中国农业科学 2009,42(5):1720-1727 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2009.05.027 基于 EST-SSR 的福建地区茶树资源遗传多样性和亲缘关系分析 刘振, 姚明哲, 王新超, 陈亮 ( 中国农业科学院茶叶研究所茶树资源与改良研究中心 / 国家茶树改良中心, 杭州 310008) 摘要 : 目的 通过对福建地区茶树资源进行遗传多样性和亲缘关系分析, 为今后茶树亲本选择或遗传改良等提供依据 方法 利用中国农业科学院茶叶研究所茶树分子生物学实验室新开发的 23 对和他人 3 对共 26 对 EST-SSR 引物对福建省的 42 份茶树种质资源进行 PCR 扩增, 在所得相似系数的基础上进行 UPGMA 聚类, 并绘制亲缘关系树状聚类图 结果 26 对引物共检测到等位位点 86 个, 每个引物为 2~5 个, 平均 3.31 个 ; 遗传多态性信息含量 (PIC) 在 0.05~0.75, 平均值为 0.56 期望杂合度(He) 大小在 0.02~0.81, 平均值为 0.60; 观测杂合度 (Ho) 在 0.02~0.97, 平均值为 0.55; 群体内的 Shannon 指数为 1.16 按相似系数为 0.40 可将参试的 42 份种质资源分为两大类 结论 研究发现福建地区茶树资源具有相对较高的遗传多样性, 并明确了不同资源间的亲缘关系 关键词 : 福建 ; 茶树 ;EST-SSR; 遗传多样性 ; 亲缘关系 Analysis of Genetic Diversity and Relationship of Tea Germplasms Originated from Fujian Province Based on EST-SSR Markers LIU Zhen, YAO Ming-zhe, WANG Xin-chao, CHEN Liang (Research Center for Tea Germplasm and Improvement, Tea Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences/National Center for Tea Improvement, Hangzhou 310008) Abstract: Objective Genetic polymorphism of tea germplasms from Fujian, China and their relationships were analyzed so as to offer some information to be used in genetic improvement and parental selection in tea breeding programs. Method The 26 pairs of EST-SSR primers, including 23 newly derived by the authors and 3 from previous references, were used to analyze the 42 tea accessions from Fujian, China. Based on EST-SSR data, a dendrogram was constructed using UPGMA method. Result Totally 86 alleles were amplified using the 26 EST-SSR primers, the number of alleles per primer ranged from 2 to 5, with an average of 3.31. The polymorphism information content (PIC) varied from 0.05 to 0.75, with an average of 0.56. The expected heterozygosity (H e ) varied from 0.02 to 0.81 and the observed heterozygosity (H o ) ranged from 0.02 to 0.97, with an average of 0.60 and 0.55, respectively. The Shannon index of the Fujian tea population was 1.16. The 42 accessions were classified into 2 groups based on the similarity coefficient at 0.40. Conclusion The results show that the genetic polymorphism of tea germplasms in Fujian is relatively abundant, and the relationships among the 42 accessions are clearly defined. Key words: Fujian; tea plant; EST-SSR; genetic relationship; genetic polymorphism 0 引言 研究意义 茶树[Camellia sinensis(l.)o. Kuntze] 是一种重要的经济作物, 它已成为 21 世纪最流行的健康饮料植物之一 但长期自交不育和异花授粉, 使茶 树成为高度的杂合体 [1] 茶树原产中国, 长期的引种过程, 使茶树广泛分布于世界五大洲 40 多个国家 福建是中国最重要的产茶省之一,2007 年茶叶产量达到 2.216 10 5 t, 为中国各产茶省产量之首 同时, 福建地处中国东南沿海, 属南亚热带和中亚热带气候, 雨 收稿日期 :2008-07-25; 接受日期 :2008-09-22 基金项目 : 国家 863 计划项目 (2006AA10Z171) 浙江省 钱江人才 计划项目 (2006R10042) 浙江省自然科学基金项目 (Y305124 Y305105) 作者简介 : 刘振 (1981-), 男, 陕西丹凤人, 硕士, 研究方向为茶树资源育种 并列第一作者姚明哲 (1975-), 男, 山东成武人, 助理研究员, 研究方向为茶树种质资源与遗传育种 通信作者陈亮 (1967-), 男, 浙江缙云人, 研究员, 博士, 研究方向为茶树种质资源 遗传育种与分子生物学 Tel/Fax: 0571-86652835; E-mail: liangchen@mail.tricaas.com
5 期刘振等 : 基于 EST-SSR 的福建地区茶树资源遗传多样性和亲缘关系分析 1721 量充沛, 其得天独厚的气候和地理条件, 造就茶树种质资源丰富, 素有 茶树良种宝库 之美誉 [2] 福建也是茶树无性繁育短穗扦插技术的发祥地, 在闽南 闽东 闽北的三大老茶区蕴藏着丰富的种质资源, 从而为茶树良种的选育提供了基础素材 对福建地区的茶树资源进行遗传多样性和亲缘关系分析, 将为以后茶树的遗传改良和亲本选择等提供参考 前人研究进展 EST-SSR(expressed sequence tag based simple sequence repeat) 是在 SSR 标记基础上发展起来的一种新的标记方法 它除了具有 SSR 标记中多态性高 共显性遗传 技术简单 重复性好等特点外, 还具有开发引物比较廉价 通用性好 条带清楚 容易统计等优点, 因此,EST-SSR 作为一种新的标记方法在植物遗传多样性分析 遗传图谱构建及标记辅助育种中越来越受到人们的关注 [3], 但在茶树上的应用尚少 [4-5] 本研究切入点 本研究旨在通过作者所在实 验室自主开发的 23 对和他人的 3 对 EST-SSR 引物对福建地区的 42 份资源进行遗传多样性和亲缘关系分析 拟解决的关键问题 在分子水平上进一步探明福建地区茶树资源的现状, 提高资源的利用效率和深度, 加速中国茶树品种的遗传改良 1 材料与方法 1.1 材料选用的 42 份福建地区茶树种质资源 ( 表 1) 保存于中国农业科学院茶叶研究所内的国家种质杭州茶树圃, 都属于山茶属茶组 Camellia L. Sect. Thea(L.) Dyer 的茶 [C. sinensis(l.)o. Kuntze], 外类群弄岛黑茶为秃房茶 (C. gymnogyna Chang) 样品采集后用液氮迅速冷冻处理, 然后将其保存在 -80 冰箱中备用 1.2 方法 表 1 42 份茶树资源的名称及来源 Table 1 The name and origin of 42 accessions tea germplasms 编号种质名称 原产地 编号 种质名称 原产地 No. Germplasm name Origin No. Germplasm name Origin C1 弄岛黑茶 Nongdao Heicha 云南瑞丽 Ruili, Yunnan C23 过山龙 Guoshanlong 福建武夷山 Wuyishan, Fujian C2 种茶 Zhongcha 福建福安 Fuan, Fujian C24 福云杂交 1-1 Fuyun Zajiao 1-1 福建福安 Fuan, Fujian C3 政和大白茶 Zhenghe Dabaicha 福建政和 Zhenghe, Fujian C25 野蔷薇 Yeqiangwei 福建武夷山 Wuyishan, Fujian C4 红芽佛手 Hongya Foshou 福建安溪 Anxi, Fujian C26 红佛观音 218 Hongfo Guanyin 218 福建福安 Fuan, Fujian C5 黄棪 Huangdang 福建安溪 Anxi, Fujian C27 武夷 167 Wuyi 167 福建武夷山 Wuyishan, Fujian C6 春兰韵 Chunlanyun 福建武夷山 Wuyishan, Fujian C28 武夷菜茶 Wuyi Caicha 福建武夷山 Wuyishan, Fujian C7 福鼎大白茶 Fuding Dabaicha 福建福鼎 Fuding, Fujian C29 白月桂 Baiyuegui 福建武夷山 Wuyishan, Fujian C8 武夷 168 Wuyi 168 福建武夷山 Wuyishan, Fujian C30 金鸡公 Jinjigong 福建武夷山 Wuyishan, Fujian C9 金钱草 Jinqiancao 福建武夷山 Wuyishan, Fujian C31 碎海棠 Suihaitang 福建武夷山 Wuyishan, Fujian C10 银钱 Yinqian 福建武夷山 Wuyishan, Fujian C32 红月桂 Hongyuegui 福建武夷山 Wuyishan, Fujian C11 毛蟹 Maoxie 福建安溪 Anxi, Fujian C33 白鸡冠 Baijiguan 福建武夷山 Wuyishan, Fujian C12 红鸡冠 Hongjiguan 福建武夷山 Wuyishan, Fujian C34 梅占 Meizhan 福建安溪 Anxi, Fujian C13 黄龙 Huanglong 福建武夷山 Wuyishan, Fujian C35 过江龙 Guojianglong 福建武夷山 Wuyishan, Fujian C14 金石槲 Jinshihu 福建武夷山 Wuyishan, Fujian C36 水杨梅 Shuiyangmei 福建武夷山 Wuyishan, Fujian C15 茗科 1 号 Mingke 1 福建福安 Fuan, Fujian C37 铁罗汉 Tieluohan 福建武夷山 Wuyishan, Fujian C16 石乳 Shiru 福建武夷山 Wuyishan, Fujian C38 北斗 Beidou 福建武夷山 Wuyishan, Fujian C17 黄奇 Huangqi 福建福安 Fuan, Fujian C39 半天妖 Bantianyao 福建武夷山 Wuyishan, Fujian C18 福云杂交 2-2 Fuyun Zajiao2-2 福建福安 Fuan, Fujian C40 满地红 Mandihong 福建武夷山 Wuyishan, Fujian C19 福云 6 号 Fuyun 6 福建福安 Fuan, Fujian C41 翠岗早 Cuigangzao 福建福鼎 Fuding, Fujian C20 金沉香 Jinchenxiang 福建武夷山 Wuyishan, Fujian C42 红英 Hongying 福建武夷山 Wuyishan, Fujian C21 仙人茶 Xianrencha 福建武夷山 Wuyishan, Fujian C43 青狮王 Qingshiwang 福建武夷山 Wuyishan, Fujian C22 白茉莉 Baimoli 福建武夷山 Wuyishan, Fujian
1722 中国农业科学 42 卷 [6] 1.2.1 DNA 的提取采用改进的 SDS 法提取基因组 DNA 0.7% 琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 质量,Shimadzu UV2550 分光光度计 ( 日本津岛公司 ) 测定 DNA 浓度 [5] [7] 1.2.2 引物合成按照刘振等和 Zhao 等的引物编号和序列, 由上海生工生物工程技术服务有限公司合成 1.2.3 PCR 扩增和产物检测 PCR 扩增在 PTC-200 型 PCR 仪 (MJ Research,Inc.,Waltham,MA,USA) 上进行, 反应体系与扩增程序同刘振等 [5] PCR 反应重复进行 2 次 扩增产物用 10% 聚丙烯酰胺凝胶在 Bio-Rad 300 型电泳仪 (Bio-Rad Laboratories,Hercules, CA,USA) 上进行电泳, 电压为 150 V, 时间为 350 min, 电泳后参照 Charters [8] 的方法银染显色 Bio-Rad Gel Doc 2000 凝胶成像仪拍照记录 1.3 数据处理利用人工方法读带, 将电泳图上可重复的 清晰的条带记为 1, 同一位置无带或不易分辨的弱带计为 0 建立原始数据矩阵 计算每对引物扩增位点的多态性信息量 (polymorphism information content, PIC),PIC=1- P 2 i, 式中 P i 表示第 i 个等位位点出现的频率 [9] [10] 根据 Nei 的方法计算等位位点的期望杂合度 H e (expected heterozygosity); 观测杂合度 H o (observed heterozygosity) 的计算公式为 H o =H/S, 其中 H 为杂合样本数,S 为所有的样本数 [11] 利用软件 Popgen(http://cc.oulu.fi/~jaspi/popgen/ popdown.htm) 对供试群体的哈特 - 温伯格平衡进行显著性检验, 并估算 Shannon 信息指数 (I) 和 Nei 基因多样性, 以评估供试材料的遗传多样性水平 利用软件 NTSYS 2.1 [12] 计算不同茶树资源间的遗传相似性系数, 按 UPGMA(unweighted pair group method using arithmetic averages) 法进行聚类分析, 绘制亲缘关系树状图 2 结果与分析 2.1 不同引物扩增的等位位点数及多态性 26 对引物在供试种质资源间共检测到等位位点 86 个, 平均每对引物可检测到 3.31 个, 其中最多的 ( 引物 641) 为 5 个, 最少的 (79 687 699 和 710) 为 2 个 ; 供试材料的多态性信息量 (PIC) 变化范围较大, 其中引物 C5 PIC 最小为 0.05,PIC 最大的为 0.75 (496 630 和 1036), 平均值为 0.56(>0.50), 这说明所选用的 26 对引物总体上的多态性较高 对这 26 对引物的哈特 - 温伯格显著性检验结果发现, 除引 物 228 288 630 802 699 的 P<0.05 外, 其余引物均为 P<0.01( 表 2) 2.2 福建地区茶树资源的遗传多样性对福建地区 42 份茶树资源采用了 26 个 EST-SSR 标记进行群体内遗传多样性研究, 结果表明 Nei 期望杂合度在 0.02( C4)~0.80(14) 变动, 平均值为 0.57 Nei 表示在被检测位点上群体中杂合子的频率, 它是群体杂合程度的度量单位 Nei 值越大, 反映该群体的遗传一致性越低, 也就是说群体的遗传变异越多, 群体的遗传多样性越高 [13] 同时, 群体的观测杂合度 (H o ) 和期望杂合度 (H e ) 的平均值较为一致, 其中 H e 平均为 0.60, 大小在 0.02( C4)~0.81(14); H o 平均为 0.55, 大小在 0.02( C4)~0.97(685); Shannon 信息指数 (I) 为 0.06( C4)~1.84(14), 平均值为 1.16( 表 2) 这些结果均表明福建地区的茶树资源拥有较高的遗传多样性 作者以类似的方法研究了中国西南 4 省 ( 市 ) 茶树资源的遗传多样性与亲缘关系 [5] 表 3 为福建与西南 4 省 ( 市 ) 茶树资源遗传多样性的比较 从表 3 可以看出, 不同地区 Nei 值的大小在 0.48~0.66, 云南最大 (0.66), 贵州最小 (0.48); 同时,I 在不同地区间也有较大差异, 与 Nei 值趋势一致, 其中最大云南为 1.40, 最小贵州为 0.87; 云南 四川和重庆 H e 均为 0.67, 最小贵州为 0.53;H o 在 0.22~0.56, 最大的为四川, 最小的为贵州 福建省茶树资源的各项遗传多样性评价指标均居于中等偏上水平, 遗传多样性水平相对较高 2.3 不同资源间的亲缘关系福建地区茶树资源之间的相似系数为 0.29~ 0.85, 变幅较大 ( 表 4) 其中政和大白茶与茗科 1 号的相似系数最小, 为 0.29; 同时, 茗科 1 号与半天妖 政和大白茶与野蔷薇的相似系数也较小, 都为 0.31, 表明它们之间的亲缘关系较远 ; 武夷菜茶与白月桂的相似系数最大, 为 0.85, 表明它们之间的亲缘关系较近 根据相似系数矩阵按 UPGMA 法进行聚类, 形成了 42 份供试资源的亲缘关系树状图 ( 图 ) 来自云南的弄岛黑茶 (C1) 作为外类群, 在聚类图中形成单独的分支, 作为茶树的近缘种, 表现出与其它资源较远的亲缘关系 在相似系数 0.4 处福建的 42 份资源聚成两个类群, 第 I 类群为一个大类群, 它包括 39 份资源, 其中有武夷山的资源 26 份, 福安的资源 6 份, 安溪的资源 4 份, 其它地区的资源 3 份 在该类群中, 部分
5 期 刘振等 : 基于 EST-SSR 的福建地区茶树资源遗传多样性和亲缘关系分析 1723 表 2 26 对引物在 42 份资源中的扩增结果 Table 2 The amplification information of 26 pairs of primer in 42 accessions tea germplasms 引物编号 Primer code 等位基因数 Alleles PIC Nei H e H o I P HW 14 4 0.71 0.80 0.81 0.86 1.84 ** 21 4 0.66 0.72 0.73 0.74 1.47 ** 79 2 0.43 0.52 0.53 0.38 0.90 ** 108 4 0.71 0.77 0.78 0.69 1.73 ** 228 4 0.66 0.65 0.66 0.52 1.33 * 234 4 0.70 0.75 0.76 0.52 1.54 ** 288 4 0.69 0.74 0.75 0.64 1.57 * 395 3 0.62 0.71 0.72 0.33 1.39 ** 463 3 0.35 0.44 0.44 0.19 0.82 ** 478 3 0.65 0.78 0.79 0.81 1.56 ** 496 4 0.75 0.64 0.65 0.95 1.19 ** 588 3 0.59 0.71 0.72 0.36 1.36 ** 630 3 0.66 0.77 0.78 0.79 1.79 * 641 5 0.72 0.71 0.72 0.64 1.39 ** 663 3 0.75 0.57 0.57 0.36 0.97 ** 685 4 0.62 0.56 0.56 0.97 0.96 ** 687 2 0.44 0.37 0.38 0.12 0.68 ** 699 2 0.16 0.11 0.11 0.07 0.23 ** 710 2 0.24 0.69 0.69 0.86 1.38 ** 788 4 0.57 0.61 0.62 0.88 1.13 ** 802 3 0.16 0.16 0.69 0.07 0.37 * 1036 4 0.75 0.53 0.54 0.40 0.90 ** 1110 3 0.72 0.54 0.55 0.83 0.65 ** A2 3 0.67 0.16 0.20 0.95 1.20 ** C4 3 0.65 0.02 0.02 0.02 0.06 ** C5 3 0.05 0.76 0.77 0.93 1.67 ** 平均值 Mean 3.31 0.56 0.57 0.60 0.55 1.16 ** 和 * 表示偏离哈特 - 温伯格平衡的显著程度分别为 P<0.01 和 P<0.05 ** and * denote significant deviation from Hardy Weinberg equilibrium P<0.01 and P<0.05, respectively 表 3 5 个不同省份茶树资源的遗传多样性比较 Table 3 The difference of genetic diversity between the five provinces of China 地区 Province N Nei I H e H o 福建 Fujian 42 0.57 1.16 0.60 0.55 重庆 Chongqing 15 0.63 1.24 0.67 0.32 贵州 Guizhou 8 0.48 0.87 0.53 0.22 四川 Sichuan 14 0.65 1.34 0.67 0.56 云南 Yunnan 22 0.66 1.40 0.67 0.52 N: 样本数 ;Nei:Nei 基因多样性 ;I:Shannon 信息指数 ;H e : 期望杂合度 ;H o : 观测杂合度 N: Sample number; Nei: Nei s gene diversity; I: Shannon s index; H e : Expected heterozygosity; H o : Observed heterozygosity
1724 中国农业科学 42 卷 表 4 42 份茶树资源间的相似系数 Table 4 The similarity coefficient among 42 accessions tea germplasms 编号 C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 C9 C10 C11 C12 C13 C14 C15 C16 C17 C18 C19 C20 C21 C22 C23 C24 C25 C26 C27 C28 C29 C30 C31 C32 C33 C34 C35 C36 C37 C38 C39 C40 C41 C42 No. C2.39 C3.28.63 C4.27.65.56 C5.29.66.54.50 C6.36.66.65.58.52 C7.39.77.63.67.63.68 C8.37.72.54.62.60.63.69 C9.40.61.55.59.57.65.68.69 C10.28.67.59.60.58.59.69.78.62 C11.35.74.68.57.63.73.73.69.68.72 C12.34.72.64.65.63.64.77.72.62.73.77 C13.33.70.58.57.60.58.72.65.59.62.67.68 C14.39.70.64.60.61.64.72.75.67.73.75.73.65 C15.17.44.29.37.38.41.39.41.36.34.42.42.42.41 C16.34.62.51.65.50.52.67.65.54.60.57.60.60.57.42 C17.37.70.56.62.60.58.81.73.59.62.62.70.71.62.48.72 C18.32.60.59.55.51.72.67.68.59.60.67.63.66.66.52.60.66 C19.40.71.55.61.57.60.76.80.68.67.61.69.67.67.40.70.79.65 C20.32.58.55.58.57.58.68.63.63.59.58.57.61.61.42.61.67.73.68 C21.37.63.55.58.54.68.66.69.63.61.63.54.58.67.34.53.61.62.66.68 C22.37.60.59.52.61.62.63.63.62.58.63.56.55.63.38.61.63.58.68.71.77 C23.34.59.60.51.55.62.61.63.56.59.70.59.58.66.38.56.56.69.58.65.65.62 C24.36.71.60.56.62.70.73.68.65.64.73.71.63.64.38.59.63.67.70.60.58.59.62 C25.23.44.31.48.40.36.41.41.35.33.37.37.45.36.46.48.45.43.43.41.38.37.38.40 C26.42.52.42.54.50.51.57.62.61.52.48.57.49.57.35.54.56.55.66.58.51.55.56.61.32 C27.38.69.60.64.60.70.73.69.66.64.63.69.67.62.38.59.72.59.68.58.66.60.58.58.40.54 C28.41.69.61.65.55.73.69.67.64.65.69.70.57.70.37.55.62.65.64.63.66.63.59.63.36.57.71 C29.34.71.60.66.55.70.70.68.68.64.65.69.61.64.41.56.63.64.63.60.63.57.56.62.38.56.73.85 C30.30.57.51.49.48.52.57.55.47.52.59.58.60.55.48.52.60.60.54.56.56.61.54.54.39.47.52.65.69 C31.28.61.47.50.51.45.61.58.48.53.58.64.55.56.52.47.61.53.55.47.47.46.50.52.42.43.58.56.57.62 C32.35.68.65.63.52.67.73.66.58.63.65.71.66.66.39.56.72.67.68.57.62.54.57.60.42.49.76.80.78.67.63 C33.38.62.57.63.58.66.69.70.62.63.62.68.63.70.38.53.65.68.62.67.64.58.61.59.37.57.72.78.77.60.54.74 C34.42.70.59.63.56.69.70.68.60.61.65.68.63.68.40.58.66.66.70.59.65.64.62.64.37.63.73.82.75.63.59.75.76 C35.28.58.52.58.56.55.61.56.50.56.56.59.64.59.43.53.64.59.55.54.54.54.48.55.42.48.60.64.63.68.60.69.59.65 C36.28.61.47.61.59.48.63.53.43.51.55.61.55.56.40.50.61.46.52.47.47.44.46.52.46.43.55.56.57.55.63.59.61.54.66 C37.20.47.36.41.42.42.43.38.37.35.48.46.52.40.55.41.44.47.39.36.33.34.40.42.44.30.42.43.49.52.53.46.37.41.53.53 C38.35.64.63.64.48.63.69.59.61.55.64.62.62.65.40.65.64.65.58.58.58.60.58.58.37.52.66.72.74.65.58.71.70.73.64.58.46 C39.32.62.64.57.53.54.65.52.49.57.57.66.54.60.31.52.54.50.56.48.53.55.52.59.36.49.56.60.61.57.53.61.53.61.62.55.41.57 C40.34.68.59.63.56.67.65.68.62.63.70.66.57.63.41.58.60.58.62.56.64.61.62.67.43.52.65.68.67.58.62.64.58.63.62.53.45.57.60 C41.38.71.63.59.60.63.68.64.58.59.66.69.61.64.38.56.61.59.66.58.60.57.60.63.43.51.66.69.70.62.58.70.67.70.58.57.44.61.67.73 C42.35.73.61.59.55.63.64.67.56.57.64.60.65.68.42.57.62.63.69.56.61.60.58.61.42.52.61.67.63.57.61.63.55.71.64.53.52.62.63.71.75 C43.35.67.61.54.60.61.69.62.56.57.69.65.62.68.45.54.65.63.61.58.67.63.61.58.39.45.56.67.63.72.58.69.60.63.64.55.49.59.63.68.72.71 编号与表 1 同 The numbers are serial number of the 42 germplasms (See Table 1 for details)
5 期刘振等 : 基于 EST-SSR 的福建地区茶树资源遗传多样性和亲缘关系分析 1725 编号同表 1 The numbers in the right row are serial number of 42 germplasms( See Table 1 for details) 图 42 份茶树种质资源 EST-SSR 数据的 UPGMA 聚类分析树状图 Fig. Dendrogram of 42 accessions tea germplasms based on EST-SSR data using UPGMA clustering method 来自于同一地区的资源又根据遗传距离的远近聚为不同的亚类群 如福安的种茶 黄奇 福云 6 号和福鼎大白茶 ; 武夷山的银钱 红鸡冠 黄龙 金石槲等分别在不同的亚类群中聚类 第 Ⅱ 类包括茗科 1 号 铁罗汉和野蔷薇 3 份资源, 其中茗科 1 号为选育品种, 来源于铁观音和黄棪的杂交后代, 而其它两份资源皆为武夷山的地方品种 3 讨论 3.1 福建茶树资源的遗传多样性从分子水平上来说, 相似系数的变幅越大,PIC 越高, 物种遗传分化越大, 遗传多样性越高, 同时也就证明此物种的遗传背景越复杂 当 PIC>0.5 时, 该基因座为高度多态性,0.25<PIC<0.5 时, 为中度多态基因座,PIC<0.25 时为低度多态性 [9] 本研究所采用的 26 对引物对福建地区扩增结果显示, 所参试的资 源间相似系数的范围在 0.29~0.85, 平均值为 0.56 福建茶树资源的 PIC Nei 值 H e H o 以及 I 值均显示该地区的茶树资源拥有相对较高的遗传多样性 这与先前利用 RAPD [14] 和 AFLP [15] 对福建茶树资源的研究结果相似 福建与西南 4 省 ( 市 ) 相比,Nei 和 I 均以云南最大, 依次为四川 重庆 福建和贵州地区, 说明遗传多样性最丰富的为云南, 其次为四川 重庆 福建, 最后为贵州 与陈亮等 [16] 段红星等 [17] [18] 侯渝嘉等的研究结果相似, 这可能与中国茶树的起源与传播途径有关 从茶树的萜烯指数推测, 茶树在中国有 4 条主要传播途径, 第 1 条从云南经广西 广东 福建到浙江, 即沿海路传播 ; 第 2 条从云南先经四川, 再进入陕西 ; 第 3 条从云南沿长江, 自四川 湖北传至安徽和江苏 ; 第 4 条从云南经四川到贵州 湖南进入江西和浙江 [19] 从表 3 可以看出, 与云南 四川 重庆
1726 中国农业科学 42 卷 地区的茶树遗传多样性相比, 福建地区茶树资源的遗传多样性稍低于这些地区 这可能还与这一地区的茶树栽培历史有一定的关系 福建是茶树无性繁育短穗扦插技术的发祥地, 迄今为止, 福建的创新品种所使用的亲本材料主要是福鼎大白茶 铁观音 黄棪等少数几个品种, 而且自 1980 年代以来, 由于茶业向集约化方向发展, 福云 6 号 福鼎大白茶 福安大白茶 毛蟹 福建水仙 福鼎大毫茶等少数几个品种被大面积推广, 占全省茶园总面积的 60% 以上, 使茶树品种趋于单一化, 地方菜茶群体种 苦茶资源越来越少, 由此导致遗传多样性水平日益降低, 品种的遗传基础越来越窄 [20] 从相似系数基础上的聚类图也能充分说明这一点, 它们彼此聚在一起, 没有明显地分为几个类群 3.2 福建地区不同资源间的亲缘关系不同资源的亲缘关系是由它们的遗传背景决定的, 遗传背景越近, 它们的相似程度就越高, 相似系数就越大 从所参试的 42 份资源来看, 遗传关系较近的资源往往能聚在一起 同样, 一些相似系数较小的资源彼此互相分开, 如政和大白茶与铁观音 黄棪的杂交后代茗科 1 号的相似系数就较小, 为 0.29 从理论上讲, 福云杂交系之间 黄棪和茗科 1 号之间应该有较近的遗传距离, 彼此之间能聚在一起, 但是结果却不完全是这样, 这可能与笔者采用的标记类型及标记的数量有关 因为 EST-SSR 标记为一种共显性标记, 它标记的是染色体上的转录区域, 因此在区分相似性程度较高的资源时还有待于进一步改进 同时, 分子标记分析资源间的亲缘关系是建立在一定的统计分析基础之上, 选用的标记越多, 结果越可靠 因而, 如果能开发更多有效的茶树 EST-SSR 标记, 那么试验结果可能会更为理想 4 结论 通过 26 对 EST-SSR 引物对 42 份茶树资源进行了遗传多样性和亲缘关系分析, 发现福建地区茶树资源具有相对较高的遗传多样性 利用不同资源间的相似系数和在此基础上的聚类分析可为以后利用福建茶树资源作为亲本进行遗传改良等提供参考 References [1] 陈亮, 杨亚军, 虞富莲. 中国茶树种质资源研究的主要进展和展望. 植物遗传资源学报, 2004, 5(4): 389-392. Chen L, Yang Y J, Yu F L. Tea germplasm research in China: recent progresses and prospects. Journal of Plant Genetic Resources, 2004, 5(4): 389-392. (in Chinese) [2] 叶乃兴, 郭吉春. 福建茶树品种资源的研究现状与展望. 福建茶叶, 1997, (1): 42-45. Ye N X, Guo J C. Tea germplasm research in Fujian: research status and prospects. Tea In Fujian, 1997, (1): 42-45. (in Chinese) [3] 王家麟, 孙佳莹, 于清岩, 李亮, 王艳丽, 宋金壑, 刘春燕, 胡国华, 陈庆山. EST-SSRs 的开发及应用研究进展. 生物信息学, 2006, 5(3): 140-142. Wang J L, Sun J Y, Yu Q Y, Li L, Wang Y L, Song J H. Liu C Y, Hu G H, Chen Q S. Progress of EST- SSRs exploiting and application. China Journal of Bioinformatics, 2006, 5(3): 140-142. (in Chinese) [4] 金基强, 崔海瑞, 龚晓春, 陈文岳, 忻雅. 用 EST-SSR 标记对茶树种质资源的研究. 遗传, 2007, 29(1): 103-108. Jin J Q, Cui H R, Gong X C, Chen W Y, Xin Y. Studies on tea plants (Camellia sinensis) germplasms using EST-SSR marker. Hereditas (Beijing), 2007, 29(1): 103-108. (in Chinese) [5] 刘振, 王新超, 赵丽萍, 姚明哲, 王平盛, 许玫, 唐一春, 陈亮. 基于 EST-SSR 的西南地区茶树资源遗传多样性和亲缘关系分析. 分子植物育种, 2008, 6(1): 100-110. Liu Z, Wang X C, Zhao L P, Yao M Z, Wang P S, Xu M, Tang Y C, Chen L. Genetic diversity and relationship analysis of tea germplasms originated from southwestern China based on EST-SSR. Molecular Plant Breeding, 2008, 6(1): 100-110. (in Chinese) [6] 陈亮, 陈大明, 高其康, 杨亚军, 虞富莲. 茶树基因组 DNA 提纯与鉴定. 茶叶科学, 1997, 17(2): 177-181. Chen L, Chen D M, Gao Q K, Yang Y J, Yu F L. Isolation and appraisal of genomic DNA from tea plant [Camellia sinensis (L. ) O. Kuntze]. Journal of Tea Science, 1997, 17 (2): 177-181. (in Chinese) [7] Zhao L P, Liu Z, Chen L, Yao M Z, Wang X C. Generation and characterization of 24 novel EST derived microsatellites from tea plant (Camellia sinensis) and cross-species amplification in its closely related species and varieties. Conservation Genetics, 2008, 9: 1327-1331. [8] Charters Y M, Wilkinson M J. The use of self-pollinated progenies as in-groups for the genetic characterization of cocoa germplasm. Theoretical and Applied Genetics, 2000, 100: 160-166. [9] Botstein D, White R L, Skolnick M, Davis R W. Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms. American Journal of Human Genetics, 1980, 32: 314-331. [10] Nei M. Estimation of average heterozygosity and genetic distance from a small number of individuals. Genetics, 1978, 89: 583-590. [11] Ghislain M, Andrade D, Rodríguez F, Hijmans R J, Spooner D M.
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