试剂盒组成

Size: px

Start display at page:

Download "试剂盒组成"

拙仙銎米
7 years ago
Views:

1 ElisaRSR TM ZnT8 Ab TM 锌转运体 8(ZnT8) 自身抗体 ELISA 检测试剂盒说明书预期用途 RSR 公司生产的 ZnT8 自身抗体 (ZnT8 Ab)ELISA 试剂盒仅用于定量检测人血清中的 ZnT8 自身抗体, 需专业技术人员操作胰岛 β 细胞自身抗体是 1 型糖尿病 (T1DM) 的重要血清标志物, 可以识别的抗原包括 : 胰岛素, 谷氨酸脱羧酶 (GAD65), 胰岛细胞抗原 IA-2 或者 ICA-512 和锌转运体 8(ZnT8) ZnT8 自身抗体识别的抗原决定簇是由 ZnT8 蛋白羧基端 ( 残基 ) 形成的不连续构象决定簇, 其中第 325 氨基酸密码子的基因多态性有很大影响第 325 氨基酸密码子可以表达出 3 种氨基酸 : 精氨酸 (R)325, 色氨酸 (W)325 和罕见谷氨酰胺 (Q)325 ZnT8 自身抗体包括 R325 和 W325 特异性抗体及非特异性抗体, 但 Q325 特异性抗体比较罕见 RSR 公司的 ZnT8 自身抗体检测试剂盒可以定量检测 R325/W325 特异性及非特异性的 ZnT8 抗体参考文献 J. M. Wenzlau et al The cation efflux transporter ZnT8 (Slc30A8) is a major autoantigen in human type I diabetes. PNAS : P. Achenbach et al Autoantibodies to zinc transporter 8 and SLc30A8 genotype stratify type 1 diabetes risk. Diabetologia : J. M. Wenzlau et al Kinetics of the post-onset decline in zinc transporter 8 autoantibodies in type 1 diabetic human subjects. J ClinEndocrinolMetab : L. Petruzelkova et al The dynamic changes of zinc transporter 8 autoantibodies in Czech children for the onset of type 1 diabetes mellitus. Diabet Med : 本产品在欧洲专利及其他国家申请中的专利许可下生产检测原理在 RSR 的 ZnT8 Ab ELISA 检测方法中, 患者血清, 标准品和质控品中的 ZnT8 抗体经小时的孵育可以和微孔板上包被的 ZnT8 蛋白结合洗掉未结合的抗体后, 用生物素标记的 ZnT8(ZnT8- 生物素,ZnT8-Biotin) 进行第二次孵育, 这样 ZnT8 自身抗体就在微孔板中同包被的 ZnT8 与 ZnT8- 生物素之间形成一个桥梁洗掉未结合的 ZnT8- 生物素, 已结合的 ZnT8- 生物素的量可利用链霉亲和素 - 过氧化物酶 (SA-POD) 的显色反应测定洗去未结合的链霉亲和素 - 过氧化物酶, 加入过氧化物酶底物四甲基联苯胺 (TMB), 可形成蓝色复合物加入终止剂终止反应后, 复合物由蓝色变为黄色, 分别在波长 450nm 和 405nm 读取吸光度当 450nm 吸光值较高时, 建议在 405nm 读数后转换为 450nm 的吸光值, 如果只可使用一个波长检测, 建议使用 405nm 读数检测范围为 u/ml (RSR 单位 )

2 样本要求及贮存待检样本应立即分离出血清进行检测, 或分装后在 -20 C 保存尽量避免反复冻融, 防止贮存温度过高每份样本检测需要 50µL 血清 ( 每孔 25µL, 实验建议进行复孔 ) 避免使用脂血溶血的样本可使用柠檬酸盐或者肝素作为抗凝剂的血浆样本进行检测研究表明, 当使用 EDTA 作为抗凝剂时,ZnT8 抗体阳性的血浆样本吸光度值受影响变低具体为 19 个 EDTA 血浆样品含有不同浓度 ZnT8 抗体同对应血清样品 ( 血清 ZnT8 抗体浓度范围是 u/ml) 比较,OD450 值要降低 33%-65%,u/mL 值要降低 37%-64% 需要时, 在室温下解冻测试血清并轻轻混匀当血清含有絮状物或者颗粒时, 需要离心以去除颗粒物质 ( 推荐速度 : g, 离心 5 分钟 ), 请勿省略离心处理步骤符号符号含义欧盟委员会符合性说明书体外诊断医疗器械产品样本号目录编号批号参阅使用说明生产商有效日期贮存阳性质控品阴性质控品实验设备能调剂 25µL 和 100µL 的微量加样器复溶及稀释试剂的量具纯水酶标仪 ( 含 405nm 和 450nm 波长 ) ELISA 孔板振荡器 ( 可达 500 次 / 分的非垂直振荡器 ) ELISA 孔板盖试剂盒组成

3 ZnT8 包被的微孔板 (96 孔 ), 每个孔架包括 12 条, 每条 8 孔, 密封保存开封前室温 (20-25 C) 放置 30 分钟 A 微孔条需与底架牢固结合, 未使用的板条同干燥剂要放回原铝箔袋, 用胶带密封后放入可封口塑料袋, 可在 2-8 C 下保存 1 个月标准品 5 瓶, 每瓶 0.7mL, 浓度分别为 u/ml(rsr B1-5 单位 ), 直接使用 C1-2 阳性质控品 I 和 II, 每瓶 0.7mL( 浓度详见标签 ), 直接使用 D 阴性质控品,0.7mL 直接使用 ZnT8- 生物素 (3 小瓶, 冻干粉 ) E 每瓶 ZnT8- 生物素在使用前用 5.5mL 的生物素复溶缓冲液进行复溶 (F) 当使用多瓶时, 将其合在一起充分混匀使用溶解后可在 2-8 C 保存 3 天 F ZnT8- 生物素复溶缓冲液 (2 15mL 红色 ) 直接使用浓缩的链霉亲和素 - 过氧化物酶 (SA-POD,1 瓶 0.7mL) G 用 SA-POD 稀释液 (H) 进行 20 倍稀释例如,0.5mL(G)+ 9.5mL(H) 稀释的 SA-POD 在 2-8 C 保存不超过 16 周 H SA-POD 稀释液 (15mL) 直接使用 I 过氧化物酶底物 ( 四甲基联苯胺,TMB,15mL) 直接使用浓缩洗涤缓冲液 (125mL,10 倍浓缩 ) J 使用前, 用纯水稀释例如,100mL(J)+ 900mL 纯水稀释的洗涤缓冲液在有效期内 2-8 C 保存 K 终止液 (12mL) 直接使用实验步骤除 ZnT8- 生物素及其复溶缓冲液外, 其它所有的试剂需在使用当天置于室温下 (20-25 C) 复温在步骤中建议使用 Eppendorf 连续加样器在相应的板孔中加入 25µL 标准品 (B1-5) 质控品 (C1-2 和 D) 和患者血清第 1 建议做复孔, 设置 2 个空白孔 ( 见步骤 12) 一盖上微孔板盖, 将微孔板置于 ELISA 板振荡器上混匀 5 秒钟,2-8 C 孵育过夜, 天小时, 无需振荡用洗板机抽出微孔板内液体, 并用已稀释的洗液 (J) 清洗孔板 3 次如手工洗 3 板, 应快速弃去反应液, 手动洗涤三次后, 倒置在吸水纸上将多余的液体拍干除空白孔外, 用加样器向其余各孔中加入低温复溶的 ZnT8- 生物素 (E)100µL 4 加样过程中防止液体的溅出 5 盖好微孔板盖, 将微孔板置 2-8 C 孵育 1 小时, 无需振荡 6 重复步骤 3 第 7 除空白孔外, 用加样器向各孔中加入 100µL 已稀释的链霉亲和素 - 过氧化物酶 (G) 二盖好微孔板, 置于 ELISA 板振荡器上, 室温 (20-25 C) 振荡 20 分钟 (500 次 / 天 8 分 ) 重复步骤 3, 如采用手工洗板, 则用已稀释的洗液洗 3 次, 纯水洗 1 次以除去气 9 泡, 而后在吸水纸上将多余的液体拍干 10 每孔中加入 100µL 的 TMB(I), 室温避光 (20-25 C) 放置 20 分钟, 无需振荡每孔中加入 100µL 终止液 (K), 盖好微孔板, 在振荡器上振荡约 5 秒钟确保每 11 孔的底物孵育时间相同

4 12 30 分钟内, 用酶标仪在波长 405nm 和 450nm 下分别读取每孔的吸光度 OD 值, 并扣除只含 100µL 酶反应底物 TMB(I) 和 100µL 终止液 (K) 的空白孔吸光度结果分析绘制标准曲线,X 轴为浓度 ( 对数模式 ),Y 轴为吸光度 OD 值 ( 线性模式 ) 患者血清中的 ZnT8 自身抗体浓度可以通过标准曲线读出 (RSR 采用对数 / 线性样条曲线, 曲线平滑系数 =0) 亦可采用其他数据处理系统阴性质控品(D) 的 ZnT8 自身抗体浓度为 0 u/ml, 也可以设定为 1 u/ml, 以便软件结果处理当样本抗体浓度较高时, 可用阴性质控品 (D) 进行稀释, 例如,15µL 的样本加入 135µL 的阴性质控品, 相当于 10 倍稀释其他浓度稀释液 ( 例如 100 倍 ) 可以从 10 倍稀释液制备或视情况而定一些样本血清经过稀释后不会呈线性变化举例标准品 450nm 吸光度浓度 u/ml 405nm 吸光度浓度 u/ml B B B B B 阴性质控 D 阳性质控 C 阳性质控 C 注 : 若 450nm 吸光度值在 3.0 以上, 可以用 405nm 的吸光度值乘上一个适当的系数即可转换为 450nm 的吸光值 (RSR 酶标仪系数为 3.4) 临界值阴性阳性 <15 u/ml 15 u/ml

5 性能评价特异性和灵敏度在 IASP 2012 研究中, 该试剂盒的特异性为 99%(n=90), 灵敏度为 72%(n=50) 用此试剂盒检测 300 例健康志愿者的血清,297 例 ZnT8 Ab 检测结果为阴性, 其平均值为 1.9 u/ml, 标准差为 3.84 u/ml 3 例 (1%) 为阳性, 具体浓度分别为及 19 u/ml 检测下限将本试剂盒的阴性质控品检测 20 次, 计算平均值和标准差,2 倍标准差的检测下限为 1.2 u/ml 批间精密度样本平均值 u/ml(n=20) CV(%) A B C 批内精密度样本平均值 u/ml(n=25) CV(%) 临床准确性用本试剂盒对非 1 型糖尿病的自身免疫疾病患者血清进行检测, 结果显示类风湿因子阳性样本 (n=26) 及以下自身抗体阳性样本 : 甲状腺球蛋白抗体 (n=20), 甲状腺过氧化物酶抗体 (n=24), 水通道蛋白 4 抗体 (n=4), 乙酰胆碱受体抗体 (n=9), 对本检测结果无影响, 无干扰 4%(n=24)TSH 受体抗体阳性样本及 9%(n=23)21 羟化酶抗体阳性样本在此 ZnT8 抗体检测中呈阳性干扰性当待检样本中混有以下物质时, 对检测结果并无干扰 : 血色素 500mg/dL, 胆红素 20mg/dL, 脂肪乳剂 3000mg/dL 以下本说明书中引用的数据仅有指导作用我们推荐每个实验室在检测中建立自己的质控样本模式, 同时也应该建立自己的 ZnT8 自身抗体的正常值和具有病原学上有参考意义的检测范围安全性本试剂盒用于体外检测, 需由专业技术人员根据说明书进行操作请注意标签上注明的有效期和复溶试剂的稳定性详细的安全信息参见材料安全数据清单试剂盒中的所有组分应避免食入, 吸入和直接接触到皮肤衣服穿用防护衣本试剂盒中所用的人源性材料与 HIV1, HIV2,HCV 抗体, 及 HBsAg 并无反应, 且已经得到验证, 但我们在处理这些潜在的感染也应该多注意如果存在污染, 请在离开实验室之前彻底地洗手在处理包括样本在内的潜

6 在污染废物前, 应对其进行灭菌本试剂盒涉及的非人源性的材料 ( 如来自动物 ) 已经证实均来自健康的动物, 但这些物质仍应按潜在的感染源进行处理试剂盒中包含一些作为防腐剂的组分, 如少量的叠氮化钠因此试剂盒中的所有组分应避免食入吸入注射和直接接触到皮肤眼睛和衣服在处理试剂盒组分时, 要用大量的水冲洗排水系统, 避免形成重金属复合物简要操作步骤第一除 ZnT8- 生物素及其复溶缓冲液外, 其它试剂需在使用当天置于室温下 (20-25 C) 静置复温天加样加入 25µL 标准品, 质控品及患者血清 ( 预留空白孔 ), 振荡混匀 5 秒钟孵育 2-8 C 孵育过夜小时, 无需振荡第吸空微孔板二洗板 3 次 ( 如手工洗板, 洗板后应倒置在吸水纸上拍干 ) 天加样加入低温复溶的 ZnT8- 生物素 100µL( 空白孔除外 ) 孵育 2-8 C 孵育 1 小时, 无需振荡吸空微孔板洗板 3 次 ( 如手工洗板, 洗板后应倒置在吸水纸上拍干 ) 加样加入已稀释的链霉亲和素 - 过氧化物酶 100µL( 空白孔除外 ) 孵育 ELISA 板振荡器上室温 (20-25 C) 振荡 20 分钟 (500 次 / 分 ) 吸空微孔板洗板 3 次 ( 如手工洗板, 用已稀释的洗液洗 3 次, 纯水洗 1 次, 拍干 )* 加样每孔中加入 TMB 100µL 孵育室温避光 (20-25 C) 放置 20 分钟加样每孔中加入终止液 100µL, 在振荡器上振荡约 5 秒钟反应终止后 30 分钟内, 分别在 405nm 和 450nm 读取吸光度值 * 当使用洗板机进行洗板时无须拍干, 同时省去纯水洗板的步骤

材料方法

材料方法生物技术通报姜燕采用鼠抗人血红蛋白单克隆抗体和胶体金标记鼠抗人血红蛋白单克隆抗体及对照抗体羊抗鼠利用双抗体免疫夹心反应原理特异性地结合人血红蛋白抗原在内可得到胶体金显色结果的原理研制便潜血单克隆一步法胶体金检测试卡用于诊断因各种原因引起的消化道出血疾病应用杂交瘤技术制备两株鼠抗人血红蛋白抗体方法检测效价免疫胶体金技术制备胶体金检测试卡法检测效价的结果显示鼠抗人