药品微生物限度与无菌检查 中检院 微生物检测室 戴翚 中国食品药品检定研究院
风险管理 风险调查 / 评估 药品微生物控制 风险管理风险调查 / 评估 微生物实验室技术能力
药品微生物检验的过程控制 无菌性检查 环境保证 培养基保证 灵敏度检查 过程控制 SOP 操作 有效的方法 方法验证 有效的结果 结果判断 可靠的结论
USP35 部分章节 <51>Antimicrobial Effectiveness Testing <55>Biological Indicators-Resistance Performance Tests <61>Microbiological Examination of Nonsterile Products: Microbial Enumeration Tests <62>Microbiological Examination of Nonsterile Products: Tests for Specified Microorganisms <1111>Microbiological Attributes of Nonsterile Pharmaceutical Product <63>Mycoplasma Tests <71>Sterility Tests <1035>Biological Indicators for Sterilization <1112>Aplication of Water Activity Determination to Nonsterile Pharmaceutical Products <1113>Microbial Characterization, Identification, and Strain Typing <1116>Microbiological Evalution of Clean Rooms and Other Controlled Environments <1117>Microbiological Best Laboratory Practices <1208>Sterility Testing-Validation of Isolator Systems <1211>Sterilization and Sterility Assurance of Compendial Articles <1223>Validation of Alternative Microbiological Methods 中国药典 2015 年版 抑菌效力检查法生物指示剂抗性检查法非无菌产品微生物检查 : 微生物计数法非无菌产品微生物检查 : 控制菌检查法非无菌药品微生物限度标准支原体检查法无菌检查法灭菌用生物指示剂指导原则水活度检查法用于非无菌药品微生物评价微生物鉴定指导原则药品洁净实验室微生物监测和控制指导原则药品微生物实验室质量管理指导原则无菌检查用隔离器系统验证指导原则灭菌法药品微生物检验替代方法验证指导原则 / 非无菌药品微生物限度检测指导原则 /( 日本药典收载 ) 中药饮片微生物限度检查法?
药品微生物检验的过程控制 无菌检查用隔离系统验证指导原则 对照培养基 无菌性检查 药品微生物实验室质量管理指导原则 环境保证 培养基保证 灵敏度检查 SOP 操作 有效的方法 方法验证 药品洁净实验室微生物检测和控制指导原则 有效的结果 结果判断 药品微生物检验替代方法验证指导原则 可靠的结论 微生物鉴定指导原则
案例 阳性结果与玻璃安瓿表面采样菌高度相似
无菌检查过程微生物控制 空气微生物浮游菌沉降菌 表面微生物样品包装表面操作人员手部
点刻痕易折玻璃安瓿 1 刻痕工艺控制不好深浅 长短 高低位置不一色点和刻痕位置偏离 2 规格尺寸不规范瓶身外径精度不够刻痕不易控制瓶颈壁厚不均匀折断后断面不平整 点刻痕易折安瓿的色点应标记在刻痕的上方中心与中心线的偏差不得过 ±1.0mm 3 玻璃材质不佳低硼硅玻璃 :48.6% 中性硼硅玻璃 :7.7% 我国 90% 以上低硼硅玻璃 4 易折方式影响折断力色环 : 通过在瓶颈喷涂与玻璃膨胀系数不同的色釉产生应力, 从而使断面平整 5 灌装工艺落后造成折断力差为防止灌装中安瓿断头 安瓿折断后, 断面应平整 国家药用包装容器 ( 材料 ) 标准 YBB00332002
玻璃安瓿与不溶性微粒 视频提供 : 大冢制药
玻璃安瓿表面消毒方案比较 杀孢子剂 ( 过氧乙酸 ) 喷洒后立即 (3min 5min 10min) 用 75% 乙醇钝化, 再用湿棉签擦拭取样 酒精灯过火 1 秒钟 (3 秒钟 5 秒钟 10 秒钟 ) 后直接用湿棉签擦拭取样 表面消毒方案作用时间残留菌落数菌属类型 杀孢子剂立即 2cfu Bacillus 3min 0cfu / 5min 0cfu / 10min 0cfu / 棉签擦拭 & 过火 1 秒钟 4cfu Bacillus Brevibacillus 3 秒钟 10cfu Bacillus Paenibacillus Brevibacillus 5 秒钟 0cfu / 10 秒钟 0cfu /
无菌检查过程微生物控制 空气微生物浮游菌沉降菌 表面微生物样品包装表面操作人员手部
微生物检验的过程控制 环境保证 培养基保证 无菌性检查 灵敏度检查 过程控制 SOP 操作 有效的方法 方法验证 有效的结果 结果判断 可靠的结论
微生物实验室工作流程
环境保障 WHO GPML 各区域等级
微生物限度 & 无菌检查环境要求 无菌检查 : 环境洁净度 B 级背景下的局部 A 级洁净度的单向流空气区域内或隔离系统中 B+A or 隔离系统 中国药典 2010 版 万级下的百级 中国药典 2015 版 9205 药品洁净实验室微生物监测和控制指导原则 9206 无菌检查用隔离系统验证指导原则 微生物限度检查 : 受控洁净环境下的局部洁净度不低于 B 级的单向流空气区域内 D+BSCⅡ 生物安全柜
洁净室 / 台工作原理 层流 Laminar flow 混流 Conventional (mixed flow) cleanroom
相关洁净标准比较 ISO 14644 讨论了洁净室和受控环境的设计与建设 按 ISO 14644 的分类是建立在环境中每单位体积的总体粒子数的基础上 分类不区分非生物粒子或生物粒子
相关洁净标准比较 2010 版 GMP 洁净度级别标准 静态 百级, 动态 万级
相关洁净标准比较 2015 版建议的洁净实验室环境监测频次及项目 受控区域洁净级别采样频次检测项目 隔离系统 内部 每次试验 粒子 浮游菌 沉降菌 表面菌 相邻外部 每半年 粒子 浮游菌 沉降菌 表面菌 微生物洁净实验室 A 级 每次试验 粒子 浮游菌 沉降菌 表面菌 B 级 每周 粒子 浮游菌 沉降菌 表面菌 C 级 每季度 粒子 浮游菌 沉降菌 表面菌 D 级 每半年 粒子 浮游菌 沉降菌 表面菌 按 ISO 14644 的定级是建立在环境中每单位体积的总体粒子数的基础上 定级不区分非生物粒子或生物粒子
B 级 与 C 级 的异同
悬浮粒子与环境微生物 非生物粒子数量和活的微生物浓度之间的关系在科学上未达成绝对的一致 当操作人员是粒子的来源时, 以下的结论是成立的, 即洁净室中的粒子越少, 空气中微生物存在的可能性就越小 实验设备运行时大量产生的粒子污染和人员产生的粒子污染之间是无法明确区分的 大量的药物除了微生物以外还有粒子限度的要求 几乎肯定的是, 部分悬浮粒子与微生物有关 因此, 洁净室监测应包括微生物与粒子数两方面
洁净室使用次数与浮游菌数关系 16 14 12 10 8 6 4 2 13# 使用次数 13# 浮游菌数 16# 使用次数 16# 浮游菌数 0 1 月 2 月 3 月 4 月 5 月 6 月 7 月 8 月 9 月 10 月 11 月 12 月
2012 2013 年无菌室 C 级浮游菌分布图比较 20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 1 月份 3 月份 5 月份 7 月份 9 月份 11 月份 13 号无菌室 15 号无菌室 16 号无菌室 浮游菌标准 : A 级 :<1 CFU/m 3 B 级 : 10 CFU/m 3 C 级 : 100 CFU/m 3 20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 1 月份 3 月份 5 月份 7 月份 9 月份 11 月份 13 号无菌室 15 号无菌室 16 号无菌室
近 8 年无菌室 C 级浮游菌高限图 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 硬件差异 软件差异 2007 2008 2009 2010 2011 2012 2013 2014 7 月 8 月 9 月
洁净区微生物监测水平 USP35 <15 cfu 信息性, 非标准性
监控基于风险评估 120 100 80 60 40 20 0 法规标准 OOT 行动限 OOE 警戒限常规波动 WHO good practices for pharmaceutical microbiology laboratories Appendix 4 Examples of equipment qualification and monitoring
环境微生物归属
欣弗事件 夺命的欣弗 欣弗培养物 肺炎克雷伯巨大芽孢杆菌粘质沙雷菌 洁净环境常见菌 : 头状葡萄球菌 (Staphylococcus capitis) 溶血葡萄球菌 (Staphylococcus haemolyticus) 缓症链球菌 (Streptococcus mitis) 科氏葡萄球菌 (Staphylococcus cohnii) 藤黄微球菌 (Micrococcus luteus) 山羊葡萄球菌 (Staphylococcus caprae) 编号 鉴定结果 0206L 1 肺炎克雷伯 (K.pneumoniae ); 2 粘质沙雷菌 (S.marcescens) 0206G 1 肺炎克雷伯 (K.pneumoniae ); 2 粘质沙雷菌 (S.marcescens) 298L; 298G 303L; 303G 305L; 305G 1 肺炎克雷伯 (K. pneumoniae ); 2 粘质沙雷菌 (S.marcescens) 1 肺炎克雷伯 (K.pneumoniae ); 2 阴沟肠杆菌 (Enter. cloacae) 1 肺炎克雷伯 (K. pneumoniae ); 2 粘质沙雷菌 (S.marcescens) 306L/6G 肺炎克雷伯 (K.pneumoniae ) 307G 肺炎克雷伯 (K.pneumoniae ) 308L 粪产碱杆菌 (Al.faecalis) 309L 304G 粪产碱杆菌 (Al.faecalis) 嗜麦芽寡养单胞菌 (S.maltophilia)
不同生物安全水平对设施的要求
不同保护类型及生物安全柜的选择 保护类型 个体防护, 针对生物危险等级 1~3 级微生物 个体防护, 针对生物危险等级 4 级微生物, 手套箱型实验室 个体防护, 针对生物危险等级 4 级微生物, 防护服型实验室 实验对象保护 少量挥发性放射性核素 化学品的防护 挥发性放射性核素 化学品的防护 生物安全柜的选择 Ⅰ 级 Ⅱ 级生物安全柜 Ⅲ 级生物安全柜 Ⅰ 级 Ⅱ 级生物安全柜 Ⅱ 级生物安全柜, 柜内气流是层流的 Ⅲ 级生物安全柜 Ⅱ 级 B1 型生物安全柜, 外排风式 Ⅱ 级 A2 型生物安全柜 Ⅰ 级 Ⅱ 级 B2 型 Ⅲ 级生物安全柜 I 级安全柜适用于一级, 二级和三级安全实验室, II 级和 III 级安全柜则适用于所有级别安全实验室
Ⅰ 级 Ⅱ 级以及 Ⅲ 级生物安全柜之间的差异 生物安全柜 面风速 (m/s) 气流百分数 (%) 排风系统 循环部分排出部分 Ⅰ 级 0.38 0 100 硬管 Ⅱ 级 A1 0.38~0.50 70 30 排到房间或套管连接处 Ⅱ 级 A2 型 0.50 70 30 排到房间或套管连接处 Ⅱ 级 B1 型 0.50 30 70 硬管 Ⅱ 级 B2 型 0.50 0 100 硬管 Ⅲ 级 NA 0 100 硬管
Class I 生物安全柜 1 从前窗口吸入的负压气流, 用以保护人员的安全 ; 2 排出的气流经 HEPA 过滤器过滤, 用以保护环境, 不受污染 ; 3 对受试样本, 不能提供切实可靠的保护 适用于样品不需保护的工作
II 级 A2 型生物安全柜 前窗进风气流平均流速 0.50m/s 生物安全柜排风管道接口与建筑物排风系统相连接 可以从事少量的的挥发性有毒化学物质或放射性的工作 无外接风道 有外接风道 Contaminated air under negative pressure Contaminated air under positive pressure HEPA-filtered air Room air
工作台摆放 在生物安全柜上工作 干净的物品 被污染的区域 废弃物托盘 垃圾袋
无菌隔离系统与传统洁净技术的对比 项目 消毒 / 灭菌方法 洁净环境的控制 对操作人员的防护 物料传送方式 人员进出 运行所需能耗 误操作导致的无菌环境污染的风险 传统洁净技术 消毒剂擦拭 / 熏蒸 / 紫外线照射等方法受空间等诸多因素影响效果难以验证 易受人员 物料等诸多因素影响, 易受污染, 难以控制 ; 取决于操作人员自身技术和熟练程度 ; 传统的传递窗, 易导致无菌室环境破坏和物料的污染 ; 需复杂的换高鞋 / 工作服更换等步骤, 带来额外工作量 ; 误操作可能性大, 与操作人员有较大相关性 无菌隔离器技术 自动气体灭菌, 与外界完全省时省力, 隔离, 仅通气体分布均匀, 过 HEPA 进行效果较好, 容空气交换并易验证 ; 可恒定舱内压力以阻绝外界污染 ; 安全系数高 双门快速传递系统保证在无菌环境中传递, 无菌保证程度高 ; 仅通穿戴手套 / 半身工作服即可 ; 低 可能性极小
隔离器 H 2 O 2 溶液被泵入蒸发器 液态 H 2 O 2 气态 H 2 O 2 2x3-glove Isotest 10-6 SAL 表面杀灭效率
隔离器 9206 无菌检查用隔离系统验证指导原则 1. 操作验证 2. 完整性验证 3. 灭菌验证 4. 灭菌循环验证 5. 内部洁净度验证 6. 仪器仪表验证
隔离器 - 灭菌循环验证
隔离器 - 灭菌循环验证
内部洁净度验证
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三种主要设备比较 生物安全柜 层流柜 无菌隔离器 人员保护 环境要求 样品保护 处理样品灵活性 操作难度 运行维护难度
微生物检验的过程控制 环境保证 培养基保证 无菌性检查 灵敏度检查 过程控制 SOP 操作 有效的方法 方法验证 有效的结果 结果判断 可靠的结论
ChP 无菌检查培养基与 USP BP 的比较 硫乙醇酸盐流体培养基 (Fluid Thioglycollate Medium) 药典 USP BP 中国药典 -2015 名称 Fluid Thioglycollate Medium Fluid Thioglycollate Medium Fluid Thioglycollate Medium 硫乙醇酸盐流体培养基 硫乙醇酸盐流体培养基 硫乙醇酸盐流体培养基 目的 培养需氧 厌氧和微需氧微生物 ( 主要是厌氧菌 ) 培养需氧 厌氧和微需氧微生物 ( 主要是厌氧菌 ) 培养需氧 厌氧微生物 培养条件 14 天于 30-35 C 及 20-25 C 配方 Pancreatic Digest of Casein( 胰酪蛋白胨 )...15.0 g Yeast Extract( 酵母浸出粉 )...5.0 g Dextrose( 葡萄糖 )...5.5 g Sodium Chloride( 氯化钠 )...2.5 g L-Cystine( L- 胱氨酸 )...0.5 g Sodium Thioglycollate ( 硫乙醇酸钠 )...0.5 g Agar( 琼脂 )...0.75 g Resazurin( 刃天青 )...1.0 mg
ChP 无菌检查培养基与 USP BP 的比较 大豆胰酪胨培养基 (TSB) & 改良马丁培养基 药典 USP36 BP-2013 中国药典 2010 版中国药典 2015 版 名称 配方 Tryptic Soy Broth (Soybean casein digest medium) 大豆 - 胰酪胨培养基 胰酪蛋白胨.....7.0g 大豆木瓜蛋白酶消化物.3.0g 氯化钠.... 5.0g 磷酸氢二钾...2.5g 一水葡萄糖. 2.5g 改良马丁培养基 蛋白胨..5.0g 酵母浸出粉. 2.0g 葡萄糖...20.0g 磷酸氢二钾..1.0g 硫酸镁 (MgSO4.7H2O).0.5g 胰酪大豆胨液体培养基 胰酪胨 17.0g 大豆木瓜蛋白酶水解物 3.0g 氯化钠 5.0g 磷酸氢二钾 2.5g 葡萄糖 / 无水葡萄糖 2.5g /2.3g 目的 培养条件 支持广泛微生物的生长, 包括需氧菌 用于培养真菌专性和兼性厌氧菌 真菌 ( 主要是需氧菌 ) 支持广泛微生物的生长, 包括需氧菌 专性和兼性厌氧菌 真菌 ( 主要是需氧菌 ) 14 天于 30-35 C 及 20-25 C 14 天于 20-25 C 14 天于 30-35 C 及 20-25 C
微生物实验室常用菌株 铜绿假单胞菌 (Pseudomonas aeruginosa) [CMCC(B) 10104] 大肠埃希菌 (Escherichia coli) [CMCC(B) 44102] 金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus) [CMCC(B) 26003] 生孢梭菌 (Clostridium sporogenes) [CMCC(B) 64941] 枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis) [CMCC(B) 63501] G - 杆菌 G + 球菌 G + 芽孢杆菌 兼性需氧菌 专性厌氧菌 白色念珠菌 (Candida albicans) [CMCC(F) 98001] 黑曲霉 (Aspergillus niger) [CMCC(F) 98003] 酵母菌 霉菌 专性需氧菌
在硫乙中生长差异 需氧层厌氧层均生长 铜绿假单胞菌 (Pseudomonas aeruginosa) [CMCC(B) 10104] 大肠埃希菌 (Escherichia coli) 生孢梭菌 (Clostridium sporogenes) [CMCC(B) 44102] [CMCC(B) 64941] 金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus) [CMCC(B) 26003] 仅在厌氧层生长 仅在需氧层生长 枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis) [CMCC(B) 63501]
方法适用性内容修订
微生物计数定义变化 修订前 修订后内容 (1) 需氧菌总数 (TAMC) 细菌数 营养琼脂霉菌和酵母菌数 玫瑰红钠琼脂 (2) 霉菌和酵母菌总数 (TYMC) (3) 需氧菌总数 : 生长在胰酪大豆胨琼脂 (TSA) 上所有菌落 ( 包括霉菌和酵母菌 ) (4) 霉菌和酵母菌总数 : 一般指生长在沙氏葡萄糖琼脂 (SDA) 上的所有菌落 ( 包括细菌 ) 如果由于细菌的生长而使霉菌和酵母菌的计数结果不符合微生物限度要求, 可使用含有抗生素的 SDA 重新计数
单剂量免称量独立包装专利号 : ZL200920108836.8 对照培养基 培养基质量控制 : USP 之前验证过的 中国药典 对照培养基 待测培养基平均菌落数 ( cfu) *100% 对照培养基平均菌落数 ( cfu) 回收率 50%~200%
培养基适用性检查 范围 液体 固体培养基 加菌量 培养温度 培养时间 可接受标准 不大于 100cfu 胰酪大豆胨琼脂 :30~35 培养 ; 胰酪大豆胨肉汤 :30~35 培养 ; 沙氏葡萄糖琼脂 :20~25 培养 细菌不大于 72h, 真菌不大于 5 天 固体培养基 :50%~200%(0.5~2) 液体培养基 : 生长良好
培养基适用性检查 培养基名称 胰酪大豆胨肉汤 (TSB) 无菌性检查 取已灭菌的 TSB, 于 30-35 培养不少于 3 天, 培养基应澄清 试验用菌株 接种方法 枯草芽孢杆菌 金黄色葡萄球菌 铜绿假单胞菌 分别接种各试验用菌悬液于该培养基中, 接种量不大于 100cfu, 摇匀, 培养 适用性检查 接种试验用菌株后,30-35 培养不超过 72 小时, 与对照培养基比较, 试验菌应生长良好 ( 建议 : 培养基呈混浊的液体, 或划线于相应的分离平板上, 培养后呈现典型菌落 ) 备注 : 该培养基同时用于稀释液的制备和控制菌检查时, 需要考虑同时满足计数和 控制菌检查培养基适用性检查控制要求
培养基适用性检查 培养基名称 胰酪大豆胨琼脂 (TSA) 无菌性检查 试验用菌种 接种方法 取已灭菌 TSA 注皿, 于 30-35 培养 3~5 天, 应无菌落生长 枯草芽孢杆菌 金黄色葡萄球菌 铜绿假单胞菌 白色念珠菌 黑曲霉 涂布法 : 表面接种不大于 100cfu 试验用菌悬液于 TSA 平板表面 ; 倾注法 : 接种不大于 100cfu 试验用菌悬液于无菌平皿, 倾注该培养基, 轻轻摇匀 适用性检查 枯草芽孢杆菌 金黄色葡萄球菌 铜绿假单胞菌于 30-35 培养不 超过 3 天 ; 白色念珠菌 黑曲霉于 30-35 培养不超过 5 天 与对照培养基比较, 恢复率在 50%~200% 之间
培养基适用性检查 培养基名称 沙氏葡萄糖琼脂 (SDA) 无菌性检查 取已灭菌的 SDA 注皿, 于 20-25 培养 5~7 天, 应无菌落生长 试验用菌种 接种方法 适用性检查 白色念珠菌 黑曲霉涂布法 : 表面接种不大于 100cfu 试验用菌悬液于 SDA 平板表面 倾注法 : 接种不大于 100cfu 试验用菌悬液于无菌平皿中, 倾注该培养基, 轻轻摇匀 白色念珠菌 黑曲霉于 20-25 培养不大于 5 天 与对照培养基比较, 恢复率在 50%~200% 之间 备注 : 如该培养基用于控制菌白色念珠菌的检查时 National Institutes, 同时需要满足控制菌项 for Food and Drug Control 下培养基适用性检查要求
培养基适用性检查 培养基名称无菌性检查试验用菌种常用抗生素接种方法适用性检查 沙氏葡萄糖琼脂 + 抗生素 ( 当细菌超标引起霉菌和酵母菌总数超标用 ) 取已灭菌的 SDA 注皿, 于 20-25 培养 5~7 天, 应无菌落生长 抑菌性检查 : 枯草芽孢杆菌 金黄色葡萄球菌 铜绿假单胞菌促生长能力 : 白色念珠菌 黑曲霉 1 庆大霉素 : 广谱 对 G-,G+ 菌有较好的抗菌作用 2 氯霉素 : 广谱 对 G- 菌作用强 ; 对 G+ 菌作用不及青霉素与四环素 抑菌性 : 接种不少于 100cfu 试验用菌 促生长能力 : 接种不大于 100cfu 试验用菌 白色念珠菌 黑曲霉于 20-25 培养不大于 5 天 与对照培养基比较, 恢复率在 50%~200% 之间 枯草芽孢杆菌 金黄色葡萄球菌 铜绿假单胞菌应不得生长
乌鸡白凤丸 样品 : 乌鸡白凤丸 疑似菌落做革兰染色 革兰阳性杆菌 不属于霉菌或酵母菌 将无菌硫酸庆大霉素 ( 相当于 20mg 庆大霉素 ) 胰酪胨大豆琼脂培养基 胰酪大豆胨琼脂培养基 玫瑰红钠琼脂培养基 玫瑰红钠琼脂培养基
选择性培养基适用性 控制菌检查培养基特性试验菌株 乳糖胆盐发酵培养基促生长能力 E.coli 大肠菌群 抑制能力 S.aureus 乳糖发酵培养基促生长能力 + 指示能力 E.coli EMB 或麦康凯琼脂促生长能力 + 指示能力 E.coli 胆盐乳糖培养基促生长能力 E.coli 大肠埃希菌 抑制能力 S.aureus MUG EMB 或麦康凯琼脂促生长能力 + 指示能力 E.coli 营养肉汤培养基促生长能力 S paratyphi B 四硫磺酸盐亮绿培养基促生长能力 S paratyphi B 沙门菌 抑制能力 S.aureus DHL 或 SS 琼脂 EMB 或麦康凯琼脂 促生长能力 + 指示能力 S paratyphi B 三糖铁琼脂指示能力 S paratyphi B
选择性培养基适用性 控制菌检查培养基特性试验菌株 胆盐乳糖培养基促生长能力 P.aeruginosa 抑制能力 S.aureus 铜绿假单胞菌 溴化十六烷基三甲铵琼脂促生长能力 P.aeruginosa 抑制能力 E.coli 绿脓菌素测定用培养基促生长能力 + 指示能力 P.aeruginosa 亚碲酸盐肉汤培养基促生长能力 S.aureus 金黄色葡萄球菌 抑制能力 E.coli 甘露醇高盐琼脂或卵黄氯化钠琼脂促生长能力 + 指示能力 S.aureus 抑制能力 E.coli 梭菌 梭菌增菌培养基促生长能力 Cl. sporogenes 哥伦比亚琼脂促生长能力 Cl. sporogenes 沙氏葡萄糖肉汤促生长能力 C.albicans 沙氏葡萄糖琼脂促生长能力 + 指示能力 C.albicans 白色念珠菌 念珠菌显色培养基促生长能力 + 指示能力 C.albicans 抑制能力 E.coli 1% 聚山梨酯 80- 玉米琼脂培养基促生长能力 + 指示能力 C.albicans
微生物检验的过程控制 环境保证 培养基保证 无菌性检查 灵敏度检查 过程控制 SOP 操作 有效的方法 方法验证 有效的结果 结果判断 可靠的结论
方法验证 转移 确认 <1224> <1225> <1226> TRANSFER OF ANALYTICAL PROCEDURES VALIDATION OF COMPENDIAL PROCEDURES VERIFICATION OF COMPENDIAL PROCEDURES 仪器 人员 ( 具象 ) 过程 方法 ( 抽象 ) Qualification Transfer Validation Verification Ludwig Huber, Validation and Qualification in Analytical Laboratories New York, USA, 2007 确认的文件化过程 确认适用性
药典方法需做适用性试验 US FDA cgmp 法规在 21 CFR 211.194 (a)(2) 中规定 : 如果应用的方法收载于现行的美国药典或其他认可的标准方法中, 或在批准的新药应用中有详细方法且未改变这一参考方法时, 有指明方法和参考文献的声明即满足要求 所有检测方法的适用性应在实际应用条件下得到证实 Ludwig Huber Validation and Qualification in Analytical Laboratories New York, USA, 2007
方法适用性 接种法 薄膜过滤法均为药典方法 方法适用性针对环节 : 1 样品制备过程 : 表面活性剂 中和剂的微生物无毒性处理方法的微生物兼容性 2 样品检查过程 : 可用的去除活性或中和活性的方法 Suitability test based on Recovery Validation
检测方法验证 标准 ( 药典 ) 检测方法 实验室在进行常规检测前应证明该实验室可以满足标准检测方法中的某些性能指标 ( 即方法确认 ), 并证明某一方法适用于某产品的检测 ( 方法适用性包括阳性对照和阴性对照 ) 新建方法 药典方法 方法验证与方法适用性 方法转移与方法确认 ( 其他成熟方法 ) ( 部分菌株的验证 ) 有案可查 溯源性 ; 建立实验室自身的方法依据体系其他 准确度 精密度 专属性 检测限 定量限 线性 粗放性
验证的一般程序与环节 利用供试品与微生物的差异, 降低或消除供试品的影响通过模拟实验对降低或消除效果加以检验 需前处理 1 验证前处理方法对污染菌生长 检出的影响 样品 有抑菌作用 去除抑菌作用 不需前处理 无抑菌作用 2 可以通过验证实验判断 3 验证抑菌活性去除的有效性, 以及去除方法对污染菌生长 检出的影响 检查 药品微生物检查方法验证的一般程序与环节
盐酸莫西沙星氯化钠注射液 常规方案 250ml/ 瓶无菌检验量 6 瓶每张膜 3 瓶 : 250ml 3=750ml/ 膜采用分膜的取样方案 : 3 瓶 / 套双联滤器 750ml 2=375ml/ 膜
多价金属阳离子对喹诺酮类的螯合作用 F 6 5 10 O 4 3 COOH HN N 7 8 9 N R R 3 R 1 2 1 2 五种喹诺酮类抗生素的结构, 并且由 3 4 位上的羰基与镁 锰等金属离子配位生成稳定的六元环螯合物, 药物与金属离子的螯合比为 2:1 R 1 R 2 R 3 H H 环丙沙星 CH 2 CH 3 CH 3 F 洛美沙星 CH 2 CH 3 H H 诺氟沙星 CH 3 OCH 3 加替沙星 CH 3 CHF 3 卡德沙星
梯度冲洗找到敏感菌株 菌株 63501 26003 64941 10104 98001 98003 冲洗量 300 400 + + + 600 / / / 800 / / / 1000 / / / 1200 + + / / / 培养体系中添加 0.2mol/L MgSO 4
莫西沙星结构 _ RH 端 N 原子带正电荷 羧基端带负电荷 +
常用中和剂比例 0.1% 大豆卵磷脂 0.7% 吐温 80 卵磷脂 吐温 80 及 L- 组胺酸用于中和醛类及酚类化合物 卵磷脂及吐温 80 中和季铵盐 卵磷脂中和氯已定 吐温 80 中和双三氯酚及汞化合物
以敏感菌株确认冲洗量 种类 0.1% 大豆卵磷脂 0.7% 吐温 80 0.1% 大豆卵磷脂 +0.7% 吐温 80 冲洗量 400 500 600 + 700 / 800 / 针对非油性样品, 使用单纯的表面活性剂会导致冲洗过程中产生过多泡沫影响冲洗效果
方法适用性结论 取本品, 照中国药典 2010 年版二部附录 XI H 薄膜过滤法, 滤过, 每张滤膜不得超过 375ml 供试液 以含 0.1% 大豆卵磷脂 0.7% 吐温 80 的无菌氯化钠溶液为冲洗液,100ml/ 次冲洗滤膜 6 次, 每膜约冲洗 600ml 最后再加入 1ml 无菌的 0.2mol/L 的 MgSO 4 溶液 以枯草芽孢杆菌为阳性对照菌, 应符合规定 样品通量 冲洗液种类冲洗量 中和剂 阳性对照菌
大豆卵磷脂结构
吐温 80 结构 乳化剂降低了混合体系中各组分的界面张力, 并在微滴表面形成较坚固的薄膜由于乳化剂给出的电荷而在微滴表面形成双电层, 阻止微滴彼此聚集, 而保持均匀的乳状液
乳化剂的选择 选择乳化剂的根据是亲水亲油平衡值, 简写为 HLB (Hydrophilic-Lipophilic Balance) 值 表面活性剂的 HLB 值越接近 20, 其亲水倾向越强, 相反越接近 0, 亲油倾向越强
计数方法适用性试验 稀释度依据样品特性, 质量标准制定 + 0.1ml 金黄色葡萄球菌液 + 0.1ml 金黄色葡萄球菌液 根据供试品的理化特性与生物学特性, 采取适宜的方法制备合适的供试液 分装 5 份 9.9ml 供试液 + 0.1ml 铜绿假单胞菌液 + 0.1ml 枯草芽孢杆菌液 + + 0.1ml 白色念珠菌液 + 0.1ml + 0.1ml 黑曲霉菌液 保证平皿中的菌数不大于 100cfu
微生物检验的过程控制 环境保证 培养基保证 无菌性检查 灵敏度检查 过程控制 SOP 操作 有效的方法 方法验证 有效的结果 结果判断 可靠的结论
微生物限度案例 某板蓝根冲剂, 标准为细菌数不得过 1000cfu/g, 某药检所细菌数结论 1200cfu/g, 送中检院仲裁 (1) 方法适用性 合格 不合格
左奥硝唑注射液 ( 10mL:0.25g/ 支 ) 取样量及 样品浓度 样品量冲洗量阳性对照菌 ( 生孢梭菌 ) 生长情况 滤膜通过量 初始供试液浓度下降 10ml 10 支 C:250mg/ml 10ml 10 支溶解于 400ml 0.1% 无菌蛋白胨溶液 50mL 800ml - - + 850ml 1000ml - + - 1050ml 250mL 300ml - + - 550ml 400ml + - - 650ml 滤膜通过量下降 C:50mg/ml 阳性对照生长提前
注射用盐酸克林霉素 ( 0.3g/ 支 ) 初始供试液浓度下降 取样量及 样品浓度 0.3g 10 支每支溶解于 5ml 0.9% NaCl 溶液 C:60mg/ml 0.3g 10 支全部溶解于 500ml 0.9 %NaCl 溶液 样品量 冲洗量 阳性对照菌 ( 金黄色葡萄球菌 ) 生长情况 滤膜通过量 25mL 800ml - - - 825ml 1000ml - - - 1025ml 250mL 400ml - + - 650ml 500ml + - - 750ml 滤膜通过量下降 C:6mg/ml 阳性对照生长提前
菌种传代保藏流程 1 BioBall 3 推荐方式 2 自动稀释
试验用菌株的传代次数不得超过 5 代 ( 从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为第 0 代 ) 代的定义 : 每接种一次即为一代 ( 有在新鲜的培养基上生长过程 ) 传代示意图 : 干燥菌种 (0 代 ) 工作菌株传代保藏规程 QC CV1 CV2 CV3 液体培养基复苏 (1 代 )
工作菌株传代保藏流程示意图 菌种传代流程 冻干菌种 Cycle 1 第一代储备管冻存 ( 零下 30 或 70 ) cv1 cv2 cv3 cv4 QC CV TSB S1 S2 S3 QC 第二代工作菌斜面冷藏 (2~8 ) 鉴别 cv11 cv2 cv3 cv36 QC Cycle 2 第二代储备管冻存 ( 零下 30 或 70 ) 第二代工作菌悬液 冷藏 ( 零下 20 ) S1 S2 S3 QC
微生物检验的过程控制 环境保证 培养基保证 无菌性检查 灵敏度检查 过程控制 SOP 操作 有效的方法 方法验证 有效的结果 结果判断 可靠的结论
实验操作 物料进场 双层无菌包装 洁净传递 ( 风淋 紫外照射 ) 核心区 外围消毒剂清洁外表面 消毒液搽拭物品外表面 外围
实验操作 人员进场 二更 一更
硫乙阴性 090423 马丁阴性 090423 硫乙 样品 090423 马丁 样品 090423 样品沉降菌手指 监控平板 无菌检验框架示意图 硫乙 阳性 090423 马丁 阳性 090423
无菌三针单联管
实验过程监控 表面监控 手部监控 环境菌监控
无菌程序保障 无菌检查样品前处理分批消毒 实验 ( 混合 ) 统一消毒, 统一实验 严格遵守外表面消毒程序一般环境酚类 (phenylphenol/ tertiary amylphenol ) 洁净环境过氧乙酸 +75% 乙醇 ( 无菌级 ) ( 苯式苯酚 / 三级戊基苯酚 ) 增加过程监控力度表面菌采样 手部采样 ( 每批 ) 动态浮游菌采样( 下风口 )
明确标识 Paper labels are preferred over marker pens.
原始记录 样品信息 & 方法信息 仪器信息 & 状态 检验结论前置方便核验 校对 & 复核信息前置
原始记录 样品信息一致 材料信息 & 试剂信息 检验方法描述 检验结果记录
原始记录 样品信息一致 过程监控信息包括监控方案培养条件培养结果及培养基信息 是否启动偏差调查记录
原始记录 样品信息 环境保障调查仪器运转环境监控 检验操作调查培养基 检验用具阴性 阳性对照操作细节 结果判断调查
微生物检验的过程控制 环境保证 培养基保证 无菌性检查 灵敏度检查 过程控制 SOP 操作 有效的方法 方法验证 有效的结果 结果判断 可靠的结论
结果判断 阳性 (+) 阴性 (-) 供试品管浑浊, 即判不合格除非能充分证明试验结果无效, 即生长的微生物非供试品所含 设备, 环境的微生物监控结果超标 回顾实验过程, 发现污染因素 鉴定微生物, 确认是操作引入的 无菌试验经确认无效, 可重试
药品无菌检验的溯源性分析 药品微生物实验室 整改 环境 / 过程微生物的监测 药品的微生物检测 溯源分析 产品污染 环境 / 过程细菌与药品细菌的比较 结论 实验污染 重试 污染源排除
保证药品微生物检验结果可靠的有效途径 药品微生物实验 过程微生物信息的全面性 环境微生物的监测 微生物鉴定结果的准确性 药品的微生物检测 环境微生物与阳性结果的比较 结论
各类常见微生物的菌落特征 微生物类别菌落特征 主要特征 细胞 菌落 形态特征 相互关系 单细胞微生物 菌丝状微生物 细菌酵母菌放线菌霉菌 小而均匀 个别有芽孢 单个分散或按一定方式排列 大而分化细而均匀粗而分化 单个分散或假丝状 丝状交织 丝状交织 含水情况很湿或较湿较湿干燥或较干燥干燥 外观特征 小而突起或大而平坦 大而突起 小而紧密 大而疏松或大而致密 菌落透明度透明或稍透明稍透明不透明不透明 参考特征 菌落与培养基结合度不结合不结合牢固结合较牢固结合 菌落的颜色多样单调十分多样十分多样 菌落正反面颜色差别相同相同一般不同一般不同 细胞生长速度一般很快较快慢一般较快 气味一般有臭味多带酒香常有泥腥味霉味
革兰染色
革兰染色原理 第一步 : 结晶紫使菌体着上紫色 第二步 : 碘和结晶紫形成脂溶性大分子复合物, 分子大, 能被细胞壁阻留在细胞内 第三步 : 酒精脱色, 细胞壁成分和构造不同, 出现不同的反应 第四步 : 番红复染, 增加脱色菌与背景的反差并区别于未脱色菌 G +菌 : 细胞壁厚, 肽聚糖网状分子形成一种透性障, 当乙醇脱色时, 肽聚糖脱水而孔障缩小, 故保留结晶紫 - 碘复合物在细胞膜上 呈紫色 Gˉ 菌 : 肽聚糖层薄, 交联松散, 乙醇脱色不能使其结构收缩, 其脂含量高, 乙醇将脂溶解, 缝隙加大, 结晶紫 - 碘复合物溶出细胞壁, 番红复染后呈红色
实验室常用细菌革兰染色结果 G - 杆菌代表菌种 : 铜绿假单胞菌 (Pseudomonas aeruginosa) 大肠埃希菌 (Escherichia coli) G + 芽孢杆菌代表菌种 : 枯草杆菌 (Bacillus subtilis) G + 球菌代表菌种 : 金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)
KOH 拉丝试验 原理 : 革兰阴性细菌的细胞壁在稀碱溶液中易于破裂, 释放出未断裂的 DNA 螺旋, 使氢氧化钾菌悬液呈现粘性, 可用接种环搅拌后拉出粘丝来, 而革兰阳性细菌在稀碱溶液中没有上述变化 方法 : 取 1 滴 40g/L 氢氧化钾水溶液 ( 应新鲜配制 ) 于洁净玻片上, 取新鲜菌落少许, 与氢氧化钾水溶液搅拌混匀, 并每隔几秒钟上提接种环, 观察能否拉出粘丝 用接种环拉出粘丝者为阳性, 仍为混悬液者为阴性 主要用于革兰阴性菌与易脱色的革兰阳性菌的鉴别 大多数革兰阴性菌于 5~10s 内出现阳性反应, 有的则需 30~45s, 假单胞菌 无色杆菌 黄杆菌 产碱杆菌 莫拉菌等大多数在 10s 内呈阳性, 不动杆菌 莫拉菌反应较慢, 大多数菌株在 60s 内出现阳性, 而革兰阳性菌在 60s 以后仍为阴性
革兰阳性 阴性菌各自下分
革兰阳性 阴性菌各自下分
细菌鉴定技术 表型鉴定 营养物质代谢试验 碳源和氮源利用试验 各种酶类试验 API 试验条 各种自动鉴定系统 表观生物学活性 基因型鉴定 16SrRNA 分型 核糖体分型 脉冲场电泳 核酸物质 色谱光谱 傅里叶变换红外技术 全细胞信息
细菌的鉴定流程
表型鉴定与基因型鉴定 需要大量纯的单克隆培养物细胞 微生物计数培养中, 细胞的恢复及鉴定受到培养时间的局限, 甚至有些环境中的微生物并不能用常规微生物生长培养基恢复 从初始培养物中刚分离出的, 受损的次代培养物可能不能进行完整的基因表达 基因型和表型的差异相对比较少见, 且基因型的明显差异说明其并非同种或同属 理论上, 基因型微生物鉴定更可靠 ( 微生物核酸序列高度保守 )
基因型鉴定的局限性 鉴定系统同样不能鉴定所有的微生物 需要昂贵的分析设备及耗材 通常仅有关键的微生物调查才会应用 仅凭基因型数据作出的决定, 对于考虑微生物特征, 测试历史及微生物来源, 是没有意义的 当今伯杰氏手册中的分类学手段基于遗传物质并非遵循表观水平, 导致一些已知的微生物分类学发生改变及重命名 ( 黑曲霉 ATCC16404)
药品微生物实验室微生物鉴定宗旨 通过整合, 使用多层面的信息, 如微生物特征确定, 表型及基因型数据, 及微生物来源, 将多相分类学的概念应用于微生物鉴定 建立内部数据库, 忠实记录鉴定结论 无论哪种方式, 在确认过程中, 应根据供应商或药典的建议, 使用适当的质控菌株
利巴韦林注射液 双黄连注射液 结果判断示例 DuPont RiboPrinter 基因指纹分析 编号 生化鉴定 走廊 1 B.pumilus 走廊 2 M.luteus 走廊 3 / 无菌室 4 C.urealyticum 无菌室 5 K.kristinae 无菌室 6 C.urealyticum C1524-F S.caprae C1524-B S.caprae C1525-B1-1 S.warneri C1525-B1-2 S.epidermidis C1525-B2 S.warneri C1525-F1 S.warneri C1525-F2-1 S.capitis C1525-F2-2 S.epidermidis C1526-B1 C.urealyticum C1526-B2 S.warneri C1526-F1 S.epidermidis C1526-F2 S.haemolyticus 菌株 16sRNA 鉴定 可信度 C1524-F S. haemolyticus 99% C1524-B S. haemolyticus 98% C1526-F2 S. haemolyticus 100% FTIR 相似性分析
总结 药品微生物检查的过程控制环境保障培养基保障操作保障 针对微生物结果的溯源性调查 过程微生物信息的全面性 微生物鉴定结果的准确性
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