EK-Bioscience

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1 EK-Bioscience Biotechnology Co., Ltd. Shanghai enzyme research This kit is for in vitro research use, not for clinical diagnosis! ( 本试剂盒仅供体外研究使用, 不用于临床诊断!) 小鼠神经营养因子 4(NT-4) 酶联免疫分析试剂盒 Mouse(NT- )ELISA Kit CAS.NO:Ek-M20822 声明 : 尊敬的客户, 感谢您选用本公司的产品 本试剂盒用于测定小鼠血清 血浆及相 关液体样本中神经营养因子 4(NT-4) 含量 使用前请仔细阅读说明书并检查试剂组分! 如有 疑问, 请及时联系我们 试剂盒组成 : 中文名称 English name 96T/48T 含量 保存 ELISA 酶标板 ( 可拆卸 ) Microelisa stripplate 8 12 / 8 6 * 2-8 标准品 (160 ng/l) Standard 1 瓶 0.5ml * 2-8 标准品稀释液 Standard diluent 1 瓶 1.5ml * 2-8 酶标试剂 HRP-Conjugate reagent 1 瓶 6 ml/3ml * 2-8 样品稀释液 Sample diluent 1 瓶 6 ml/3ml * 2-8 显色剂 A 液 Chromogen Solution A 1 瓶 6 ml/3ml * 2-8 显色剂 B 液 Chromogen Solution B 1 瓶 6 ml/3ml * 2-8 终止液 Stop Solution 1 瓶 6 ml/3ml * 2-8 浓缩洗涤液 wash solution 1 瓶 20ml * 2-8 说明书 Instruction 1 份 * 封板膜 Closure plate membrane 2 片 * 密封袋 Sealed bags 1 个 * 实验原理本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中小鼠神经营养因子 4(NT-4) 水平 用纯化的小鼠神经营养因子 4(NT-4) 抗体包被微孔板, 制成固相抗体, 往包被单抗的微孔中依次加入神经营养因子 4(NT-4), 再与 HRP 标记的神经营养因子 4(NT-4) 抗体结合, 形成抗体 - 抗原 - 酶标抗体复合物, 经过彻底洗涤后加底物 TMB 显色 TMB 在 HRP 酶的催化下转化成蓝色, 并在酸的作用下转化成最终的黄色 颜色的深浅和样品中的神经营养因子 4(NT-4) 呈正相关

2 用酶标仪在 450nm 波长下测定吸光度 (OD 值 ), 通过标准曲线计算样品中小鼠神经营养因 子 4(NT-4) 浓度 标本要求 1. 血清 : 室温血液自然凝固 分钟后, 离心 20 分钟左右 ( 转 / 分 ) 仔细收集上清 保存过程中如有沉淀形成, 应再次离心 2. 血浆 : 应根据标本的要求选择 EDTA 柠檬酸钠或肝素作为抗凝剂, 混合 分钟后, 离心 20 分钟左右 ( 转 / 分 ) 仔细收集上清 保存过程中如有沉淀形成应再次离心 3. 尿液 : 用无菌管收集 离心 20 分钟左右 ( 转 / 分 ) 仔细收集上清 保存过程中如有沉淀形成, 应再次离心 胸腹水 脑脊液参照此实行 4. 细胞培养上清 : 检测分泌性的成份时, 用无菌管收集 离心 20 分钟左右 ( 转 / 分 ) 仔细收集上清 5. 培养细胞 : 检测细胞内的成份时, 用 PBS(PH ) 稀释细胞悬液, 细胞浓度达到 100 万 /ml 左右 通过反复冻融或加入组织蛋白萃取试剂, 以使细胞破坏并放出细胞内成份 离心 20 分钟左右 ( 转 / 分 ) 仔细收集上清 保存过程中如有沉淀形成, 应再次离心 6. 组织标本 : 切割标本后, 称取重量 加入一定量的 PBS,PH7.4 用液氮迅速冷冻保存备用 标本融化后仍然保持 2-8 的温度 加入一定量的 PBS(PH7.4), 或组织蛋白萃取试剂, 用手工或匀浆器将标本匀浆化 离心 20 分钟左右 ( 转 / 分 ) 仔细收集上清 分装后一份待检测, 其余冷冻备用 7. 标本采集后尽早进行提取, 提取按相关文献进行, 提取后应尽快进行实验 若不能马上进行试验, 可将标本放于 -20 保存, 但应避免反复冻融 8. 不能检测含 NaN3 的样品, 因 NaN3 抑制辣根过氧化物酶的 (HRP) 活性 试验所需自备物品 : 1. 酶标仪 (450nm 波长滤光片 ) 2. 高精度移液器,EP 管及一次性吸头 恒温箱, 双蒸水或去离子水 4. 吸水纸 操作步骤 1. 标准品的稀释 : 本试剂盒提供原倍标准品一支, 用户可按照下列图表在小试管中进行稀 释 80ng/L 5 号标准品 150μl 的原倍标准品加入 150μl 标准品稀释液 40ng/L 4 号标准品 150μl 的 5 号标准品加入 150μl 标准品稀释液 20ng/L 3 号标准品 150μl 的 4 号标准品加入 150μl 标准品稀释液 10ng/L 2 号标准品 150μl 的 3 号标准品加入 150μl 标准品稀释液 5ng/L 1 号标准品 150μl 的 2 号标准品加入 150μl 标准品稀释液 2. 加样 : 分别设空白孔 ( 空白对照孔不加样品及酶标试剂, 其余各步操作相同 ) 标准孔 待测样品孔 在酶标包被板上标准品准确加样 50μl, 待测样品孔中先加样品稀释液 40μl, 然后再加待测样品 10μl( 样品最终稀释度为 5 倍 ) 加样将样品加于酶标板孔底部, 尽 量不触及孔壁, 轻轻晃动混匀 第 2 页共 5 页

3 3. 温育 : 用封板膜封板后置 37 温育 30 分钟 4. 配液 : 将 30 倍 (48T 的 20 倍 ) 浓缩洗涤液用蒸馏水 30 倍稀释后备用 5. 洗涤 : 小心揭掉封板膜, 弃去液体, 甩干, 每孔加满洗涤液, 静置 30 秒后弃去, 如此 重复 5 次, 拍干 6. 加酶 : 每孔加入酶标试剂 50μl, 空白孔除外 7. 温育 : 用封板膜封板后置 37 温育 30 分钟 8. 洗涤 : 小心揭掉封板膜, 弃去液体, 甩干, 每孔加满洗涤液, 静置 30 秒后弃去, 如此 重复 5 次, 拍干 9. 显色 : 每孔先加入显色剂 A50μl, 再加入显色剂 B50μl, 轻轻震荡混匀,37 避光显色 10 分钟. 10. 终止 : 每孔加终止液 50μl, 终止反应 ( 此时蓝色立转黄色 ) 11. 测定 : 以空白空调零,450nm 波长依序测量各孔的吸光度 (OD 值 ) 测定应在加终 止液后 15 分钟以内进行 操作程序总结 : 计算 以标准物的浓度为横坐标,OD 值为纵坐标, 在坐标纸上绘出标准曲线, 根据样品的 OD 值由标准曲线查出相应的浓度 ; 再乘以稀释倍数 ; 或用标准物的浓度与 OD 值计算出标 准曲线的直线回归方程式, 将样品的 OD 值代入方程式, 计算出样品浓度, 再乘以稀释倍数, 即为样品的实际浓度 第 3 页共 5 页

4 注意事项 1. 试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡 分钟后方可使用, 酶标包被板开封后如未用完, 板条应装入密封袋中保存 2. 浓洗涤液可能会有结晶析出, 稀释时可在水浴中加温助溶, 洗涤时不影响结果 3. 各步加样均应使用加样器, 并经常校对其准确性, 以避免试验误差 一次加样时间最好控制在 5 分钟内, 如标本数量多, 推荐使用排枪加样 4. 请每次测定的同时做标准曲线, 最好做复孔 如标本中待测物质含量过高 ( 样本 OD 值大于标准品孔第一孔的 OD 值 ), 请先用样品稀释液稀释一定倍数 (n 倍 ) 后再测定, 计算时请最后乘以总稀释倍数 ( n 5) 5. 封板膜只限一次性使用, 以避免交叉污染 6. 底物请避光保存 7. 严格按照说明书的操作进行, 试验结果判定必须以酶标仪读数为准. 8. 所有样品, 洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理 9. 本试剂不同批号组分不得混用 实验目的 灵敏度 检测范围和重复性 : 实验目的 : 测定小鼠血清 血浆及相关液体样本中神经营养因子 4(NT-4) 含量 灵敏度 : 最小可测 1.2ng/L 检测范围 2ng/L -80 ng/l 重复性 : 板内, 板间变异系数均 <10% 问题分析 若实验效果不好, 请及时对显色结果拍照, 保留所用板条及未使用试剂, 并妥善保存, 然后联系我公司技术支持为您解决问题 同时您也可以参考以下资料 : 问题描述可能原因相应对策 标准曲线梯 度差 显色很弱或 无色 吸液或加液不准 标准品稀释不正确 洗涤不完全 孵育时间太短 实验温度不正确 试剂体积不够或漏加 稀释不正确 检查移液器及吸头 溶解标准品稍微旋转瓶身, 轻轻混匀使粉末完全溶解 保证洗涤时间和洗涤次数及每孔的加液量 保证充足的孵育时间 使用推荐的实验温度 检查吸液及加液过程, 保证所有试剂按顺序足量添加 读数数值低酶标仪设置不正确在酶标仪上检查波长及滤光片设置 提前打开酶标仪预热 变异系数大加液不正确检查加液情况 背景值高 检测抗体的工作浓度 酶标板洗涤不完全 洗液有污染 使用推荐的稀释倍数 重新阅读操作手册, 保证清洗完全 ; 如果用自动洗板 机, 请检查所有的出口是否有堵塞 配制新鲜的洗液 灵敏度低 ELISA 试剂盒保存按说明书要求保存相关试剂 读数前未终止 OD 读数前应在每孔中加入终止液 第 4 页共 5 页

5 声明 1. 限于现有条件及科学技术水平, 尚不能对所有原料进行全面的鉴定分析, 本产品可能存在一定的质量技术风险 2. 最终的实验结果与试剂的有效性 实验者的相关操作以及当时的实验环境密切相关, 请务必准备充足的待测样品 3. 只有全部使用试剂盒内的试剂才能保证检测效果, 不能混用其他制造商的产品 只有严格遵守本实验说明才会得到最佳的检测结果 4. 有效期 :6 个月 使用前请仔细阅读说明书 如果有任何问题, 请通过以下方式联系我们 : 销售部电话 TEL 电子邮箱 ( 销售 ) (sale) shmysw06@163.com 电子邮箱 ( 技术 ) (technician) shmysw08@163.com QQ 客服 QQ customer service 网址 联系时请提供产品货号, 以便我们更高效地为您服务 谢谢! This kit is for in vitro research use, not for clinical diagnosis! 第 5 页共 5 页