2. 1,1,3,3-Tetraathoxy-propane, approx (TEP):(Sigma T-9889), 以去離子水配製成各濃度 (10 5 2 1 0.5 0.25 0.125 nmol/ml) 標準品溶液供樣品濃度之計算 3. Trichloroacetic acid (TCA) solution:10% (Riedel-deHaen 33731), 取 10 g 溶於 100 ml 去離子水 4. 0.2 N HCl:12 N HCl, 取 8.33 ml 以去離子水定量至 500 ml 5. 2-thiobarbituric acid (TBA) solution:0.4% (Sigma T-5500), 取 0.2 g 以 0.2 N HCl 定量至 50 ml - 84 -
6. 2,6-di-tert-butyl-4-methyl-phenol (BHT):0.2 % (Sigma B-1378), 取 0.1 g 以絕對酒精定量至 50 ml 7. 1-butanol:(Riedel-deHaen 33065) 實驗方法 取適量小鼠所測臟器, 加入 3 倍冰冷的 ph 7.4 K.P buffer, 以組織均質機 (Glas-Col ) 磨碎成均質液 先以 Lowry 法 (Lowry, 1951) ELISA 全波長光度計 (Molecular derices) 測定臟器均質液中蛋白質濃度 抗氧化分析, 分別先取出臟器均質液及標準品溶液各 1 ml 於玻璃試管, 各加入 1 ml 10 % TCA 溶液, 震盪均勻, 使蛋白質沉澱, 經 3600 rpm 10 分鐘離心後取上層液, 再加入 1 ml 0.4 % TBA 溶液及 0.1 ml 0.2 % BHT 溶液, 震盪均勻, 於 50 下反應 1 小時, 冷卻後加入 butanol 溶液 3 ml, 震盪均勻, 經離心 3600 rpm 10 分鐘, 取上層液以螢光光度計 (HITACHI, F-2500) 於設定波長 (EX WL: 515nm EM WL: 550nm) 下測定吸光值 抗氧化分析試驗過程於加入 TCA 溶液後續步驟須全程避光 四 統計 每一組實驗進行六重覆, 所得實驗結果採用 Statistical Analysis - 85 -
System V8 ( 賽仕軟體股分有限公司 ) 進行變異數分析 (ANOVA, Analysis of variance), 以比較結果之統計顯著性 結果與討論 一 試驗期間小鼠體重變化試驗期間每五天秤其體重, 結果顯示各組與控制組之間是沒有差異的, 於犧牲時各組之間也沒有差異 ( 圖 4-1) 顯示餵取桂花萃取物及純物質 rutin 不會影響小鼠生理機能及代謝 二 臟器重量變化小鼠在管餵桂花萃取物及抗氧化成分 rutin 連續 15 天, 直到犧牲時其心臟 肝臟 脾臟 肺臟 腎臟等與控制組間重量方面沒有差異, 顯示於試驗餵食期間不會造成小鼠器官上的病變 ( 表 4-1) 但是解剖過程發現, 經注射 APAP 的 PC 組其肺臟與肝臟組織較為脆弱, 臟器夾取上稍有困難度, 但經餵食桂花萃取物及 rutin 之小鼠, 臟器則明顯改善此現象, 三 血液分析 GOT 和 GPT 兩者為最常用肝細胞損傷生化檢測指標, 實驗結果顯示, 小鼠於犧牲前三小時腹腔注射 APAP 1.0 g/kg B.W. (PC 組 ), 和正常小鼠 (NC 組 ) 相比,APAP 確實會造成肝細胞損傷, 促 - 86 -
使 GOT 及 GPT 上升,GOT 上升達 70 % GPT 上升達 178 %, 與 Agne 等 (2001) 及 Leonard 等 (1985) 研究顯示相符, APAP 確實會造成老鼠 GOT 及 GPT 值上升, 進而造成肝臟組織傷害 若於腹腔注射 APAP 前先餵取桂花萃取物及抗氧化成分 rutin 連續 15 天, 能夠降低注射 APAP 所導致 GOT 上升現象,LEKF 降低 65.2 %; MEKF 降低 43.7 %;HEKF 降低 46.4 %;LR 降低 31.2 %;HR 降低 20.3 % 且桂花萃取物低劑量 LEKF 組及中劑量 MEKF 組能降低 APAP 所導致 GPT 的上升,LEKF 降低 17.9 %;MEKF 降低 41.0 %, 由上述結果顯示, 桂花萃取物之保護效果優於 rutin, 能降低 APAP 所導致小鼠肝指數 GOT 及 GPT 值上升, 降低 APAP 所造成肝臟傷害 ( 表 4-2) 四 臟器組織病理檢查實驗結果顯示, 先餵取桂花萃取物及純物質 rutin 連續 15 天情形下, 各組和 PC 組相比較, 能有效減少 APAP 造成肝臟組織空泡化現象, 降低肝臟組織損傷, 其保護效果, 桂花萃取物優於純物質 rutin ( 圖 4-2) 而肺臟及腎臟切片組織在顯微鏡觀察下, 並沒有病變傷害現象產生 ( 圖 4-3 ~ 4-4), 由此顯示 APAP 主要由肝臟所分解代謝, 其 APAP 毒性副作用主要於肝臟 五 臟器脂質過氧化由圖 4-5 之實驗結果顯示, 小鼠腹腔注射 APAP 三小時後和控制組相比較, 明顯造成老鼠肝臟氧化現象產生 TBARs 值上升, 由 0.035 nmol/mg protein (NC 組 ) 到 0.133 nmol/mg protein (PC 組 ), 上升達 280 %, 而餵取桂花萃取物及抗氧化成分 rutin 連續 15 天後 - 87 -
再經 APAP 處理下, 能降低 APAP 毒性作用所造成肝細胞損傷及氧化現象, 降低 TBARs 達 LEKF 降低 57.89 %;MEKF 降低 52.63 %;HEKF 降低 60.15 %;LR 降低 47.36 %;HR 降低 31.57 %, 其中又以桂花萃取物的保護效果較 rutin 佳 ( 圖 4-2) 於肺臟部分發現 APAP 也會造成肺臟氧化現象的產生 TBARs 值上升, 由 0.120 nmol/mg protein (NC 組 ) 到 0.255 nmol/mg protein (PC 組 ), 上升達 113 % ( 圖 4-6),Baudouin 等 (1995) 之研究報告也指出, 由 APAP 所造成急性肝衰竭的病人身上, 同時也會併發肺臟毒性, 造成病人肺細胞的傷害, 增加肺臟衰竭的機率, 與本實驗結果相同, 而桂花萃取物之保護效果優於 rutin, 能降低 APAP 所導致肺臟氧化現象, 降低 TBARs 值達 LEKF 降低 42.74 %;MEKF 降低 21.17 %;HEKF 降低 16.07 % 在腎臟方面各組間並沒有顯著性的差異, 顯示腹腔注射 1.0 g APAP /kg B.W. 三小時下, 肝臟是最先受到氧化傷害的臟器, 並由本實驗結果證實, 不同劑量的桂花萃取物及其抗氧化指標成分 rutin, 確實能進入肝細胞內, 達到保護肝細胞的效果 ( 圖 4-2) 結 論 BALB/c 小鼠先以管灌餵食 75 % 乙醇桂花萃取物及抗氧化成分 rutin 連續 15 天, 確實能降低注射 APAP (1.0 g/kg B.W. ) 所造成肝臟損傷 桂花萃取物組能明顯降低 APAP 所導致 GOT 值的上升, 減少肝臟及肺臟脂質氧化現象, 以及肝臟組織空泡化之傷害現象 綜合以上結果顯示, 桂花萃取物及其抗氧化成分 rutin 先經管灌餵食 BALB/c 小鼠連續 15 天, 確實能夠降低 acetaminophen 藥物毒性傷害達護肝效用 - 88 -
25 Body Weight (g) 20 15 10 5 0 0 5 10 15 Day LEKF MEKF HEKF LR HR PC NC 圖 4-1 桂花萃取物及 rutin 管餵食期間各組小鼠之體重變化 Figure 4-1. The body weight changes of female BALB/c mice treated with Kwei-Fah extract and rutin by gastric gavage consecutively for 15 days. LEKF: 100 mg KFE/kg B.W.; HEKF: 1000 mg KFE/kg B.W.; LR: 10 mg rutin/kg B.W.; HR: 100 mg rutin/kg B.W.; PC: Positive control; NC: Negative control. - 89 -
表 4-1 BALB/c 小鼠管餵食桂花萃取物及 rutin 對腹腔內注射 APAP 臟器相對重量百分比 Table 4-1. The relative organ weight to body weight of oral administration Kwei-Fah extract in BALB/c mice injected i.p. APAP (1.0 g/kg B.W.). Organ Relative Organ weight to body weight (%) Group Heart Liver Spleen Lung Kidney LEKF 0.56±0.03a 5.26±0.35a 0.51±0.09a 0.54±0.05a 1.20±0.02a MEKF 0.58±0.06a 5.89±0.35a 0.45±0.09a 0.54±0.05a 1.20±0.06a HEKF 0.62±0.10a 4.92±0.12a 0.49±0.08a 0.51±0.07a 1.15±0.02a LR 0.64±0.08a 5.08±0.37a 0.43±0.05a 0.51±0.06a 1.17±0.02a HR 0.63±0.16a 5.02±0.29a 0.49±0.12a 0.45±0.16a 1.15±0.14a PC 0.67±0.12a 5.19±0.55a 0.53±0.13a 0.51±0.03a 1.25±0.10a NC 0.59±0.08a 4.90±0.27a 0.48±0.11a 0.57±0.08a 1.21±0.02a LEKF: 100 mg KFE/kg B.W.; HEKF: 1000 mg KFE/kg B.W.; LR: 10 mg rutin/kg B.W.; HR: 100 mg rutin/kg B.W.; PC: Positive control; NC: Negative control. - 90 -
表 4-2 BALB/c 小鼠管餵食桂花萃取物及 rutin 對腹腔內注射 APAP 血清 GOT GPT 之影響 Table 4-2. Effect of Kwei-Fah extract and rutin of serum GOT and GPT in BALB/c mice injected i.p. APAP (1.0 g/kg B.W.). Group GOT (ULN) GPT (ULN) LEKF 0.59±0.29c 2.26±0.29ab MEKF 0.95±0.43bc 1.63±1.39ab HEKF 0.91±0.55bc 2.71±0.79a LR 1.19±0.30ab 2.62±1.14a HR 1.35±0.38ab 2.91±0.83a PC 1.70±0.39a 2.95±1.08a NC 1.00±0.50bc 1.00±0.47b LEKF: 100 mg KFE/kg B.W.; HEKF: 1000 mg KFE/kg B.W.; LR: 10 mg rutin/kg B.W.; HR: 100 mg rutin/kg B.W.; PC: Positive control; NC: Negative control. - 91 -
NC PC LEKF LR MEKF HR HEKF LEKF MEKF HEKF LR HR PC NC 100 mg KFE/kg B.W. + i.p. APAP 1.0g/kg 800 mg KFE/kg B.W. + i.p. APAP 1.0g/kg 1000 mg KFE/kg B.W. + i.p. APAP 1.0g/kg 10 mg rutin/kg B.W. + i.p. APAP 1.0g/kg 100 mg rutin/kg B.W. + i.p. APAP 1.0g/kg 0.9% normal saline + i.p. APAP 1.0g/kg 0.9% normal saline + i.p 0.9% normal saline - 92 -
圖 4-2 BALB/c 小鼠經管餵食桂花萃取物及 rutin 對腹腔內注射 APAP 之肝臟病理切片觀察 Figure 4-2. Photographs of liver in all treated groups with Kwei-Fah extract and rutin in BALB/c mice injected i.p. APAP (1.0 g/kg B.W.). LEKF: 100 mg KFE/kg B.W.; HEKF: 1000 mg KFE/kg B.W.; LR: 10 mg rutin/kg B.W.; HR: 100 mg rutin/kg B.W.; PC: Positive control; NC: Negative control. - 93 -
NC PC LEKF LR MEKF HR HEKF LEKF MEKF HEKF LR HR PC NC 100 mg KFE/kg B.W. + i.p. APAP 1.0g/kg 800 mg KFE/kg B.W. + i.p. APAP 1.0g/kg 1000 mg KFE/kg B.W. + i.p. APAP 1.0g/kg 10 mg rutin/kg B.W. + i.p. APAP 1.0g/kg 100 mg rutin/kg B.W. + i.p. APAP 1.0g/kg 0.9% normal saline + i.p. APAP 1.0g/kg 0.9% normal saline + i.p 0.9% normal saline - 94 -
圖 4-3 BALB/c 小鼠經管餵食桂花萃取物及 rutin 對腹腔內注射 APAP 之肺臟病理切片觀察 Figure 4-3. Photographs of lung in all treated groups with Kwei-Fah extract and rutin in BALB/c mice injected i.p. APAP (1.0 g/kg B.W.). LEKF: 100 mg KFE/kg B.W.; HEKF: 1000 mg KFE/kg B.W.; LR: 10 mg rutin/kg B.W.; HR: 100 mg rutin/kg B.W.; PC: Positive control; NC: Negative control. - 95 -
NC PC LEKF LR MEKF HR HEKF LEKF MEKF HEKF LR HR PC NC 100 mg KFE/kg B.W. + i.p. APAP 1.0g/kg 800 mg KFE/kg B.W. + i.p. APAP 1.0g/kg 1000 mg KFE/kg B.W. + i.p. APAP 1.0g/kg 10 mg rutin/kg B.W. + i.p. APAP 1.0g/kg 100 mg rutin/kg B.W. + i.p. APAP 1.0g/kg 0.9% normal saline + i.p. APAP 1.0g/kg 0.9% normal saline + i.p 0.9% normal saline - 96 -
圖 4-4 BALB/c 小鼠經管餵食桂花萃取物及 rutin 對腹腔內注射 APAP 之腎臟病理切片觀察 Figure 4-4. Photographs of kidney in all treated groups with Kwei-Fah extract and rutin in BALB/c mice injected i.p. APAP (1.0 g/kg B.W.). LEKF: 100 mg KFE/kg B.W.; HEKF: 1000 mg KFE/kg B.W.; LR: 10 mg rutin/kg B.W.; HR: 100 mg rutin/kg B.W.; PC: Positive control; NC: Negative control. - 97 -
0.4 TBARs (nmol/mg protein) 0.3 0.2 0.1 ab ab ab ab ab a b 0 LEKF MEKF HEKF LR HR PC NC 圖 4-5 BALB/c 小鼠經管餵食桂花萃取物及 rutin 對腹腔內注射 APAP 之肝臟組織 TBARs 值之影響 Figure 4-5. The effects of single oral administration of Kwei-Fah extract and rutin on the TBARs content in liver homogenate of BALB/c mice injected i.p. APAP (1.0 g/kg B.W.). LEKF: 100 mg KFE/kg B.W.; HEKF: 1000 mg KFE/kg B.W.; LR: 10 mg rutin/kg B.W.; HR: 100 mg rutin/kg B.W.; PC: Positive control; NC: Negative control. - 98 -
TBARs (nmol/mg protein) 0.4 0.3 0.2 0.1 ab ab ab ab a a b 0 LEKF MEKF HEKF LR HR PC NC 圖 4-6 BALB/c 小鼠經管餵食桂花萃取物及 rutin 對腹腔內注射 APAP 之肺臟組織 TBARs 值之影響 Figure 4-6. The effects of single oral administration of Kwei-Fah extract and rutin on the TBARs content in lung homogenate of BALB/c mice injected i.p. APAP (1.0 g/kg B.W.). LEKF: 100 mg KFE/kg B.W.; HEKF: 1000 mg KFE/kg B.W.; LR: 10 mg rutin/kg B.W.; HR: 100 mg rutin/kg B.W.; PC: Positive control; NC: Negative control. - 99 -
0.4 TBARs (nmol/mg protein) 0.3 0.2 0.1 a a a a a a a 0 LEKF MEKF HEKF LR HR PC NC 圖 4-7 BALB/c 小鼠經管餵食桂花萃取物及 rutin 對腹腔內注射 APAP 之腎臟組織 TBARs 值之影響 Figure 4-7. The effects of single oral administration of Kwei-Fah extract and rutin on the TBARs content in kidney homogenate of BALB/c mice injected i.p. APAP (1.0 g/kg B.W.). LEKF: 100 mg KFE/kg B.W.; HEKF: 1000 mg KFE/kg B.W.; LR: 10 mg rutin/kg B.W.; HR: 100 mg rutin/kg B.W.; PC: Positive control; NC: Negative control. - 100 -