染料木素 MePEG-PLGA 共聚物胶束的制备及其药动学研究 何礼 1, 韩瑞伟 1, 唐晓飞 2, 李明 3, 刁磊 4, 韩伟 1, 阎雪莹 1* (1. 黑龙江中医药大学药学院, 哈尔滨 150040;2. 黑龙江省 哈尔滨市香坊区疾病预防控制中心, 哈尔滨 150031;3. 四川大学生物材料工程研究中心, 成都 610064;4. 吉林农业科技学院, 长春 132101) 摘要 : 目的制备染料木素 (GEN)MePEG-PLGA 共聚物胶束, 考察其理化性质 初步稳定性及静脉给药后大鼠体内的药动学行为 方法采用改良的自乳化溶剂挥发法制备胶束, 考察其形态 包封率 载药量 粒径和 Zeta 电位 ; 采用动态膜透析技术考察其释药行为, 并对其释药规律进行拟合 ; 将胶束冻干品置于 4 冰箱中保存, 分别于放置 1 d 10 d 1 个月 3 个月 6 个月后取样, 考察其包封率和载药量变化 ; 对健康大鼠尾静脉注射 GEN 胶束, 采用 HPLC 测定 GEN 在大鼠体内的血药浓度, 采用 DAS 2.0 软件处理血药浓度数据,SPSS 17.0 软件对主要药动学参数进行统计学分析 结果制备所得胶束的包封率为 (84.43±2.93)%, 载药量为 (2.63±0.91)%, 粒径为 (63.75±4.12)nm;GEN 胶束的释药行为最符合 Weibull 模型 ;GEN 胶束冻干品 6 个月渗漏率为 2.45%, 载药量下降 0.18%; 大鼠尾静脉注射 GEN 胶束和 GEN 乳剂 40 mg kg 1 后, 主要药动学参数 AUC 0-t 分别为 (99.46±4.77)mg L 1 h 和 (57.51±1.37)mg L 1 h,t 1/2 分别为 (7.48±1.15)h 和 (4.95±1.15)h, C max 分别为 (16.03±1.20)mg L 1 和 (16.73±1.10)mg L 1,CL 分别为 (0.36±0.02)L h 1 kg 1 和 (0.67±0.02)L h 1 kg 1 结论制备所得的 GEN 胶束形态规整, 粒径分布狭窄, 包封率较高, 具有一定的缓释特征, 稳定性良好, 并且明显改变了 GEN 的药动学行为, 使其消除减慢, 同时提高了药物的生物利用度 关键词 : 染料木素 ; 胶束 ; 体外释放 ; 稳定性 ; 药动学中图分类号 :R943.4 文献标志码 :A 文章编号 :1007-7693(2012)06-0477-06 Preparation of Genistein-loaded MePEG-PLGA Nano-micelle and its Pharmacokinetics in Rats HE Li 1, HAN Ruiwei 1, TANG Xiaofei 2, LI Ming 3, Diao Lei 4, HAN Wei 1, YAN Xueying 1* (1.College of Pharmacy, Heilongjiang University of Chinese Medicine, Harbin 150040, China; 2.Xiangfang Center for Disease Control and Prevention of Harbin, Harbin 150031, China; 3.Engineering Research Center in Biomaterials, Sichuan University, Chengdu 610064, China; 4.Jilin Agricultural Science and Technology College, Changchun 132101, China) ABSTRACT: OBJECTIVE To prepare genistein-loaded MePEG-PLGA nano-micelle and study its physicochemical properties. To investigate the release characterization in vitro and study the pharmacokinetic characteristics of genistein nano-micelle after single dose in rats. METHODS Genistein nano-micelle was prepared by modified spontaneous emulsification solvent diffusion method, then its physicochemical properties including entrapment efficiency, drug loading, average diameter and Zeta potential were studied. The in vitro release was studied by dynamic dialysis method and the release behavior was fitted with different equations. Put freeze-dried GEN-loaded micelle at 4 for six months to investigate the changes of the entrapment efficiency and drug loading. The plasma concentrations of Genistein at different time were determined by a developed and validated HPLC method after i.v. administration. The pharmacokinetic parameters were acquired with DAS 2.0 software and analyzed using SPSS 17.0 statistic software. RESULTS The entrapment efficiency, drug loading and average diameter of the prepared nano-micelle were (84.43±2.93)%, (2.63±0.91)% and (63.75±4.12)nm, respectively. The release behavior of the lyophilized Gen nano-micelle was well-fitted to Weibull equation. The entrapment efficiency and drug loading had no significant difference after stored at 4 for six months. After i.v. administration of Genistein nano-micelle and Genistein emulsion 40 mg kg 1, the main pharmacokinetie parameters were as follows: AUC 0-t were (99.46±4.77)mg L 1 h and 基金项目 : 黑龙江省教育厅研究生创新科研项目 (YJSCX2011-459HLJ) 作者简介 : 何礼, 男, 硕士生 Tel: (0451)82195748 E-mail: heli_stu@126.com E-mail: yanxuey@yahoo.com.cn * 通信作者 : 阎雪莹, 女, 博士, 教授 Tel: (0451)82195748 中国现代应用药学 2012 年 6 月第 29 卷第 6 期 Chin JMAP, 2012 June, Vol.29 No.6 477
(57.51±1.37)mg L 1 h, t 1/2 were (7.48±1.15)h and (4.95±1.15)h, C max were (16.03±1.20)mg L 1 and (16.73±1.10)mg L 1, CL were (0.36±0.02)L h 1 kg 1 and (0.67±0.02)L h 1 kg 1. CONCLUSION The genistein nano-micelle was spherical with narrow size distribution and high entrapment efficiency, the genistein nano-micelle possess the properties of sustained release with good stability. Compared with reference injection, the nano-micelle can significantly improve the pharmacokinetic behavior of genistein. KEY WORDS: genistein; nano-micelle; release in vitro; stability; pharmacokinetics 聚合物胶束是一种由两亲嵌段共聚物在适当条件下自发形成的核 - 壳纳米载体 [1] 由于其抗血液稀释能力突出 具备长循环特性 能极大程度增加难溶性药物溶解度且对药物具有缓控释作用 对肿瘤部位渗透能力强等独特优势在近十年来受到了广泛的关注 染料木素 (genstein,gen) 是从豆科植物槐角 Sophora japonica L. 中提取得到的一种异黄酮类化合物 大量研究证实 GEN 具有雌激素作用 抗氧化作用以及抑制拓扑异构酶活性 抑制蛋白酪氨酸激酶活性 诱发细胞程序性死亡 抑制血管生成等作用 [2], 目前 1 类新药 染料木素胶囊 已进入 Ⅱ 期临床研究, 是一种很有潜力的癌症化学预防剂和治疗剂 然而 GEN 在水中几乎不溶, 直接口服生物利用度低, 限制了其临床应用 本实验以具有很好生物相容性和应用安全性的 MePEG-PLGA 为载体制备 GEN 共聚物胶束, 以提高药物生物利用度, 并增加其靶向性, 提高疗效 同时考察其体外释放 初步稳定性和静脉注射后在大鼠体内的药动学行为, 为临床用药和新剂型研发提供理论依据 1 仪器与材料 1.1 仪器 TECNAIG2 透射电子显微镜 ( 荷兰 Philips 公司 ) ; Mastersizer 2000 激光粒度分析仪 ( 英国 Malvern 公司 );LC-2010AHT 高效液相色谱仪 ( 日本 Shimadzu 公司 );BT25S 电子天平 ( 德国 Sartorius 公司 );Scientz-IID 超声波细胞破碎机 ( 宁波新芝生物科技股份有限公司 ) 1.2 材料 GEN 对照品 ( 中国药品生物制品检定所, 含量 98%, 批号 :111704-200501);GEN( 西安小草植物科技有限责任公司, 含量 :98.19%, 批号 : XC100310);MePEG-PLGA[ 济南岱罡生物科技有限公司,Mr(MePEG)=4 000, Mr(MePEG) Mr(PLGA)=1 3,Mr(LA) Mr(GA)=75 25]; 透析袋 ( 美国 Sigma 公司,MW:8 000~14 400); Poloxamer188( 德国 BASF 公司 ); 染料木素静脉注射乳剂 ( 自制, 批号 :20110712); 甲醇为色谱纯, 水为去离子水, 其余试剂均为分析纯 清洁级 Wistar 大鼠 12 只, 各半, 体质量 (200±20)g, 黑龙江中医药大学 GLP 实验室提供, 实验动物许可证号 :SCXK( 黑 )2008-0004 2 方法 2.1 GEN 胶束的制备采用改良的自乳化溶剂扩散法 (modified- SESD) [3] 制备胶束, 分别称取 21 mg GEN,110 mg MePEG-PLGA 置于锥形瓶中, 加入丙酮 乙醇 = 3 2 混合有机溶剂 10 ml, 水浴 50 使其完全溶解 在 500 r min 1 的机械搅拌条件下, 将所得混合溶液以 3 滴 s 1 的速度滴入预先配好的 20 ml 含 1% Poloxamer 188 的水溶液 滴定结束后继续搅拌 10 min, 将所得产物在 40 下减压除去有机溶剂, 0.45 μm 微孔滤膜过滤, 加 3% 海藻糖混匀, 冻干后保存 2.2 GEN 胶束的形态观察取 GEN 胶束冻干品适量, 加水轻微振摇分散后滴加在铜网上,2% 磷钨酸钠溶液负染, 在透射电镜下观察粒子形态, 见图 1 由图可见, 胶束制成冻干针剂后, 仍为球形实体, 形态较圆整, 分布较均匀 100nm 图 1 GEN 胶束的透射电镜照片 ( 43 000) Fig 1 Transmission electronic micrograph of GEN micelle ( 43 000) 478 Chin JMAP, 2012 June, Vol.29 No.6 中国现代应用药学 2012 年 6 月第 29 卷第 6 期
2.3 GEN 胶束的粒径及 ZETA 电位 GEN 胶束的粒径和 ZETA 电位测定结果见图 2 由图可知,GEN 胶束的粒径大多分布在 50~ 100 nm, 平均粒径为 63.7 nm, 多分散指数 PDI 为 0.129, 表明胶束粒径分布较窄 ;Zeta 电位为 25.1 mv, 表明胶束比较稳定 图 2 Fig 2 GEN 胶束冻干针剂的粒度分布及 Zeta 电位图 Particle diameter and Zeta potential of GEN micelle 2.4 GEN 胶束的包封率和载药量测定 采用反相 HPLC 测定 GEN 含量 色谱条件 : Diamonsil C 18 色谱柱 (4.6 mm 250 mm,5 μm), 甲醇 - 水 (60.. 40), 流速为 1 ml min 1, 检测波长为 260 nm, 进样量 10 L 在此色谱条件下, 以 GEN 峰面积 (Y) 对其浓度 (X) 进行线性回归, 所得标准曲 线方程为 :Y=124 316X 38 008(r=0.999 9), 日内 日间精密度 RSD<3%, 回收率 >98%, 表明该法满 足分析要求 将 4 ml GEN 胶束溶液装入已处理后的透析 袋中, 将袋口扎紧, 混悬在盛有 86 ml 释放介质 的小杯中, 将杯放到恒温水浴振荡器 37 水浴中 恒速 (100 r min 1 ) 振摇, 在 360 min 时, 精密吸取 透析外液 2 ml, 处理后按上述色谱条件测定胶束 中游离的 GEN 量 同时精密吸取相同体积的 GEN 胶束溶液, 精密加入 8 ml 乙腈, 涡旋 1 min,0.45 µm 微孔滤膜过滤后进行 HPLC, 测定胶束中所含 GEN 总量 (W 总 ), 按下式计算载药量和包封率 : ER%=(W 总 W 游离 )/W 总 100%;DL/%= (W 总 W 游离 )/ W 胶束 100%( 式中 W 总为 GEN 胶束所含 GEN 总量, W 游离为透析外液中游离的 GEN 量,W 胶束为胶束中 所载的 GEN 和辅料量总和 ), 结果见表 1 表 1 GEN 胶束的包封率和载药量 Tab 1 Entrapment efficiency and drug loading of GEN micelle 组别 No.1 No.2 No.3 x s 包封率 /% 82.27 84.14 83.53 83.31±0.95 载药量 /% 2.59 2.33 2.61 2.51±0.16 2.5 GEN 胶束的体外释放研究 取 GEN 胶束冻干品一瓶 ( 相当于 GEN 2.0 mg), 精密加入 4 ml 注射用水分散后, 转入已处理后的 透析袋中, 将袋口扎紧, 混悬在盛有 86 ml 释放 递质的小杯中, 将杯放到恒温水浴振荡器 37 水 浴中恒速以 100 r min 1 振摇 在释放开始后, 分 别于 0.25,0.5,1,2,4,6,8,10,12,24,36, 48 h 量取 1 ml 释药介质 ( 同时补加等量同温空白 介质 ), 经 0.45 μm 微孔滤膜滤过, 取续滤液进样 测定, 计算药物的累积释放率 Q(%) 精密吸取一 定量 GEN 溶液 (GEN 以释放介质为溶剂, 含量与 GEN 胶束冻干品相当 ), 置透析袋内, 同法试验 取样时间为 5,10,20,30,45,60,90,120 min, 计算累积释放率 Q(%), 绘制体外释放曲线, 结果 见图 3 图 3 GEN 和 GEN 胶束的体外释放曲线 Fig 3 The release curve of GEN and GEN namo-micelle 由结果可知,GEN 原料药释放较快,2 h 基本 释放完全, 而 GEN 胶束前期释药较快, 后期释放 较慢, 相比 GEN 原料药具有明显的缓释效应 分 别采用一级动力学方程 Higuchi 方程 Niebergull 平方根定律 Hixcon-crowell 立方根定律 Ritger- peppas 方程 Weibull 方程对 GEN 胶束各时间点 的累积释药百分率进行拟合, 求出其回归方程, 中国现代应用药学 2012 年 6 月第 29 卷第 6 期 Chin JMAP, 2012 June, Vol.29 No.6 479
拟优合度以 R 2,AIC 值进行综合判断, 结果 Weibull 模型的拟合效果最好, 方程为 Ln[Ln(1/1 Q)]= 1.266Ln(t) 4.768,R 2 =0.954,AIC= 28.99 证实了其具有一定的缓释特性, 为进一步的体内研究提供了深层次的理论依据 2.6 GEN 胶束的初步稳定性考察将制备的 3 批 GEN 胶束冻干品置于 4 冰箱中保存, 分别于放置 1,10,30,90,180 d 后取样, 水化后测定其包封率和载药量, 考察其稳定性, 结果见表 2 结果表明,GEN 胶束冻干品 6 个月渗漏率为 2.45%, 载药量下降 0.18%, 初步稳定性考察显示其稳定性良好, 达到了预期目的 2.7 大鼠体内药动学实验 2.7.1 血浆样品的处理精密吸取 100 μl 血浆样品置 1.5 ml 离心管中, 加入 200 μl 甲醇沉淀血浆蛋白, 涡旋混合 1 min,10 000 r min 1 离心 10 min, 表 2 180 d 内胶束包封率与载药量测定结果 (n=3) Tab 2 Result of entrapment efficiency and drug loading in 180 days(n=3) 日期 /d 包封率 /% 载药量 /% 1 84.59±0.44 2.57±0.04 10 84.42±1.01 2.54±0.01 30 83.75±0.46 2.49±0.05 90 83.08±0.87 2.45±0.02 180 82.14±0.69 2.39±0.06 吸取全部上清液过微孔滤膜 (0.22 μm), 按 2.4 项下色谱条件进样测定 2.7.2 专属性考察空白血浆及静脉注射 GEN 胶束 1 h 后收集的血浆样品色谱图见图 4 从结果可知,GEN 的保留时间为 11 min, 基线噪音较小, 血浆中代谢物峰及其他内源性物质均不干扰 GEN 的测定, 说明本方法具有较高的专属性 图 4 GEN 大鼠血浆样品色谱图 A 空白血浆 ;B 血浆样品 Fig 4 The HPLC chromatogram of Genistein in rat plasma A blank plasma; B plasma sample 2.7.3 标准曲线及线性范围精密吸取大鼠空白血浆 200 μl, 分别加入不同浓度的 GEN 标准系列溶液 20 μl, 配制成相当于 GEN 血药浓度为 0.1, 0.4,2,8,24,32,40 μg ml 1 的血浆样品, 按 2.7.1 项下方法处理, 按 2.4 项下色谱条件进样测定 以血浆中 GEN 的浓度为横坐标, 峰面积为纵坐标, 进行线性回归, 得线性回归方程 : Y=90 749X+1 779,r=0.999 9 结果表明,GEN 在 0.1~40 μg ml 1 内线性良好 以 S/N=3 计, 最低检测限为 0.02 μg ml 1 2.7.4 方法学验证取低 中 高 (0.1,8,40 μg ml 1 )3 个浓度的质控样本, 每份样品连续进样 5 次, 计算日内精密度 ; 连续 5 d 相同条件进样, 计算日间精密度 结果表明, 方法的日间 日内 精密度 RSD 均 <5%,GEN 在线性范围内的提取回收率为 90.69%~94.23%, 方法回收率为 97.53%~ 105.13%, 符合测定要求 2.7.5 药动学实验 [4] 2.7.5.1 GEN 静脉注射乳剂的制备精密称取大豆卵磷脂 0.60 g 注射用大豆油 5 g 于烧杯中, 60 左右恒温搅拌约 10 min, 加入 GEN 500 mg, 加热搅拌使温度达到 70 并保持恒定 精密称取医用甘油 1.25 g 和 Poloxamer 1 881.00 g 于烧杯中, 加入 45 ml 注射用水, 加热搅拌使之澄清, 继续加热搅拌使温度达到 70 并保持恒定 在 70 恒定温度下, 将油相缓慢加入到水相中并不断搅拌, 继续搅拌 10 min, 制得初乳 初乳用超声波细胞粉碎机冰水浴探头超声 15 min( 超声 2 s, 间歇 480 Chin JMAP, 2012 June, Vol.29 No.6 中国现代应用药学 2012 年 6 月第 29 卷第 6 期
2 s), 功率 750 W, 制得 GEN 静脉注射乳剂 上 述方法制得的 GEN 静脉注射乳剂呈乳白色, 外观 均一, 未出现挂壁现象, 没有粒子及沉淀析出,4 冰箱冷藏保存, 半个月内未见有分层和絮凝现象, 状态良好 通过透射电镜 (TEM) 观察为圆形球状, 粒径均一, 用激光散射粒径分布及 Zeta 电位测定仪测定其平均粒径为 232 nm, Zeta 电位为 - 21.1 mv, 载药量为 1 mg ml 1, 离心加速试验 (4 000 r min 1 ) 表明稳定性良好 2.7.5.2 实验设计将大鼠随机分为 2 组, 每组 6 只, 各半 实验前禁食 12 h, 自由饮水 根据文献 [5-6] 及预试验, 确定给药剂量分别为 GEN 乳剂组 (40 mg kg 1 ) GEN 胶束组 (40 mg kg 1, 取 GEN 胶束冻干品两瓶, 相当于 GEN 4.0 mg, 临用前用 1 ml 注射用水分散 ), 各组称重后, 尾静脉注射给药, 于给药后 0,0.083,0.17,0.5,1,2, 4,6,8,10,12,24 h 从眼眶后静脉丛取血约 0.4 ml 将所取血样置 1.5 ml 肝素化离心管中,10 000 r min 1 离心 10 min, 取上清液 100 µl, 按 2.7.1 项下方法处理, 测定 GEN 含量 GEN 乳剂组和胶束组的平均药 - 时曲线见图 5 由结果可知, 与 GEN 乳剂组相比,GEN 胶束组的血药浓度 - 时间曲线更平稳, 除初始血药浓度值显著降低外,GEN 胶束组在各时间点的血药浓度值均明显高于乳剂组, 并且在 24 h 时仍有较高的浓度分布 由于肿瘤部位的细胞供血充足, 其通透性处于亢进状态, 药物在血液中的浓度越高, 维持时间越长, 药物和肿瘤组织接触的机会就越多, 越有利于药物被输送至肿瘤组织, 因此 GEN 胶束有助于提高 GEN 的抗癌疗效 图 5 GEN 乳剂组和胶束组的平均血药浓度 - 时间曲线 (n=6) Fig 5 The concentration-time curve of GEN in rat plasma after single iv GEN emulsion and GEN micelle(n=6) 采用 DAS2.1 软件进行非房室模型拟合并计算药动学参数, 达峰浓度 (C max ) 和达峰时间 (T max ) 采用实测值, 采用梯形法计算药时曲线下面积 (AUC 0 t ), 采用 SPSS 17.0 软件对 GEN 乳剂组和胶束组的主要药动学参数 (AUC 0 t AUC 0 t 1/2 CL MRT 0 t ) 进行 t 检验, 结果见表 3 结果表明, 在相同给药剂量下,GEN 乳剂组和胶束组的 AUC 0 t AUC 0 t 1/2 CL 均存在显著差异 (P<0.01) 胶束组具有更大的药时曲线下面积 (AUC 0 t ), 为乳剂组的 1.73 倍 ; 胶束组的消除半衰期 (t 1/2 ) 为乳剂组的 1.71 倍 ; 胶束组有较低的血浆清除率 (CL), 仅为乳剂组的 0.54 倍, 同时胶束组的平均驻留时间 (MRT 0 t ) 延长 (P<0.05) 表 3 大鼠尾静脉注射 GEN 乳剂和胶束的药动学参数比较 (n=6) Tab 3 Comparison of pharmacokinetic parameters in rats between GEN emulsion and GEN micelle after iv administration(n=6) 参数 GEN 乳剂 GEN 胶束 AUC 0 t /mg L 1 h 57.508±1.367 99.461±4.774 1) AUC 0 /mg L 1 h 59.505±2.184 110.817±5.697 1) MRT 0 t /h 5.673±0.139 7.172±0.19 2) MRT 0 /h 6.531±0.566 10.025±1.114 t 1/2 /h 4.949±0.793 8.484±1.15 1) T max /h 0.083±0 0.083±0 CL/L h 1 kg 1 0.673±0.024 0.362±0.019 1) VL kg 1 4.787±0.626 3.896±0.54 C max /mg L 1 16.725±1.102 16.039±1.204 注 : 与 GEN 乳剂组比较, 1) P<0.01, 2) P<0.05 Note: Compared with GEN emulsion, 1) P<0.01, 2) P<0.05 3 讨论 GEN 在水中几乎不溶, 从而使其应用和研究都受到限制, 因此首先要设法改善药物的溶解性, 提高其生物利用度 药剂学中增溶的经典方法主要是使用混合溶剂或增溶剂等, 但这些或是增溶效果不理想, 或是具有较大毒性 如增溶环孢素 A 和紫杉醇的聚氧乙烯蓖麻油 EL 可引起过敏 高血压症以及神经毒性等副反应 [7], 常用的表面活性剂 Tween-80 可引起过敏 溶血等不良反应 [8], 胆酸盐对粘膜具有刺激性, 注射时引起疼痛和溶血 聚合物胶束作为一种极具开发潜力的药物载体, 基本上克服了以上缺点, 紫杉醇胶束制剂 Genexol-PM 中国现代应用药学 2012 年 6 月第 29 卷第 6 期 Chin JMAP, 2012 June, Vol.29 No.6 481
的 Ⅱ 期临床研究结果显示,69 例中仅有 4 例出现了过敏性反应 [9] 改良的自乳化溶剂扩散法 (modified-sesd) 由 Murakami 等第一次报道用于纳米粒子的制备中, 有机相采用丙酮与乙醇的混合溶液, 取代了 SESD 方法中常用的二氯甲烷 丙酮混合溶液, 其中有机相中丙酮与乙醇的比例对乳滴大小影响显著, 这种方法克服了制备过程中使用有毒有机溶剂 ( 如二氯甲烷 氯仿等 ) 的缺点, 并且不需高能设备 ( 如均质器 超声等 ), 为大规模生产提供了可能 然而, 由于原方法所使用的聚乙烯醇 (PVA) 可能存在一定致癌性, 且较难从纳米粒子表面去除, 为此本课题对这一方法进行了进一步改进, 以安全性高的 Poloxamer 188 代替 PVA, 所制备的胶束表面光滑, 形态圆整, 且具有较高的包封率和较小的粒径 本课题制备所得胶束包封率达到 80% 以上, 但载药量相对偏低, 其原因可能是较小的粒径限制了疏水核中包载的药量, 因此有必要对其进一步的研究以获得更高包封率和载药量的 GEN 胶束 有文献报道 [10-11], 这一问题可通过将药物与 PLGA 进行共价键结合来解决, 因此本课题将进一步尝试将药物键合至 PLGA 末端的羧基上, 然后再制备 GEN 胶束 血液样品含有大量的蛋白质, 直接进样会使色谱柱阻塞, 柱压升高, 因此需要进行适当的前处理去除蛋白 目前常用的方法有蛋白沉淀法 (protein precipitation,ppt), 液 - 液萃取法 (LLE), 固相萃取法 (solid-phase extraction,spe) 等 笔者首先尝试使用甲醇和乙睛做为沉淀试剂的 PPT 法, 发现使用甲醇作为沉淀剂可得到较好效果, 并且 PPT 法简单易行, 因此选择甲醇作沉淀剂去除蛋白质 由于国内外现尚无 GEN 注射制剂上市, 且 GEN 在水中几乎不溶, 无法直接溶解在生理盐水中进行大鼠的尾静脉注射, 根据参比制剂选择原则, 所以实验中将 GEN 制成乳剂作为参比制剂与 GEN 胶束冻干针剂进行比较 与 GEN 乳剂相比, 胶束组的消除半衰期 (t 1/2 ) 和平均驻留时间 (MRT 0 t ) 显著延长, 这主要是因为将亲水性的 PEG 通过酯键共价连接到 PLGA 上, 形成 PEG 包衣的纳米粒子, 可有效避免网状内皮吞噬系统 (reticuloendothelialsystem,res) 的识别和吞噬, 延长体内循环时间, 达到长效缓释的作用 另外, 静脉注射 GEN 胶束的 AUC 大于乳剂组的 AUC, 也是其血浆清除率减小的结果 REFERENCES [1] RONG L, ZHANG Y T, HU Q H. Progress in the research of natural polymer micelle [J]. Chin J Mod Appl Pharm( 中国现代应用药学 ), 2010, 27(13): 1182-1187. [2] WU L P, LI Y S, LIU Y P. Advances in mechanisms of anti-cancer effects by genistein [J]. Int J Genetics( 国际遗传学杂志 ), 2009, 32(1): 47-50. [3] MURAKAMI H, KOBAYASHI M, TAKEUCHI H, et a1. Further application of a modified spontaneous emulsification solvent diffusion method to various types of PLGA and PLA polymers for preparation of nanoparticles [J]. Powder Tech, 2000, 107(1/2): 137-143. [4] YANG X L, WANG D K, KONG L W, et al. Preparation and characteriztion of cisplatin emulsions for injection [J]. Chin J New Drugs( 中国新药杂志 ), 2007, 16(17): 1376-1379. [5] MICHAEL MCCLAIN R, WOLZ E, DAVIDOVICH A, et al. Acute, subchronic and chronic safety studies with genistein in rats [J]. Food Chem Toxicol, 2006, 44(1): 56-80. [6] RUAN L P, YU B Y, ZHU D N, et a1. Studies on the relationship between the intestinal absorption and in vivo activity of genistein [J]. Chin J Nat Med( 中国天然药物 ), 2006, 4(4): 278-281. [7] GELDERBLOM H, VERWEIJ J, NOOTER K, et al. Gremophor EL:the drawbacks and advantages of vehicle selection for drug formulation [J]. Eur J Cancer, 2001, 37(31): 1590-1598. [8] TEN TIJE A J, VERWEIJ J, LOOS W J, et al. Pharmacological effects of formulation vehicles: implications for cancer chemotherapy [J].Clin Pharmacokinet, 2003, 42(7): 665-685. [9] KIM D W, KIM S Y, KIM H K, et al. Multicenter phase II trial of Genexol-PM, a novel Cremophor-free, polymeric micelle formulation of paclitaxel, with cisplatin in patients with advanced non-small-cell lung cancer [J]. Ann Oncol, 2007, 18(12): 2009-2014. [10] LI X F, MA Y J, ZHANG X, et al. Preparation of fluorescent probe coumarin-6 loaded PLGA nanoparticles [J]. Chin J Mod Appl Pharm( 中国现代应用药学 ), 2011, 28(8): 740-744. [11] YOO H S, PARK T G. Biodegradable polymeric micelles composed of doxorubicin conjugated PLGA-PEG block copolymer [J]. J Controlled Release, 2001, 70(1-2): 63-70. 收稿日期 :2011-09-27 482 Chin JMAP, 2012 June, Vol.29 No.6 中国现代应用药学 2012 年 6 月第 29 卷第 6 期