Elisa 的原理及操作 注意事项 一 ELISA 基础知识 ELISA 是一种免疫测定 免疫测定 (immunoassay,ia) 是应用免疫学技术测定标本的方法 在临床检验中主要通过抗原抗体反应检测体液中的抗体或抗原性物质 1. 抗原抗原是能在机体中引起特异性免疫应答的物质 抗原进入机体后, 可刺激机体产生抗体和引起细胞免疫 在免疫测定中, 抗原是指能与抗体结合的物质 能在机体中引起抗体产生的抗原多为分子量大于 5000 的蛋白质, 例如乙型肝炎病毒表面抗原 (HBsAg) 甲胎蛋白(AFP) 等 小分子化合物在与大分子蛋白质结合后能引起机体产生特异性抗体的, 称为半抗原 (hapten) 例如某些激素 药物等 抗原的反应性取决于抗原决定簇 (antigenic determinant), 或称为表位 (epitope) 一个抗原分子可带有不同的决定簇, 例如中可带有等决定簇 2 抗体 2.1 抗体的结构抗体是能与抗原特异性结合的免疫球蛋白 (immunoglobulin,ig) Ig 分五类, 即 IgG IgA IgM IgD 和 IgE 与免疫测定有关的 Ig 主要为 IgG 和 IgM Ig 由两个轻链 (L) 和两个重链 (H) 的单体组成 Ig 的轻链是相同的, 有 κ(kappa) 和 λ(lambda) 两种型别 五类 Ig 的重链结构不同, 这决定了它们的抗原性也不同 IgG 和 IgM 的重链分别称为 γ(gamma) 链和 μ(mu) 链 IgG 的结构见图 1 木瓜酶裂解部位 2 胃蛋白酶裂解部位 重链和轻链的 N 端的氨基酸排列顺序因各种抗体而异, 称为可变区, 分别用 VH 和 VL 表示 两者构成 抗体的抗原结合部位, 只与相应的抗原决定簇匹配, 发生特异性结合 ( 见图 ), 是抗体专一性结合抗原的 结构基础 IgG 可被木瓜蛋白酶分解为三个区段, 其中两个相同的区段称抗原结合片段 (Fab) 每个 Fab 都保存结合抗原的能力, 但只有一个抗原结合位点, 是单价的, 与抗原结合后不出现凝集或沉淀 另一区段称 Fc 段, 无抗体活性, 但具有 IgG 特有的抗原性 IgG 可被胃蛋白酶分解为两个片段, 一个 Fab 双体, 称 F(ab')2, 能和两个相同的抗原结合 ; 另一片段类似 Fc, 随后被分解成小分子多肽, 无生物活性 IgM 是由五个单体组成的五聚体, 含 10 个重链和 10 个轻链, 具有 10 个抗原结合价, 由于空间位置的影响, 只表现为五个抗原结合价 IgM 分子量约为 900000,IgG 分子量约为 150000 机体被微生物感染后, 先产生 IgM 抗体, 然后产生 IgG 抗体 经过一段时间,IgM 抗体量逐渐减少而消失, 而 IgG 抗体可长期存 1
在, 在疾病痊愈后可持续数年之久 IgM 抗体一般为保护性抗体具有免疫性 因此 IgM 抗体的测定, 对某些传染病如甲型肝炎有较高的临床诊断价值 上图为为甲型肝炎病人血清中 IgG 抗体和 IgM 抗体出现的时间和水平 2.2 抗体的产生机体受抗原刺激后,B 淋巴细胞产生相应的抗体 含有抗体的血清称为抗血清 (antiserum) 每一系 B 细胞只产生针对某一抗原决定簇的抗体 如将多种抗原或含有多个抗原决定簇的抗原注入机体, 则将由多系的 B 细胞产生相应的多种抗体, 这些抗体均存在于免疫血清中 免疫测定中所用的抗血清一般用抗原免疫兔 羊或马制得 产生抗体的 B 细胞可在体外与繁殖力强的肿瘤细胞融合成杂交瘤细胞 将单个杂交瘤细胞分离, 在体内或体外培养而分泌的抗体单克隆抗体 (monoclonal antibody,mcab 或 Mab) 单克隆抗体仅针对一种抗原决定簇, 具有很高的特异性 单克隆抗体通常用抗原免疫小鼠制备 将免疫的脾细胞 ( 含产生抗体的 B 细胞 ) 与小鼠肿瘤细胞融合, 分离杂交瘤细胞, 接种于小鼠腹腔, 产生的腹水中含有浓度很高的单克隆抗体 3 抗原抗体反应 3.1 可逆性抗原与抗体结合形成抗原抗体复合物的过程是一种动态平衡, 其反应式为 :Ag+Ab Ag Ab 抗体的亲和力 (affinity) 是抗原抗体间的固有结合力, 可以用平衡常数 K 表示 :K=[Ag Ab]/[Ag][Ab] Ag Ab 的解离程度与 K 值有关 高亲和力抗体的抗原结合点与抗原的决定簇在空间构型上非常适合, 两者结合牢固, 不易解离 解离后的抗原或抗体均能保持原有的结构和活性, 因此可用亲和层析法来提纯抗原或抗体 在抗血清中, 特异性的 IgG 抗体仅占总 IgG 中的极小部分 用亲和层析法提取的特异性抗体, 称为亲和层析纯抗体, 应用于免疫测定中可得到更好的效果 3.2 最适比例在恒定量的抗体中加入递增量的抗原形成抗体复合物 ( 沉淀 ) 的量见图 1-4 曲线的高峰部分是抗原抗体比例最合适的范围, 称为等价带 (zone of equivalence) 在等价带前后分别为抗体过剩带和抗原过剩带 如果抗原或抗体极度过剩, 则无沉淀物形成, 在免疫测定中称为带现象 (zone phenomenon) 抗体过量称为前带 (prezone), 抗原地过量称为后带 (postzone) 在用免疫学方法测定抗原时, 应使反应系统中有足够的抗体量, 否则测得的量会小于实际含量, 甚至出现假阴性 3.3 特异性抗原抗体的结合实质上只发生在抗原的抗原决定簇与抗体的抗原结合位点之间 由于两者在化学结构和空间构型上呈互补关系, 所以抗原抗体反应具有高度的特异性 例如乙肝病毒中的表面抗原 (HBsAg) e 抗原 (HBeAg) 和核心抗体 (HBcAg), 随来源于同一病毒, 但仅与其相应的抗体结合, 而不与另外两种抗体反应 抗原抗体反应的这种特异性使免疫测定能在一非常复杂的蛋白质化合物 ( 例如血清 ) 中测定某一特定的物质, 而不需先分离待检物 但是这种特异性也不是绝对的 假使两种化合物有着部分相同的结构, 在抗原抗体反应中可出现交叉反应 例如 : 绒毛膜促性腺激素 (hcg) 和黄体生成激素 (LH) 均由 α 和 β 两个亚单位组成, 其结构的不同处在 β 亚单位, 而两者的 α 亚单位是同类的 用 hcg 免疫动物所得的抗血清中含有抗 α-hcg 和抗 β-hcg 两种抗体, 抗 α-hcg 抗体将与 LH 中的 α 酶位发生交叉反应 在临床检验中, 如用抗 hcg 抗血清作为妊娠诊断试剂检定尿液中 hcg, 只能用于 hcg 浓度较高的试验, 否则妇女生理性排泄入尿液中的微量 LH 将与之发生交叉反应 因此在作为早孕诊断 ( 敏感度应达到 50mIu/mlhCG) 的实 2
际中必须应用只对 hcg 特异的抗 β-hcg, 以避免与其它激素的交叉反应的发生 3.4 敏感性在测定血清中某一物质的含量时, 化学比色法的敏感度为 mg/ml 水平, 酶反应测定法的敏感度约为 5~10 μg/ml, 免疫测定中凝胶扩散法和浊度法的敏感度与酶反应法相仿 标记的免疫测定的敏感度可提高数千倍, 达 ng/ml 水平 例如, 用放射免疫测定法或酶免疫测定法测定 HBsAg, 其敏感度可达 0.1ng/ml 4 免疫测定在临床检验中的应用由于各种抗原成份, 包括小分子的半抗原, 均可用以制备特异性的抗血清或单克隆抗体, 利用此抗体作为试剂就可检测标本中相应的抗原, 因此免疫测定的应用范围极广, 在临床检验中可用于测定 : 1) 体液中的各种蛋白质, 包括含量极少的蛋白质如甲胎蛋白等 2) 激素, 包括小分子量的甾体激素等 3) 抗生素和药物 4) 病原体抗原,HBsAg HBeAg 等 5) 另外, 也可利用纯化的抗原检测标本中的抗体, 例如抗 -HBs 等 5 标记的免疫测定如上所述, 免疫测定是一种很敏感的测定方法, 抗原抗体反应后直接测定形成的沉淀或浊度, 敏感度可达 5~10μg/ml, 但在临床检验中, 某些待测物在标本中的含量远低于这一水平, 因此要寻找增加敏感度的方法 标记的免疫测定是将检测试剂中的抗原或抗体用可微量测定的物质加以标记, 通过测定标记物来提高敏感度 在放射免疫测定和酶免疫测定中, 标记物分别为放射性核素和酶, 最后用测定放射性和酶活力来计算待检物的量, 敏感度可比直接测定沉淀物提高数百至数千倍 在标记免疫测定中, 一般加入过量的标记试剂以保证与待测物彻底反应 以标记抗体 (Ab ) 检测抗原 (Ag) 为例, 反应式如下 : Ag+ Ab AgAb + Ab 在反应产物中有与 Ag 结合的 Ab 和游离和 Ab, 如不将两者分离而测定标记物, 测得的结果将为两者之和 因此, 游离标记物与结合标记物的分离是标记免疫测定中的重要步骤 可采用多种手段, 固相载体是其中之一 如将抗原或抗体包被在固相载体上, 然后再与标记的抗原或抗体直接反应, 结合的标记物被固定在载体上, 而游离的标记物留于溶液中 这样可以通过洗涤将游离的 Ab 除去, 结合标记物的测定可在固相上进行 6. 酶免疫测定酶免疫测定 (enzyme immunoassay) 可分为均相 (homogenous) 和非均相 (heterogenous) 两种类型 在均相 EIA 中可不需进行游离的和结合的标记物的分离而直接测定标记物 例如在某种条件下, 抗原抗体反应后形成的酶标记抗原抗体复合物中的酶失去其对底物作用的活力, 因而测出的酶活力直接反映游离的酶标记物 均相 EIA 在临床检验中较少应用 非均相 EIA 需先进行游离的和结合的标记物的分离 如前所述, 固相载体可用作一种分离手段 这种固相酶免疫测定方法在 1971 年最初建立时称为酶联免疫吸附剂测定 (enzyme linked immunosorbent assay), 简称 ELISA, 在国内有译作酶联免疫吸附试验的, 虽然含义不完全确切, 但已习用 二 ELISA 的原理和类型 1. ELISA 的原理 ELISA 的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记 结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性, 酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性, 又保留酶的活性 在测定时, 受检标本 ( 测定其中的抗体或抗原 ) 与固相载体表面的抗原或抗体起反应 用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开 再加入酶标记的抗原或抗体, 也通过反应而结合在固相载体上 此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例 加入酶反应的底物后, 底物被酶催化成为有色产物, 产物的量与标本中受检物质的量直接相关, 故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析 由于酶的催化效率很高, 间接地放大了免疫反应的结果, 使测定方法达到很高的敏感度 2. ELISA 的类型 ELISA 可用于测定抗原, 也可用于测定抗体 在这种测定方法中有三个必要的试剂 :(1) 固相的抗菌 3
素原或抗体, 即 " 免疫吸附剂 "(immunosorbent);(2) 酶标记的抗原或抗体, 称为 " 结合物 "(conjugate); (3) 酶反应的底物 根据试剂的来源和标本的情况以及检测的具体条件, 可设计出各种不类型的检测方法 用于临床检验的 ELISA 主要有以下几种类型 : 2.1 双抗体夹心法测抗原 双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法, 操作步骤如下 : 1) 将特异性抗体与固相载体联结, 形成固相抗体 洗涤除去未结合的抗体及杂质 2) 加受检标本, 保温反应 标本中的抗原与固相抗体结合, 形成固相抗原抗体复合物 洗涤除去其他未结合物质 3) 加酶标抗体, 保温反应 固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合 彻底洗涤未结合的酶标抗体 此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关 4) 加底物显色 固相上的酶催化底物成为有色产物 通过比色, 测知标本中抗原的量 在临床检验中, 此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原, 例如 HBsAg HBeAg AFP hcg 等 只要获得针对受检抗原的异性抗体, 就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法 如抗体的来源为抗血清, 包被和酶标用的抗体最好分别取自不同种属的动物 如应用单克隆抗体, 一般选择两个针对抗原上不同决定簇的单抗, 分别用于包被固相载体和制备酶结合物 这种双位点夹心法具有很高的特异性, 而且可以将受检标本和酶标抗体一起保温反应, 作一步检测 在一步法测定中, 当标本中受检抗原的含量很高时, 过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合, 而不再形成 " 夹心复合物 " 类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象, 此时反应后显色的吸光值 ( 位于抗原过剩带上 ) 与标准曲线 ( 位于抗体过剩带上 ) 某一抗原浓度的吸光值相同 ( 参见 1.3.2, 图 1-4), 如按常法测读, 所得结果将低于实际的含量, 这种现象被称为钩状效应 (hook effect), 因为标准曲线到达高峰后呈钩状弯落 钩状效应严重时, 反应甚至可不显色而出现假阴性结果 因此在使用一步法试剂测定标本中含量可异常增高的物质 ( 例如血清中 HBsAg AFP 和尿液 hcg 等 ) 时, 应注意可测范围的最高值 用高亲和力的单克隆抗体制备此类试剂可削弱钩状效应 假使在被测分子的不同位点上含有多个相同的决定簇, 例如 HBsAg 的 a 决定簇, 也可用针对此决定的同一单抗分别包被固相和制备酶结合物 但在 HBsAg 的检测中应注意亚型问题,HBsAg 有 adr adw ayr ayw4 个亚型, 虽然每种亚型均有相同的 a 决定簇的反应性, 这也是用单抗作夹心法应注意的问题 双抗体夹心法测抗原的另一注意点是类风湿因子 (RF) 的干扰 RF 是一种自身抗体, 多为 IgM 型, 能和多种动物 IgG 的 Fc 段结合 用作双抗体夹心法检测的血清标本中如含有 RF, 它可充当抗原成份, 同时与固相抗体和酶标抗体结合, 表现出假阳性反应 采用 F(ab') 或 Fab 片段作酶结合物的试剂, 由于去除了 Fc 段, 从而消除 RF 的干扰 双抗体夹心法 ELISA 试剂是否受 RF 的影响, 已被列为这类试剂的一项考核指标 ( 参见 6.2) 双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子抗原, 但不适用于测定半抗原及小分子单价抗原, 因其不能形成两位点夹心 4
2.2 双抗原夹心法测抗体反应模式与双抗体夹心法类似 用特异性抗原进行包被和制备酶结合物, 以检测相应的抗体 与间接法测抗体的不同之处为以酶标抗原代替酶标抗抗体 此法中受检标本不需稀释, 可直接用于测定, 因此其敏感度相对高于间接法 乙肝标志物中抗 HBs 的检测常采用本法 本法关键在于酶标抗原的制备, 应根据抗原结构的不同, 寻找合适的标记方法 2.3 间接法测抗体 间接法是检测抗体常用的方法 其原理为利用酶标记的抗抗体 ( 抗人免疫球蛋白抗体 ) 以检测与固相抗原结合的受检抗体, 故称为间接法 ( 见图 2-3) 操作步骤如下: 1) 将特异性抗原与固相载体联结, 形成固相抗原 洗涤除去未结合的抗原及杂质 2) 加稀释的受检血清, 保温反应 血清中的特异抗体与固相抗原结合, 形成固相抗原抗体复合物 经洗涤后, 固相载体上只留下特异性抗体, 血清中的其他成份在洗涤过程中被洗去 3) 加酶标抗抗体 可用酶标抗人 Ig 以检测总抗体, 但一般多用酶标抗人 IgG 检测 IgG 抗体固相免疫复合物中的抗体与酶标抗体抗体结合, 从而间接地标记上酶 洗涤后, 固相载体上的酶量与标本中受检抗体的量正相关 4) 加底物显色本法主要用于对病原体抗体的检测而进行传染病的诊断 间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法 间接法成功的关键在于抗原的纯度 虽然有时用粗提抗原包被也能取得实际有效的结果, 但应尽可能予以纯化, 以提高试验的特异性 特别应注意除去能与一般健康人血清发生反应的杂质, 例如以 E.Coli 为工程酶的重组抗原, 如其中含有 E.Coli 成份, 很可能与受过 E.Coli 感染者血甭中的抗 E.Coli 抗体发生反应 抗原中也不能含有与酶标抗人 Ig 反应的物质, 例如来自人血浆或人体组织的抗原, 如不将其中的 Ig 去除, 试验中也发生假阳性反应 另外如抗原中含有无关蛋白, 也会因竟争吸附而影响包被效果 间接法中另一种干扰因素为正常血清中所含的高浓度的非特异性 病人血清中受检的特异性 IgG 只占总 IgG 中的一小部分 IgG 的吸附性很强, 非特异 IgG 可直接吸附到固相载体上, 有时也可吸附到包被抗原的表面 因此在间接法中, 抗原包被后一般用无关蛋白质 ( 例如牛血清蛋白 ) 再包被一次, 以封闭 (blocking) 固相上的空余间隙 另外, 在检测过程中标本须先行稀释 (1:40~1:200), 以避免过高的阴性本底影响结果的判断 5
当抗原材料中的干扰物质不易除去, 或不易得到足够的纯化抗原时, 可用此法检测特异性抗体 其原理为标本中的抗体和一定量的酶标抗体竞争与固相抗原结合 标本中抗体量越多, 结合在固相上的酶标抗体愈少, 因此阳性反应呈色浅于阴性反应 如抗原为高纯度的, 可直接包被固相 如抗原中会有干扰物质, 直接包被不易成功, 可采用捕获包被法, 即先包被与固相抗原相应的抗体, 然后加入抗原, 形成固相抗原 洗涤除去抗原中的杂质, 然后再加标本和酶标抗体进行竞争结合反应 竞争法测抗体有多种模式, 可将标本和酶标抗体与固相抗原竞争结合, 抗 HBc ELISA 一般采用此法 另一种模式为将标本与抗原一起加入到固相抗体中进行竞争结合, 洗涤后再加入酶标抗体, 与结合在固相上的抗原反应 抗 HBe 的检测一般采用此法 2.5 竞争法测抗原小分子抗原或半抗原因缺乏可作夹心法的两个以上的位点, 因此不能用双抗体夹心法进行测定, 可以采用竞争法模式 其原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合 标本中抗原量含量愈多, 结合在固相上的酶标抗原愈少, 最后的显色也愈浅 小分子激素 药物等 ELISA 测定多用此法 2.6 捕获包被法测抗体 IgM 抗体的检测用于传染病的早期诊断中 间接法 ELISA 一般仅适用于检测总抗体或 IgG 抗体 如用抗原包被的间接法直接测定 IgM 抗体, 因标本中一般同时存在较高浓度的 IgG 抗体, 后者将竞争结合固相抗原而使一部份 IgM 抗体不能结合到固相上 因此如用抗人 IgM 作为二抗, 间接测定 IgM 抗体, 必须先将标本用 A 蛋白或抗 IgG 抗体处理, 以除去 IgG 的干扰 在临床检验中测定抗体 IgM 时多采用捕获包被法 先用抗人 IgM 抗体包被固相, 以捕获血清标本中的 IgM( 其中包括针对抗原的特异性 IgM 抗体和非特异性的 IgM) 然后加入抗原, 此抗原仅与特异性 IgM 相结合 继而加酶标记针对抗原的特异性抗体 再与底物作用, 呈色即与标本中的 IgM 成正相关 此法常用于病毒性感染的早期诊断 甲型肝炎病毒 (HAV) 抗体的检测模式见图 2-7 类风湿因子 (RF) 同样能干扰捕获包被法测定 IgM 抗体, 导致假阳性反应 因此中和 IgG 的间接法近来颇受青睐, 用这类试剂检测抗 CMV IgGM 和抗弓形虫 IgM 抗体已获成功 2.7 ABS-ELISA 法 ABS 为亲和素 (avidin) 生物素 (biotin) 系统 (system) 的略语 亲和素是一种糖蛋白, 分子量 60000, 每个分子由 4 个能和生物素结合的亚基组成 生物素为小分子化合物, 分子量 244 用化学方法制成的衍生物素 - 羟基琥珀酰亚胺酯可与蛋白质和糖等多种类型的大小分子形成生物素标记产物, 标记方法颇为简便 生物素与亲和素的结合具有很强的特异性, 其亲和力较抗原抗体反应大得多, 两者一经结合就极为稳定 由于一个亲和素可与 4 个生物素分子结合, 因此如把 ABS 与 ELISA 法可分为酶标记亲和素 - 生物素 (LAB) 法和桥联亲和素 - 生物素 (ABC) 法两种类型 两者均以生物素标记的抗体 ( 或抗原 ) 代替原 ELISA 系统中的酶标抗体 ( 抗原 ) 在 LAB 中, 固相生物素先与不标记的亲和素反应, 然后再加酶标记的生物素以进一步提高敏感度 在早期, 亲和素从蛋清中提取, 这种卵亲和素为碱性糖蛋白, 与聚苯乙烯载体的吸附性很强, 用于 ELISA 中可使本底增高 从链霉菌中提取的链霉亲和素则无此点, 在 ELISA 应用中有替代前者的趋势 由于 ABS-ELISA 较普通 ELISA 多用了两种试剂, 增加了操作步骤, 在临床检验中 ABS-ELISA 应用不多 三 ELISA 的试剂在临床检验中一般采用商品试剂盒进行测定 前文 (2.2) 已述,ELISA 中有三个必要的试剂 : 免疫吸附剂 结合物和酶的底物 完整的 ELISA 试剂盒包含以下各组分 : 6
(1) 已包被抗原或抗体的固相载体 ( 免疫吸附剂 ); (2) 酶标记的抗原或抗体 ( 结合物 ); (3) 酶的底物 ; (4) 阴性对照品和阳性对照品 ( 定性测定中 ), 参考标准品和控制血清 ( 定量测定中 ); (5) 结合物及标本的稀释液 ; (6) 洗涤液 ; (7) 酶反应终止液 1 免疫吸附剂已包被抗原或抗体的固相载体在低温 (2~8 ) 干燥的条件下一般可保存 6 个月 有些不完整的试盒, 仅供应包被用抗原或抗体, 检测人员需自行包被 以下简述固相载体和包被过程 1.1 固相载体固相载体在 ELISA 测定过程中作为吸附剂和容器, 不参与化学反应 可作 ELISA 中载体的材料很多, 最常用的是聚苯乙烯 聚苯乙烯具有较强的吸附蛋白质的性能, 抗体或蛋白质抗原吸附其上后仍保留原来的免疫学活性, 加之它的价格低廉, 所以被普遍采用 聚苯乙烯为塑料, 可制成各种形式 ELISA 载体的形状主要有三种 : 微量滴定板 小珠和小试管 以微量滴定板最为常用, 专用于 EILSA 的产品称为 ELISA 板, 国际上标准的微量滴定板为 8 12 的 96 孔式 为便于作少量标本的检测, 有制成 8 联孔条或 12 联孔条的, 放入座架后, 大小与标准 ELISA 板相同 ELISA 板的特点是可以同时进行大量标本的检测, 并可在特制的比色计上迅速读出结果 现在已有多种自动化仪器用于微量滴定板型的 ELISA 检测, 包括加样 洗涤 保温 比色等步骤, 对操作的标准化极为有利 聚苯乙烯经射线照射后, 其吸附性能特别是对免疫球蛋白的吸附性能增加, 应用于双抗体夹心法可使固相上抗体量增多, 但用于间接法测抗体时空白值较大 良好的 ELISA 板应该是吸附性能好, 空白值低, 孔底透明度高, 各板之间 同一板各孔之间 同一板各孔之间性能相近 聚苯乙烯 ELISA 板由于原料的不同和制作工艺的差别, 各种产品的质量差异很大, 因此, 每一批号的 ELISA 板在使用前须事先检查其性能 常用的检查方法为 : 以一定浓度的人 IgG( 一般为 10ng/ml) 包被 ELISA 板各孔, 洗涤后每孔内加入适当稀释度的酶标抗人 IgG 抗体, 保温后洗涤, 加底物显色, 终止酶反应后, 分别测每孔溶液的吸光度 控制反应条件, 使各孔读数在吸光度 0.8 左右 计算全部读数的平均值 所有单个读数与全部读数的均数之差, 应小于 10% 与聚苯乙烯类似的塑料是聚氯乙烯 作为 ELISA 固相载体, 聚氯乙烯的特点为质软板薄, 可剪割, 价廉, 但光洁度不如聚苯乙烯板, 孔底亦不如聚苯乙烯平整 聚氯乙烯对蛋白质的吸附性能比聚苯乙烯高, 但空白值也略高 为比较不同固相在某一 ELISA 测定中的优劣, 可应用如下的试验 : 用其他免疫学测定方法选出一个典型的阳性标本和阴性标本, 将它们进行一系列稀释后, 在不同的固相载体上按预定的 ELISA 操作步骤进行测定, 然后比较结果 在哪一种载体上阳性结果与阴性结果差别最大, 这种载体就是这一 ELISA 测定项目的最合适的固相载体 在 ELISA 中, 用作固相载体的小珠一般为直径 0.6cm 的圆珠, 表面经磨砂处理后吸附面积大大增加 ELISA 板孔的吸附面积约为 200mm2, 小珠均为 1000mm2, 将近 ELISA 板孔的 5 倍 吸附面积的增大即意味着固相抗原或抗体量的增加 再者, 球型小珠的表面弧度更有利于吸附的抗原决定簇或抗体结合位点的暴露面处于最佳反应状态, 因此珠式 ELISA 的反应往往更为灵敏 小珠的另一特点是更易于使洗涤彻底, 使用特殊的洗涤器, 使小珠在洗涤过程中滚动淋洗, 其洗涤效果远较板孔的浸泡式为好 但由于磨砂工艺的难度较大, 小珠的均一性较差 小试管作为固相载体也有较大的吸附表面, 而且标本的反应量也相应增加 板式及珠式 ELISA 的标本量一般为 100-200ul, 而小试管可根据需要加大反应体积, 标本反应量的增加有助于试验敏感性的提高 小试管还可以当作比色杯, 最后直接放入分光光度计中比色 也有应用聚苯乙烯胶乳或其他材料制成的微粒作为 ELISA 固相载体的 其优点是表面积极大, 反应在悬液中进行, 其速率与液相反应近似 以含铁的磁性微粒作为 ELISA 固相载体, 反应后用磁铁的吸引进行分离, 洗涤方便, 试剂盒一般均配以特殊仪器 1.2 包被的方式 7
将抗原或抗体固定在过程称为包被 (coating) 换言之, 包被即是抗原或抗体结合到固相载体表面的过程 蛋白质与聚苯乙烯固相载体是通过物理吸附结合的, 靠的是蛋白质分子结构上的疏水基团与固相载体表面的疏水基团间的作用于 这种物理吸附是非特异性的, 受蛋白质的分子量 等电点 浓度等的影响 载体对不同蛋白质的吸附能力是不相同的, 大分子蛋白质较小分子蛋白质通常含有更多的疏水基团, 故更易吸附到固相载体表面 IgG 对聚苯乙烯等固相具有较强的吸附力, 其联结多发生在 Fc 段上, 抗体结合点暴露于外, 因此抗体的包被一般均采用直接吸附法 蛋白质抗原大多也可采用与抗体相似的方法包被 当抗原决定簇存在于或邻近于疏水区域时, 抗原与固相载体的直接吸附可使抗原决定簇不能充分暴露, 在这种情况下, 直接包被效果不佳, 可以采用间接的捕获包被法, 即先将针对该抗原的特异抗体作预包被, 其后通过抗原抗体反应使抗原固相化 此间接结合在固相上的抗原远离载体表面, 其抗原决定簇也得以充分暴露 间接包被的抗原经固相抗体的亲和层析作用, 包被在固相上的抗原纯度大大提高, 因此含杂质较多的抗原也可采用捕获包被法 ( 见 2.2.4), 试验的特异性 敏感性均由此得以改善, 重复性亦佳 间接包被的另一优点是抗原用量少, 仅为直接包被的 1/10 乃至于 /100 不易吸附在聚苯乙烯载体上的非蛋白质抗原可采用特殊的包被方式 例如, 在检测抗 DNA 抗体时, 需用 DNA 作为包被抗原, 而普遍的固相载体一般不能直接与核酸结合 可将聚苯乙烯板先经紫外线照射 ( 例如 30W 紫外灯,75cm 照射 12 小时 ), 以增加其吸附性能 固相载体先用碱性蛋白质, 如聚赖氨酸 鱼精蛋白等作预包被, 也可提高核酸的结合力 也可用亲和素生物素系统作间接包被, 即用亲和素先包被载体, 然后加入生物素化的 DNA, 这种包被方法均匀 牢固, 已扩大应用于各种抗原物质的定量测定 脂类物质无法与固相载体结合, 可将其在有机溶剂 ( 例如乙醇 ) 中溶解后加入 ELISA 板孔中, 开盖置冰箱过夜或冷风吹干, 待酒精挥发后, 让脂质自然干固在固相表面 抗心磷脂抗体的 ELISA 试剂一般采用这种包被方式 1.3 包被用抗原用于包被固相载体的抗原按其来源不同可分为天然抗原 重组抗原和合成多肽抗原三大类 天然抗原可取自动物组织 微生物培养物等, 须经提取纯化才能作包被用 如 HBsAg 可以从携带者的血清中提取, 一般的细菌和病毒抗原可以从其培养物中提取, 蛋白成份抗原可从富含此抗原的材料中提取等 ( 例如 AFP 从脐带血或胎肝中提取 ) 重组抗原是抗原基因在质粒体中表达的蛋白质抗原, 多以大肠杆菌或酵母菌为质粒体 重组抗原的优点是除工程菌成份外, 其他杂质少, 而且无传染性, 但纯化技术难度较大 以大肠杆菌为质粒体的重组抗原如不能充分除大肠杆菌成份, 用于 ELISA, 在反应中可出现假阳性, 因不少受检者受大肠杆菌感染而在血清中存在抗大肠杆菌抗体 重组抗原的另一特点是能用基因工程制备某些无法从天然材料中分离的抗原物质 例如丙型肝炎病毒 (HCV) 尚不能培养成功, 而且丙肝病人血清中 HCV 抗原含量极微 目前检测抗 HCV ELISA 中所用包被抗原大多为根据 HCV 的基因克隆表达而制备的重组抗原 在传染病诊断中, 不少重组抗原如 HBsAg HBeAg 和 HIV 抗原等均在 ELISA 中取得应用 合成多肽抗原是根据蛋白质抗原分子的某一抗原决定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段 多肽抗原一般只含有一个抗原决定簇, 纯度高, 特异性也高, 但由于分子量太小, 往往难于直接吸附于固相上 多肽抗原的包被一般需先使其与无关蛋白质如牛血清白蛋白质 (BSA) 等偶联, 借助于偶联物与固相载体的吸附, 间接地结合到固相载体表面 应用多肽抗原的另一注意点为他仅能检测与其相应的抗体 一种蛋白质抗原往往含有多个不同的能引起抗体产生的决定簇, 因此在受检血清中的其他抗体就不能与该多肽抗原发生反应 另外, 某些微生物发生变异时往往发生抗原结构变化, 在这种情况下, 用个别多肽抗原进行包被可引起其他抗体的漏检 1.4 包被用抗体包被固相载体的抗体应具有高亲和力和高特异性, 可取材于抗血清或含单克隆抗体的腹水或培养液 如免疫用抗原中含有杂质 ( 即便是极微量的 ), 在抗血清中将出现杂抗体, 必须除去 ( 可用吸收法 ) 后才能用于 ELISA, 以保证试验的特异性 抗血清不能直接用于包被, 应先提取 IgG, 通常采用硫酸铵盐析和 Sephadex 凝胶过滤法 一般经硫酸铵盐析粗提的 IgG 已可用于包被, 高度纯化的 IgG 性质不稳定 如需用高亲和力的抗体包被以提高试验的敏感性, 则可采用亲和层析法以除去抗血清中含量较多的非特异性 IgG 腹水中单抗的浓度较高, 特异性亦较强, 因此不需要作吸收和亲和层析处理, 一般可将腹水作适当稀释后直接包被, 必要时也可用纯化的 IgG 应用单抗包被时应注意, 一种单抗仅针对一种抗原决定簇, 在某些情 8
况下, 用多种单抗混合包被, 可取得更好的效果 1.5 包被的条件包被用抗原或抗体的浓度, 包被的温度和时间, 包被液的 ph 等应根据试验的特点和材料的性质而选定 抗体和蛋白质抗原一般采用 ph9.6 的碳酸盐缓冲液作为稀释液, 也有用 ph7.2 的磷酸盐缓冲液及 ph7~8 的 Tris-HCL 缓冲液作为稀释液的 通常在 ELISA 板孔中加入包被液后, 在 4-8 冰箱中放置过夜,37 中保温 2 小时被认为具有同等的包被效果 包被的最适当浓度随载体和包被物的性质可有很大的变化, 每批材料需通过实验与酶结合物的浓度协调选定 一般蛋白质的包被浓度为 100ng/ml-20ug/ml 1.6 封闭封闭 (blocking) 是继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程 抗原或抗体包被所用的浓度较低, 吸收后固相载体表面尚有未被占据的空隙, 封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙, 从而排斥在 ELISA 其后的步骤中干扰物质的再吸附 封闭的手续与包被相类似 最常用的封闭剂是 0.05%-0.5% 的牛血清白蛋白, 也有用 10% 的小牛血清或 1% 明胶作为封闭剂的 脱脂奶粉也是一种良好的封闭剂, 其最大的特点是价廉, 可以高浓度使用 (5%) 高质量的速溶食用低脂奶粉即可直接当作封闭剂使用, 但由于奶粉的成份复杂, 而且封闭后的载体不易长期保存, 因此在试剂盒的制备中较少应用 封闭是否必要, 取决于 ELISA 的模式及具体的实验条件 并非所有的 ELISA 固相均需封闭, 封闭不当反而会使阴性本底增高 一般说来, 双抗体夹心法, 只要酶标记物是高活性的, 操作时洗涤彻底, 不经封闭也可得到满意的结果 特别是用单抗腹水直接包被时, 因其中大量非抗体蛋白在包被时同样也吸附在固相表面, 业已起到了类似封闭剂的作用 但在间接法测定中, 封闭一般是不可少的 ( 见 2.2.2) 包被好的 ELISA 板干燥后放入密封袋或锡袋中, 在低温可保存数月 2 结合物结合物即酶标记的抗体 ( 或抗原 ), 是 ELISA 中最关键的试剂 良好的结合物应该是既保有酶的催化活性, 也保持了抗体 ( 或抗原 ) 的免疫活性 结合物中酶与抗体 ( 或抗原 ) 之间有恰当的分子比例, 在结合试剂中应尽量不含有或少含有游离的 ( 未结合的 ) 酶或游离的抗体 ( 或抗原 ) 此外, 结合物尚要有良好的稳定性 2.1 酶用于 ELISA 的酶应符合以下要求 : 纯度高, 催化反应的转化率高, 专一性强, 性质稳定, 来源丰富, 价格不贵, 制备成酶结合物后仍继续保留它的活性部分和催化能力 最好在受检标本中不存在相同的酶 另外, 它的相应底物易于制备和保存, 价格低廉, 有色产物易于测定等 在 ELISA 中, 常用的酶为辣根过氧化物酶 (horseradish peroxidase,hrp) 和碱性磷酸酶 (alkaline phosohatase,ap) 在少数商品 ELISA 试剂中, 应用的酶尚有葡萄糖氧化酶 βd- 半乳糖苷酶和脲酶等 国产 ELISA 试剂一般都用 HRP 制备结合物 HRP 是一种糖蛋白, 含糖量约为 18%, 分子量为 44000, 是一种复合酶, 由主酶 ( 酶蛋白 ) 和辅基 ( 亚铁血红素 ) 结合而成, 是一种卟啉蛋白质 主酶无色糖蛋白在 275nm 波长处有最高吸收峰, 辅基是深棕色的含铁卟啉环, 在 403nm 波长处有最高吸收峰 HRP 的纯度用 RZ(Reinheit Zahl, 德文, 意为纯度数 ) 表示, 是 403nm 的吸光度与 280nm 吸光度之比, 高纯度的 HRP 的 RZ?.0 HRP 除符合上述的 ELISA 中标记酶的要求外, 更有价格低廉和性质较稳定的特点 值得注意的是, 在选用酶制剂时, 除其纯度 RZ 外, 更应注意酶的活力 高纯度的酶如保存不当, 活力也会降低 酶制剂的活力以所含的酶活力单位表示, 可用对底物作用后生成产物量的测定进行试验 国外很多 ELISA 试剂采用碱性磷酸酶 (AP) 作为标记酶 常用的 AP 有两个来源, 分别从大肠杆菌和小牛肠膜中提取 不同来源的酶生化特性特性略不相同, 从大肠杆菌中提取的 AP 分子量为 80000, 酶作用的最适合 ph 为 8.0; 用小牛肠膜中提取的 AP 分子量为 100000, 最适 ph 为 9.6 在 ELISA 中,AP 系统的敏感度一般高于 HRP 系统, 空白值也较低, 但 AP 价格昂贵, 制备结合物所得率也较 HRP 低 2.2 抗原和抗体制备结合物时所用抗体一般均为纯度较高的 IgG, 以免在与酶联结时其他杂蛋白的干扰 最好用亲和层析纯的抗体, 这样全部酶结合物均具有特异的免疫活性, 可以在高稀释度进行反应, 实验结果本底浅淡 9
如用 F(ab')2 进行标记, 则更可避免标本中 RF 的干扰 在 ELISA 中用酶标抗原的模式不多, 总的要求是抗原必须是高纯度的 2.3 结合物的制备酶标记抗体的制备方法主要有两种, 即戊二醛交联法和过碘酸盐氧化法 (1) 戊二醛交联法 : 戊二醛是一种双功能团试剂, 它可以使酶与蛋白质的氨基通过它而联结 碱性磷酸一般用此法进行标记 交联方法一步法 两步法两种 在一步法中戊二醛直接加入酶与抗体的混合物中, 反应后即得酶标记抗体 ELISA 中常用的酶一般都用此法交联 它具有操作简便 有效 ( 结合率达 60%-70%) 和重复性好等优点 缺点是交联反应是随机的, 酶与抗体交联时分子间的比例不严格, 结合物的大小也不均一, 酶与酶, 抗体与抗体之间也有可能交联, 影响效果 在两步法中, 先将酶与戊二醛作用, 透析除去多余的戊二醛后, 再与抗体作用而形成酶标抗体 也可先将抗体与戊二醛作用, 再与酶联结 两步法的产物中绝大部分的酶与蛋白质是以 1:1 的比例结合的, 较一步法的酶结合物更有助于本底的改善以提高敏感度, 但其偶联的有效率较一步法低 (2) 过碘酸盐氧化法 : 本法只适用于含糖量较高的酶 辣根过氧化物酶的标记常用此法 反应时, 过碘酸钠将 HRP 分子表面的多糖氧化为醛基很活泼, 可与蛋白质上的氨基形成 Schiff 氏碱而结合 酶标记物按克分子比例联结, 其最佳比例为 : 酶 / 抗体 =1-2/1 此法简便有效, 一般认为是 HRP 最可取的标记方法, 但也有人认为所有试剂较为强烈, 各批实验结果不易重演 按以上方法制备的酶结合物一般都混有未结合物的酶和抗体 理论上, 结合物中混有的游离酶一般不影响 ELISA 中最后的酶活性测定, 因经过彻底洗涤, 游离酶可被除去, 并不影响最终的显色 但游离的抗体则不同, 它会与酶标抗体竞争相应的固相抗原, 从而减少了结合到固相上的酶标抗体的量 因此制备的酶结合物应予纯化, 去除游离的酶和抗体后用于检测, 效果更好 纯化的方法很多, 分离大分子化合物的方法均可应用 硫酸铵盐析法最为简便, 但效果并不理想, 因为此法只能去除留在上清中的游离酶, 但相当数量的游离抗体仍与酶结合物一起沉淀而不能分开 用离子交换层析或分子筛分离更为可取, 高效液相层析法可将制备的结合物清晰地分成三个部分 : 游离酶 游离抗体和纯结合物而取得最佳的分离效果, 但费用较贵 结合物制得后, 在用作 ELISA 试剂前尚需确定其适当的工作浓度 使用过浓的结合物, 既不经济, 又可使本底增高 ; 结合物的浓度过低, 则又影响检测的敏感性 所以必须对结合物的浓度予以选择 最适的工作浓度就是指结合物稀释至这一浓度时, 能维护一个低的本底, 并获得测定的最佳灵敏度, 达到最合适的测定条件和测定费用的节省 就酶标抗体本身而言, 它的有效工作浓度是指与其相应抗原包被的载体作试验时, 能得到阳性反应的最高稀释度 例如某一 HRP: 抗人 IgG 制剂标明的工作浓度为 1:5000, 表示该制剂经 1:5000 稀释后, 在与人 IgG 包被的固相作 ELISA 试验时, 将发生阳性反应 但在用于具体的 ELISA 检测中, 酶标抗体的最适工作浓度受到固相载体的性质 包被抗原或抗体的纯度以及整个检测系统如标本 反应温度和时间等的影响, 因此必须在实际测定条件下进行 " 滴配 " 选择能达到高敏感度的最大稀释度作为试剂盒中的工作浓度 2.4 结合物的保存酶标抗体中的酶和抗体均为生物活性物质, 保存不当, 极易失活 高浓度的结合物较为稳定, 冰冻干燥后可在普通冰箱中保存一年左右, 但冻干过程中引起活力的减低, 而且使用时需经复溶, 颇为不便 结合物溶液中加入等体积的甘油可在低温冰箱或普通冰箱的冰格中较长时间保存 早期的 ELISA 试剂盒中的结合物一般均按以上两种形式供应, 配以稀释液 ( 见 3.2.5) 临用时按标明的稀释度稀释成工作液 现在较先进的 ELISA 试剂盒均已用合适的缓冲液配成工作液, 使用时不需再行稀释, 在 4-8 保存期可达 6 个月 由于蛋白质浓度较低, 结合物易失活, 需加入蛋白保护剂 另外再加入抗生素 ( 例如庆大霉素 ) 和防腐剂 (HRP 结合物加硫柳泵,AP 结合物可加叠氮钠 ), 以防止细菌生长 2.5 结合物的稀释液用于稀释高浓度的结合物以配成工作液 为避免结合物在反应中直接吸附在固相载体上, 在稀释缓冲液中常加入高浓度的无关蛋白质 ( 例如 1% 牛血清白蛋白 ), 通过竞争以抑制结合物的吸附 一般还加入具有抑制蛋白质吸附于塑料表面的非离子型表面活性剂, 如吐温 20,0.05% 的浓度较为适宜, 高于 2% 时会洗掉 10
包被在固相上的抗原或抗体, 减低实验灵敏度 在间接测定抗体时, 血清标本需稀释后进行测定, 也可应用这种稀释液 3 酶的底物 3.1 HRP 的底物 HRP 浓度越高的地方 TMB 与 H2O2 反应的越多,TMB 供氢越多, 变色越深 HRP 催化过氧化物的氧化反应, 最具代表性的过氧化物为 H2O2, 其反应式如下 :DH2+ H2O2D+ H2O 上式中,DH2 为供氧体,H2O2 为受氢体 在 ELISA 中,DH2 一般为无色化合物, 经酶作用后成为有色的产物, 以便作比色测定 常用的供氢体有邻苯二胺 (O-phenylenediamine,OPD) 四甲基联苯胺 (3,3',5,5'-tetramethylbenzidine,TMB) 和 ABTS [2,2'-azino-di-(3-ethylbenziazobine sulfonate-6)] OPD 氧化后的产物呈橙红色, 用酸终止酶反应后, 在 492nm 处有最高吸收峰, 灵敏度高, 比色方便, 是 HRP 结合物最常用的底物 OPD 本身难溶于水,OPD 2HCL 为水溶性 曾有报道 OPD 有致异变性, 操作时应予注意 OPD 见光易变质, 与过氧化氢混合成底物应用液后更不稳定, 须现配置现用 在试剂盒中,OPD 和 H2O2 一般分成二组分,OPD 可制成一定量的粉剂或片剂形式, 片剂中含有发泡助溶剂, 使用更为方便 过氧化氢则配入底物缓冲液中, 有制成易保存的浓缩液, 使用时用蒸馏水稀释 先进的 ELISA 试剂盒中则直接配成含保护剂的工作浓度为 0.02% H2O2 的应用液, 只需加入 OPD 后即可作为底物应用液 TMB 经 HRP 作用后共产物显蓝色, 目视对比鲜明 TMB 性质较稳定, 可配成溶液试剂, 只需与 H2O2 溶液混和即成应用液, 可直接作底物使用 另外,TMB 又有无致癌性等优点, 因此在 ELISA 中应用日趋广泛 酶反应用 HCL 或 H2SO4 终止后,TMB 产物由蓝色呈黄色, 可在比色计中定量, 最适吸收波长为 405nm ABTS 虽不如 OPD 和 TMB 敏感, 但空白值极低, 也为一些试剂盒所采用 另一种 HRP 的底物为 3-(4- 羟基 ) 苯丙酸 [3-(4-hydroxy)phenly propionic acid,hppa], 经 HRP 作用后, 产物显荧光, 可用荧光光度计测量 用于 ELISA 的优点为可加宽定量测定的线性范围 酯酶, 一般采用对硝基苯磷酸酯 (p-nitrophenyl phosphate,p-npp) 作为底物, 可制成片剂, 使用方便 产物为黄色的对硝基酚, 在 405nm 波长处有吸收峰 用 NaOH 终止酶反应后, 黄色可稳定一时间 AP 也有发荧光底物 ( 磷酸 4- 甲基伞酮 ), 可用于 ELISA 作荧光测定, 敏感度较高于用显色底物的比色法 4 洗涤液在板式 ELISA 中, 常用的稀释液为含 0.05% 吐温 20 磷酸缓冲盐水 我们的为 2 的吐温 20+PBS=PBST 5 酶反应终止液常用的 HRP 反应终止液为硫酸, 其浓度按加量及比色液的最终体积而异, 在板式 ELISA 中一般采用 2mol/L 我们采用 TMB, 一般不用终止液, 肉眼观察, 大致估量 6 阳性对照品和阴性对照品阳性对照品 (positive control) 和阴性对照品 (negative control) 是检验试验有效性的控制品, 同时也作为判断结果的对照, 因此对照品, 特别是阳性对照品的基本组成应尽量与检测标本的组成相一致 以人血清为标本的测定, 对照品最好也为人血清, 因为正常人血清在各种 ELISA 模式中可产生不同程度的本底 由于大量正常人血甭较难得到, 国外试剂盒中的对照品多以复钙人血浆 (recalcified human plasma) 为原料, 即在血浆中加入钙离子, 使其中的纤维蛋白质凝固, 除去凝块后所得的液体, 其组成与血清相似 阴性对照品须先行检测, 确定其中不含待测物质 例如 HBsAg 检测的阴性对照品中不可含 HBsAg, 最好抗 HBs 也是阴性 阳性对照品多以含蛋白保护剂的缓冲液为基质, 其中加入一定量的待检物质, 此量最好在试剂说明书中标明 加入的量应与试剂的敏感度相称, 在测定中得到的吸光值与受检标本吸光值比较, 可对标本中受检物质的量有一个粗略的估计 国外检测 HBsAg 的 ELISA 试剂盒检测敏感度约为 0.5ng/ml, 阳性对照品中含量约 10ng/ml 在对照品中一般加入抗生素和防腐剂, 以利保存 7 参考标准品定量测定的 ELISA 试剂盒 ( 例如甲胎蛋白质癌胚抗原测定等 ) 应含有制作标准曲线用的参考标准品, 应包括覆盖可检测范围的 4-5 个浓度, 一般均配入含蛋白保护剂及防腐剂的缓冲液中 11
四 ELISA 的操作要点优质的试剂, 良好的仪器和正确的操作是保证 ELISA 检测结果准确可靠的必要条件 ELISA 的操作因固相载体的形成不同而有所差异, 国内医学检验一般均用板式点 本文将叙述板式 ELISA 各个操作步骤的注意要点, 珠式 管式及磁性球 ELSIA, 国外试剂均与特殊仪器配合应用, 两者均有详细的使用说明, 严格遵照规定操作, 必能得出准确的结果 1 标本的采取和保存可用作 ELISA 测定的标本十分广泛, 体液 ( 如血清 ) 分泌物( 唾液 ) 和排泄物 ( 如尿液 粪便 ) 等均可作标本以测定其中某种抗体或抗原成份 有些标本可直接进行测定 ( 如血清 尿液 ), 有些则需经预处理 ( 如粪便和某些分泌物 ) 大部分 ELISA 检测均以血清为标本 血浆中除尚含有纤维蛋白原和抗凝剂外, 其他成份均同等于血清 制备血浆标本需借助于抗凝剂, 而血清标本只要待血清自然凝固 血块收缩后即可取得 除特殊情况外, 在医学检验中均以血清作为检测标本 在 ELISA 中血浆和血清可同等应用 血清标本可按常规方法采集, 应注意避免溶血, 红细胞溶解时会释放出具有过氧化物酶活性的物质, 以 HRP 为标记的 ELISA 测定中, 溶血标本可能会增加非特异性显色 血清标本宜在新鲜时检测 如有细菌污染, 菌体中可能含有内源性 HRP, 也会产生假阳性反应 如在冰箱中保存过久, 其中的可发生聚合, 在间接法 ELISA 中可使本底加深 一般说来, 在 5 天内测定的血清标本可放置于 4, 超过一周测定的需低温冰存 冻结血清融解后, 蛋白质局部浓缩, 分布不均, 应充分混匀宜轻缓, 避免气泡, 可上下颠倒混和, 不要在混匀器上强烈振荡 混浊或有沉淀的血清标本应先离心或过滤, 澄清后再检测 反复冻融会使抗体效价跌落, 所以测抗体的血清标本如需保存作多次检测, 宜少量分装冰存 保存血清自采集时就应注意无菌操作, 也可加入适当防腐剂 ( 见 3.2.4) 2 试剂的准备按试剂盒说明书的要求准备实验中需用的试剂 ELISA 中用的蒸馏水或去离子水, 包括用于洗涤的, 应为新鲜的和高质量的 自配的缓冲液应用 ph 计测量较正 从冰箱中取出的试验用试剂应待温度与室温平衡后使用 试剂盒中本次试验不需用的部分应及时放回冰箱保存 3 加样在 ELISA 中一般有 3 次加样步聚, 即加标本, 加酶结合物, 加底物 加样时应将所加物加在 LEISA 板孔的底部, 避免加在孔壁上部, 并注意不可溅出, 不可产生气泡 加标本一般用微量加样器, 按规定的量加入板孔中 每次加标本应更换吸嘴, 以免发生交叉污染, 也可用一次性的定量塑料管加样 有此测定 ( 如间接法 ELISA) 需用稀释的血清, 可在试管中按规定的稀释度稀释后再加样 也可在板孔中加入稀释液, 再在其中加入血清标本, 然后在微型震荡器上震荡 1 分钟以保证混和 加酶结合物应用液和底物应用液时可用定量多道加液器, 使加液过程迅速完成 4 保温在 ELISA 中一般有两次抗原抗体反应, 即加标本和加酶结合物后 抗原抗体反应的完成需要有一定的温度和时间, 这一保温过程称为温育 (incubation), 有人称之为孵育, 在 ELISA 中似不恰当 ELISA 属固相免疫测定, 抗原 抗体的结合只在固相表面上发生 以抗体包被的夹心法为例, 加入板孔中的标本, 其中的抗原并不是都有均等的和固相抗结合的机会, 只有最贴近孔壁的一层溶液中的抗原直接与抗体接触 这是一个逐步平衡的过程, 因此需经扩散才能达到反应的终点 在其后加入的酶标记抗体与固相抗原的结合也同样如此 这就是为什么 ELISA 反应总是需要一定时间的温育 温育常采用的温度有 43 37 室温和 4 ( 冰箱温度 ) 等 37 是实验室中常用的保温温度, 也是大多数抗原抗体结合的合适温度 在建立 ELISA 方法作反应动力学研究时, 实验表明, 两次抗原抗体反应一般在 37 经 1-2 小时, 产物的生成可达顶峰 为加速反应, 可提高反应的温度, 有些试验在 43 进行, 但不宜采用更高的温度 抗原抗体反应 4 更为彻底, 在放射免疫测定中多使反应在冰箱中过夜, 以形成最多的沉淀 但因所需时间太长, 在 ELISA 中一般不予采用 保温的方式除有的 ELISA 仪器附有特制的电热块外, 一般均采用水浴, 可将 ELISA 板置于水浴箱中, ELISA 板底应贴着水面, 使温度迅速平衡 为避免蒸发, 板上应加盖, 也可用塑料贴封纸或保鲜膜覆盖板 12
孔, 此时可让反应板漂浮在水面上 若用保温箱,ELISA 板应放在湿盒内, 湿盒要选用传热性良好的材料如金属等, 在盒底垫湿的纱布, 最后将 ELISA 板放在湿纱布上 湿盒应先放在保温箱中预温至规定的温度, 特别是在气温较低的时候更应如此 无论是水浴还是湿盒温育, 反应板均不宜叠放, 以保证各板的温度都能迅速平衡 室温温育的反应, 操作时的室温应严格限制在规定的范围内, 标准室温温度是指 20-25, 但具体操作时可根据说明书的要求控制温育 室温温育时,ELISA 板只要平置于操作台上即可 应注意温育的温度和时间应按规定力求准确 为保证这一点, 一个人操作时, 一次不宜多于两块板同时测定 5 洗涤洗涤在 ELISA 过程中虽不是一个反应步骤, 但却也决定着实验的成败 ELSIA 就是靠洗涤来达到分离游离的和结合的酶标记物的目的 通过洗涤以清除残留在板孔中没能与固相抗原或抗体结合的物质, 以及在反应过程中非特异性地吸附于固相载体的干扰物质 聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的, 而在洗涤时又应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来 可以说在 ELISA 操作中, 洗涤是最主要的关键技术, 应引起操作者的高度重视, 操作者应严格按要求洗涤, 不得马虎 洗涤的方式除某些 ELISA 仪器配有特殊的自动洗涤仪外, 手工操作有浸泡式和流水冲洗式两种, 过程如下 : (1) 浸泡式 a. 吸干或甩干孔内反应液 ;b. 用洗涤液过洗一遍 ( 将洗涤液注满板孔后, 即甩去 );c. 浸泡, 即将洗涤液注满板孔, 放置 1-2 分钟, 间歇摇动, 浸泡时间不可随意缩短 ;d. 吸干孔内液体 吸干应彻底, 可用水泵或真空泵抽吸, 也可甩去液体后在清洁毛巾或吸水纸上拍干 ;e. 重复操作 c 和 d, 洗涤 3-4 次 ( 或按说明规定 ) 在间接法中如本底较高, 可增加洗涤次数或延长浸泡时间 微量滴定板多采用浸泡式洗涤法 洗涤液多为含非离子型洗涤剂的中性缓冲液 聚苯乙烯载体与蛋白质的结合是疏水性的, 非离子型洗涤剂既含疏水基团, 也含亲水基团, 其疏水基团与蛋白质的疏水基团借疏水键结合, 从而削弱蛋白质与固相载体的结合, 并借助于亲水基团和水分子的结合作用, 使蛋白质回复到水溶液状态, 从而脱离固相载体 洗涤液中的非离子型洗涤剂一般是吐温 20, 其浓度可在 0.05%-0.2% 之间, 高于 0.2% 时, 可使包被在固相上的抗原或抗体解吸附而减低试验的灵敏度 (2) 流水冲洗式流水冲洗法最初用于小珠载体的洗涤, 洗涤液仅为蒸馏水甚至可用自来水 洗涤时附接一特殊装置, 使小珠在流水冲击下不断地滚动淋洗, 持续冲洗 2 分钟后, 吸干液体, 再用蒸馏水浸泡 2 分钟, 吸干即可 浸泡式犹如盆浴, 流水冲洗式则好比淋浴, 其洗涤效果更为彻底, 且也简便 快速 已有实验表明, 流水冲洗式同样也适用于微量滴定板的洗涤 洗涤时设法加大水流量或加大水压, 让水流冲击板孔表面, 洗涤效果更佳 6 显色和比色 6.1 显色显色是 ELISA 中的最后一步温育反应, 此时酶催化无色的底物生成有色的产物 反应的温度和时间仍是影响显色的因素 在一定时间内, 阴性孔可保持无色, 而阳性孔则随时间的延长而呈色加强 适当提高温度有助于加速显色进行 在定量测定中, 加入底物后的反应温度和时间应按规定力求准确 定性测定的显色可在室温进行, 时间一般不需要严格控制, 有时可根据阳性对照孔和阴性对照孔的显色情况适当缩短或延长反应时间, 及时判断 OPD 底物显色一般在室外温或 37 反应 20-30 分钟后即不再加深, 再延长反应时间, 可使本底值增高 OPD 底物液受光照会自行变色, 显色反应应避光进行, 显色反应结束时加入终止液终止反应 OPD 产物用硫酸终止后, 显色由橙黄色转向棕黄色 TMB 受光照的影响不大, 可在室温中置于操作台上, 边反应观察结果 但为保证实验结果的稳定性, 宜在规定的适当时间阅读结果 TMB 经 HRP 作用后, 约 40 分钟显色达顶峰, 随即逐渐减弱, 至 2 小时后即可完全消退至无色 TMB 的终止液有多种, 叠氮钠和十二烷基硫酸钠 (SDS) 等酶抑制剂均可使反应终止 这类终止剂尚能使蓝色维持较长时间 (12-24 小时 ) 不褪, 是目视判断的良好终止剂 此外, 各类酸性终止液则会使蓝色转变成黄色, 此时可用特定的波长 (450nm) 测读吸光值 6.2 比色比色前应先用洁净的吸水纸拭干板底附着的液体, 然后将板正确放入酶标比色仪的比色架中 以软板 13
为载体的试验, 需先将板置于标准 96 孔的座架中, 才可进行比色 最好在加底物液显色前, 先将软板边缘剪净, 这样, 此板就可完全平妥坐入座架中 比色时应先以蒸馏水校零点, 测读底物孔 ( 未经任何反应仅加底物液的孔 ) 和空白孔 ( 以生理盐水或稀释液代替标本作全过程的孔 ), 以记录本次试验的试剂状况 其后可用空白孔以蒸馏水校零点, 以上各孔的吸光度需减去空白孔的吸光度, 然后进行计算 比色结果的表达以往通用光密度 (oplical density,od), 现按规定用吸光度 (absorbence,a), 两者含义相同 通常的表示方法是, 将吸收波长写于 A 字母的右下角, 如 OPD 的吸收波长为 492nm, 表示方法为 "A492nm" 或 "OD492nm" 6.3 酶标比色仪酶标比色仪简称酶标仪, 通常指专用于测读 ELISA 结果吸光度的光度计 针对固相载体形式的不同, 各有特制的适用于板 珠和小试管的设计 许多试剂公司配套供应酶标仪 酶标仪的主要性能指标有 : 测读速度 读数的准确性 重复性 精确度和可测范围 线性等等 优良的酶标仪的读数一般可精确到 0.001, 准确性为 ±1%, 重复性达 0.5% 举例说, 若某孔测得的 A 值为 1.083, 则该孔相对于空气的真实 A 值应为 1.083 ±0.01(1.073~1.093), 重复测定数次, 其 A 值均应 1.083±0.05(1.078~1.088) 在之间 酶标仪的可测范围视各酶标仪的性能而不同 普通的酶标仪在 0.000~2.000, 新型号的酶标仪上限拓宽达 2.900, 甚至更高 超出可测上限的 A 值常以 "*" 或 "over" 或其它符号表示 应注意可测范围与线性范围的不同, 线性范围常小于可测范围, 比如某一酶标仪的可测范围为 0.000~2.900, 而其线性范围仅 0.000~2.000, 这在定量 ELISA 中制作标准曲线时应予注意 酶标仪不应安置在阳光或强光照射下, 操作时室温宜在 15~30, 使用前先预热仪器 15-30 分钟, 测读结果更稳定 测读 A 值时, 要选用产物的敏感吸收峰, 如 OPD 用 492nm 波长 有的酶标仪可用双波长式测读, 即每孔先后测读两次, 第一次在最适波长 (W1), 第二次在不敏感波长 (W2), 两次测定间不移动 ELISA 板的位置 例如 OPD 用 492nm 为 W1,630nm 为 W2, 最终测得的 A 值为两者之差 (W1-W2) 双波长式测读可减少由容器上的划痕或指印等造成的光干扰 各种酶标仪性能有所不同, 使用中应详细新闻记者说明书 7 结果判断 7.1 定性测定定性测定的结果判断是对受检标本中是否含有待测抗原或抗体作出 " 有 " 或 " 无 " 的简单回答, 分别用 " 阳性 " " 阴性 " 表示 " 阳性 " 表示该标本在该测定系统中有反应 " 阴性 " 则为无反应 用定性判断法也可得到半定量结果, 即用滴度来表示反应的强度, 其实质仍是一个定性试验 在这种半定量测定中, 将标本作一系列稀释后进行试验, 呈阳性反应的最高稀释度即为滴度 根据滴度的高低, 可以判断标本反应性的强弱, 这比观察不稀释标本呈色的深浅判断为强阳性 弱阳性更具定量意义 在间接法和夹心法 ELSIA 中, 阳性孔呈色深于阴性孔 在竞争法 ELISA 中则相反, 阴性孔呈色深于阳性孔 两类反应的结果判断方法不同, 分述于下 (1) 间接法和夹心法这类反应的定性结果可以用肉眼判断 目视标本也无色或近于无色者判为阴性, 显色清晰者为阳性 但在 ELSIA 中, 正常人血清反应后常可出现呈色的本底, 此本底的深浅因试剂的组成和实验的条件不同而异, 因此实验中必须加测阴性对照 阴性对照的组成应为不含受检物的正常血清或类似物 ( 见 3.6) 在用肉眼判断结果时, 更宜用显色深于阴性对照作为标本阳性的指标 目视法简捷明了, 但颇具主观性 在条件许可下, 应该用比色计测定吸光值, 这样可以得到客观的数据 先读出标本 (sample,s) 阳性对照(P) 和阴性对照(N) 的吸光值, 然后进行计算 计算方法有多种, 大致可分为阳性判定值法和标本与阴性对照比值法两类 a. 阳性判定值阳性判定值 (cut-off value) 一般为阴性对照 A 值加上一个特定的常数, 以此作为判断结果阳性或阴性的标准 用此法判断结果要求实验条件十分恒定, 试剂的制备必须标准化, 阳性和阴性的对照品应符合一定的规格, 须配用精密的仪器, 并严格按规定操作 阳性判定值公式中的常数是在这特定的系统中通过对大量 14
标本的实验检测而得到的 现举某种检测 HBsAg 的试剂盒为例 试剂盒中的阴性对照品为不含 HBsAg 的复钙人血浆, 阳性对照品 HBsAg 的含量标明为 P=9±2ng/ml 每次试验设 2 个阳性对照和 3 个阴性对照 测得 A 值后, 先计算阴性对照 A 值的平均数 (NCX) 和阳性对照 A 值的平均数 (PCX), 两个平均数的差 (P-N) 必须大于一个特定的数值 ( 例 0.400), 试验才有效 3 个阴性对照 A 值均应 0.5 NCX, 并 1.5 NCX, 如其中之一超出此范围, 则弃去, 而已另两个阴性对照重新计算 NCX; 如有两个阴性对照 A 值超出以上范围, 则该次实验无效 阳性判定值按下式计算 : 阳性判定值 =NCX+0.05 标本 A 值 > 阳性判定值的为阳性, 小于阳性判定值的为阴性 应注意的是, 式中 0.05 为该试剂盒的常数, 只适合于该特定条件下, 而不是对各种试剂均可通用 根据以上叙述可以看出, 在这种方法中阴性对照和阳性对照也起到试验的质控作用, 试剂变质和操作不当均会产生 " 试验无效 " 的后果 b. 标本 / 阴性对照比值在实验条件 ( 包括试剂 ) 较难保证恒定的情况下, 这种判断法较为合适 在得出标本 (S) 和阴性对照 (N) 的 A 值后, 计算 S/N 值 也有写作 P/N 的, 这里的 P 不代表阳性 (positive), 而是病人 (patient) 的缩写, 不应误解 为避免混淆, 更宜用 S/N 表示 在早期的间接法 ELISA 中, 有些作者定出 S/N 为阳性标准, 现多为各种测定所沿用 实际上每一测定系统应该用实验求出各自的 S/N 的阈值 更应注意的是,N 所代表的阴性对照是不含受检物质的人血清 有的试剂盒中所设阴性对照为不含蛋白质或蛋白质含量较底的缓冲液, 以致反应后产生的本底可能较正常人血清的本底低得多 因此, 这类试剂盒规, 如 N<0.05( 或其他数值 ), 则按 0.05 计算, 否则将出现假阳性结果 (2) 竞争法在竞争法 ELISA 中, 阴性孔呈色深于阳性孔 阴性呈色的强度取决于反应中酶结合物的浓度和加入竞争抑制物的量, 一般调节阴性对照的吸光度在 1.0-1.5 之间, 此时反应最为敏感 竞争法 ELISA 不易用自视判断结果, 因肉眼很难辨别弱阳性反应与阴性对照的显色差异, 一般均用比色计测定, 读出 S P 和 N 的吸光值 计算方法主要也有两种, 即阳性判定值法和抑制率法 a. 阳性判定值法与间接法和夹心法中的阳性判定值法基本相同, 但在计算公式中引入阳性对照 A 值, 现举某种检测抗 HBc 的试剂盒为例 试剂盒中的阴性对照为不含抗 HBc 的复钙人血浆, 阳性对照中抗 HBc 含量为 125±100u/ml 每次试验设 2 个阳性对照和 3 个阴性对照 测得 A 值后, 先计算阴性对照 A 值的平均值 (NCX) 和阳性对照 A 值的平均数 (PCX), 两个平均数的差 (N-P) 必须大于一个特定的数值 ( 例如 0.300), 试验才有效 3 个阴性对照 A 值均应小于 2.000, 而且应 0.5 NCX 并 1.5 NCX, 如其中之一超出此范围, 则弃去, 而以另 2 个阴性对照重新计算 NCX; 如有 2 个阴性对照 A 超出以上范围, 则该次实验无效 阳性判定值按下式计算 : 阴性判定值 =0.4 NCX+0.6 PCX 标本 A 值 阳性判定值的反应为阳性,A> 阳性判定值的反应为阴性 b. 抑制率法抑制率表示标本在竞争结合中标本对阴性反应显色的抑制程度, 按下式计算 : 抑制率 (%)= ( 阴性对照 A 值 - 标本 A 值 ) 100%/ 阴性对照 A 值一般规定抑制率 50% 为阳性,<50% 为阴性 7.2 定量测定 ELSIA 操作步骤复杂, 影响反应因素较多, 特别是固相载体的包被难达到各个体之间的一致, 因此在定量测定中, 每批测试均须用一系列不同浓度的参考标准品在相同的条件下制作标准曲线 测定大分子量物质的夹心法 ELISA, 标准曲线的范围一般较宽, 曲线最高点的吸光度可接近 2.0, 绘制时常用半对数纸, 以检测物的浓度为横坐标, 以吸光度为纵坐标, 各浓度的值逐点连接, 所得曲线一般呈 S 形, 其头 尾部曲线趋于平坦, 中央较呈直线的分是最理想的检测区域 甲胎蛋白质 ELISA 测定的标准曲线示例见图 4-1 测定小分子量物质常用竞争法 ( 参见 2.2), 其标准曲线中吸光度与受检物质的浓度呈负相关 标准曲线的形状因试剂盒所用模式的差别而略有不同 ELISA 测定的标准曲线示例见图 4-2 注意图中横坐标为对数关系, 这更有利于测定系统的表达 15