中国农业科学 2014,47(12):2335-2347 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2014.12.006 灰葡萄孢蚕豆分离物的遗传多样性 黄燕 1,2, 朱振东 1, 段灿星 1, 武小菲 1, 东方阳 2 ( 1 中国农业科学院作物科学研究所 / 国家农作物基因资源与基因改良国家重大科学工程, 北京 100081; 2 河北科技师范学院生命科技学院, 河北昌黎 066600) 摘要 : 目的 灰葡萄孢是引起蚕豆赤斑病 花腐病和荚腐病的重要病原菌, 其为包含两个称作类群 I 和类群 II 的复合种, 具有高度的遗传变异 然而, 危害蚕豆的灰葡萄孢复合种地位及遗传特征尚未被研究 论文旨在对中国 6 个不同地理来源蚕豆灰葡萄孢复合种的地位进行鉴定, 研究其遗传多样性及群体间的遗传分化, 为探明病害流行规律及制定防治策略提供依据 方法 在 PDA 培养基上观察分离物形态特征 用 Flipper 和 Boty 特异性引物检测分离物的转座子基因型 葡萄孢复合种所属类群通过 Bc-hch 基因的 PCR 扩增酶切多态性鉴定,SSR 标记分析解析其遗传多样性和遗传分化 结果 100 个灰葡萄孢分离物均为灰葡萄孢类群 II, 共产生菌核型 菌丝型和分生孢子型 3 种类型菌落形态, 其中 76 个分离物为菌核型 92 个分离物为转座子基因型, 分别含有 Boty Flipper 和 Boty+Flipper, 其中仅含 Boty 分离物最多, 占检测分离物的 61.0% 江苏分离物只含有单一 Flipper, 重庆 四川 甘肃和河北分离物只含有单一 Boty 基于 SSR 分析,100 个分离物被鉴定为 92 个多位点基因型,6 个群体的平均基因多样性指数和平均基因型多样性指数分别为 0.5140 和 0.9982; 分子方差分析 (AMOVA) 发现群体内遗传变异占总变异的 86.70% 标准关联指数 rd 值范围为 0.0312 0.1261, 平均 0.0491; 遗传固定指数 (FST) 在 0.0085 0.2650, 平均为 0.1330 UPGMA 聚类将 100 个分离物划分为 10 个遗传组, 大部分遗传组包含不同地理来源的分离物 贝叶斯 (Bayesian) 推理分析将 92 个多位点基因型分为两个遗传类群, 其中重庆和四川群体聚为一类, 青海群体单独聚为一类, 而江苏 河北和甘肃群体由两个不同遗传类群组成 结论 源于蚕豆的灰葡萄孢群体由灰葡萄孢类群 II 组成, 分离物的菌落形态以菌核型为主, 绝大多数分离物为转座子基因型, 但转座子基因型分布明显存在地域差异 调查的 6 个群体都具有高水平的遗传多样性, 遗传变异主要来源于群体内, 生殖方式以有性繁殖为主, 大部分群体间存在中等到大的遗传分化 关键词 : 蚕豆 ; 赤斑病 ; 灰葡萄孢 ; 转座子 ; 遗传多样性 Genetic Diversity of Botrytis cinerea Isolates from Broad Bean HUANG Yan 1, 2, ZHU Zhen-dong 1, DUAN Can-xing 1, WU Xiao-fei 1, DONGFANG Yang 2 ( 1 Institute of Crop Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences/National Key Facility for Crop Gene Resources and Genetic Improvement, Beijing 100081; 2 College of Life Science and Technology, Hebei Normal University of Science & Technology, Changli 066600, Hebei) Abstract: Objective Botrytis cinerea is one of the most important pathogens causing chocolate spot, blossom blight and pod rot in broad bean. B. cinerea is a species complex that comprises two cryptic species, Group I and Group II, and exhibits a great morphological and genetic diversity. However, the status of B. cinerea species complex from broad bean as well as their genetic characteristics have been poorly understood. Therefore, this study aims to determine the status and investigate the genetic diversity and genetic differentiation of isolates of B. cinerea complex from broad bean obtained from six different geographic regions. 收稿日期 :2013-11-06; 接受日期 :2013-12-09 基金项目 : 现代农业产业技术体系建设专项 (CARS-09) 联系方式 : 黄燕,E-mail:hyhchlhqy@163.com 通信作者朱振东,Tel:010-82109609;E-mail:zhuzhendong@caas.cn
2336 中国农业科学 47 卷 Method The B. cinerea isolates were observed for cultural characteristics on potato dextrose agar. Transposons types of the isolates were detected using Flipper- and Boty-specific primers. Group determination of the isolates was analyzed by PCR-RFLP of Bc-hch gene, and their genetic characteristics was analyzed using SSR markers. Result All the 100 isolates were identified as B. cinerea group II. Three colony types, including mycelial type, sclerotial type and conidial type, were produced, and 76 isolates belonged to sclerotial type. Three transposon genotypes were identified in 92 isolates, which contained Boty-only, Fliper-only and Boty + Fliper genotypes. The most prevalent transposon genotype was Boty-only which was detected in isolates from Chongqing, Sichuan, Gansu and Hebei, while genotype Fliper-only was only found in isolates from Jiangsu. SSR analysis detected 92 multilocus genotypes (MLGs) among the 100 isolates with averaged gene and genotypic diversity of 0.5140 and 0.9982, respectively. Analysis of AMOVA revealed that genetic variation within populations accounted for 86.70% of the total genetic variation. The standardized index of association (r D ) was estimated to range from 0.0312 to 0.1261 with the average value of 0.0491. In all comparsions, the values of fixation index (F ST ) ranged from 0.0085-0.2650 with the average value of 0.1330. All 100 isolates were divided into 10 genetic groups by UPGMA clustering analysis, and most of genetic groups included isolates from different geographic regions. In addition, two genetic groups were inferred in 92 MLGs by Bayesian analysis, and both populations from Chongqing and Sichuan belonged to one group, the population from Qinghai belonged to the other group, while popultions from Jiangsu, Hebei and Gansu were admixture of two genetic groups. Conclusion The populations of B. cinerea complex from broad bean made up of only B. cinerea group II. The sclerotial type was main colony morphology. Most of the isolates belonged to transposon genotypes whose distribution existed distinct geographic difference. Great genetic diversity was found in all six populations, and genetic variation mainly presented within populations. Sexual reproduction was the main mode of reproduction. Moderate to large genetic differentiation was detected among most populations. Key words: Vicia faba; chocolate spot; Botrytis cinerea; transposon; genetic diversity 0 引言 研究意义 蚕豆是重要的食用豆类作物之一, 富含蛋白质, 作为粮食 蔬菜和饲料在世界各地广泛种植 [1] 中国是世界上蚕豆种植面积最大 总产量最高的国家 据世界粮农组织 (FAO) 统计,2011 年中国干蚕豆生产面积为 0.92 万 hm 2, 总产量 155 万 t, 分别占世界生产总面积和总产量的 39.10% 和 38.44% 在蚕豆生产中, 赤斑病是蚕豆最重要的病害之一 [2] 该病在中国所有蚕豆产区均有发生, 其中在长江流域及西南山区尤为严重 [3-4] 蚕豆赤斑病为葡萄孢复合体病害, 已鉴定的病原菌有 3 个葡萄孢属种 : 蚕豆葡萄孢 (Botrytis fabae) 灰葡萄孢(B. cinerea) 和拟蚕豆葡萄孢 (B. fabiopsis) [2,5-6] 虽然灰葡萄孢不是蚕豆赤斑病的主要病原菌, 但诱发的蚕豆叶斑在潮湿气候条件下可迅速扩大, 变褐, 使大部分或整个叶片很快被侵染, 导致叶片变软 变黑和枯死 [2-3] 此外, 灰葡萄孢侵染花器的能力比蚕豆葡萄孢强, 引起花和幼荚枯死 [3,5] 灰葡萄孢引起的花腐还可发展成茎腐, 最终导致整个植株死亡 前人研究进展 灰葡萄孢被称作为多面手病原菌, 能够侵染 200 多种作物, 引起许多重要作物的灰霉病, 造成重大经济损失 [7] 灰葡萄孢具有高度的表型变异 [8], 但是在自然条件下主要以分生孢子方式繁殖, 很少见有性世代, 因此在遗传水 平上一直被认为是单个无性系种 [9] 随着分子标记技 术应用, 最近一些研究证明灰葡萄孢在分子水平上不 仅具有高的遗传多样性, 而且存在不同的类群 基于 两个转座子 Boty 和 Flipper 的存在与否, 灰葡萄孢分 离物可以分为 transposa 和 vacuma 两种类型,transposa 类型分离物含有两个转座子的一个或两个,vacuma 类 型不含转座子 [10-11] 多基因谱系分析表明, 灰葡萄孢 是至少由两个称作类群 I(Group I) 和类群 II(Group II) 的同胞种组成的复合体种, 两个同胞种间不存在 基因交流 [12-13] 类群 I 的寄主范围和地理分布有限, 目前仅在法国 [12] 美国 [14] 德国 [15-16] 匈牙利 [17] 南 [18] 非等局部地区葡萄 草莓和油菜上分离到, 其分离 频率在 2.5% 15% 基于系统发育 形态学 生物学 及生态学研究结果, 类群 I 最近被鉴定为一个新的葡 萄孢种假灰葡萄孢 (B. pseudocinerea) [19] 类群 II 是 灰葡萄孢复合体的优势类群, 具有广泛的地理分布和 极宽的寄主范围 类群 II 虽然存在 transposa 和 vacuma 两种分离物类型, 但是系统发育及寄主分析不能区分 两种转座子类型分离物, 二者间也不存在基因交流的 障碍 [20] [12] Fournier 等基于与粗糙脉孢霉 (Neurospora crassa) 营养不亲和性基因 hch 同源的 Bc-hch 基因序 列差异建立了能够诊断类群 I 和类群 II 的 CAPS 标记 [16] 最近,Leroch 等在德国草莓灰葡萄孢分离物中鉴定 一个新的类群 S(Botrytis group S), 与灰葡萄孢相比,
12 期黄燕等 : 灰葡萄孢蚕豆分离物的遗传多样性 2337 该类群与蚕豆葡萄孢遗传关系更近 类群 S 主要分布于德国草莓种植区, 但在葡萄园很少见 本研究切入点 虽然灰葡萄孢对蚕豆具有重要的经济影响, 但是在世界范围内还没有灰葡萄孢蚕豆分离物遗传特征的详细报道 [21] 拟解决的关键问题 利用 SSR 标记技术对中国灰葡萄孢蚕豆分离物进行分析, 评价中国不同地区灰葡萄孢蚕豆分离物的群体遗传多样性和遗传结构差异, 以期为病害流行 有效的病害防治及管理策略的制定提供有用信息 1 材料与方法 试验于 2010 年 10 月至 2012 年 3 月在中国农业科学院作物科学研究所完成 1.1 供试菌株 100 个灰葡萄孢分离物于 2010 2011 年分别从江苏省 四川省 重庆市 河北省 青海省 甘肃省的 13 个县 ( 市 区 ) 蚕豆病株上分离 基于形态学 致病性和分子特征所有分离物被鉴定为灰葡萄孢 [5], 其中从江苏省 四川省和重庆市蚕豆秋播区获得分离物 42 个, 从河北省 青海省和甘肃省蚕豆春播区获得分离物 58 个 1.2 菌落形态观察分离物在 PDA 培养基上 20 条件下培养 3 d, 用灭菌的直径 6 mm 打孔器在菌落边缘打取菌块, 然后将菌块菌丝面朝下接种到 PDA 平板中央, 于 20 下培养,14 d 后观察分离物的培养特性, 每分离物重复 4 次 1.3 DNA 提取分离物在铺有灭菌玻璃纸的 PDA 平板上培养 3 d, 收集菌丝 基因组 DNA 提取参照 Möller 等方法 [22] 纯化的 DNA 用 TE 缓冲液 (10 mmol L -1 Tris-HCl, 1 mmol L -1 EDTA,pH 8.0) 溶解, 在 -20 保存备用 1.4 Flipper 和 Boty 转座子检测 Flipper 和 Boty 转座子分别用引物对 F300/F1550 BotyF/BotyR 进行检测 [23-24] PCR 反应体系为 20 μl: 包括 2 μl 10 PCR buffer(200 mmol L -1 Tris-HCl,200 mmol L -1 KCl, 15 mmol L -1 MgCl 2 ),0.5 μl 10 mmol L -1 dntps, 上下游引物 (10 μmol L -1 ) 各 0.5 μl, Taq DNA 聚合酶 1 U, 模板 20 ng, 水补足 20 μl PCR 扩增反应采用 touch down 程序 :95 预变性 3 min; 94 变性 30 s,54 退火 30 s,72 延伸 1 min(10 个循环, 每个循环降低 0.4 );94 变性 40 s,50 退火 40 s,72 延伸 1 min(26 个循环 ),72 延伸 10 min 用 1% 琼脂糖凝胶 ( 含 0.5 mg L -1 PCR 扩增产物 1.5 Bc-hch 序列扩增和酶切 核酸染色剂 ) 检测 利用引物对 262/520L(5 -AAGCCCTTCGATGTC TTGGA-3 /5 -ACGGATTCCGAACTAAGTAA-3 ) 对 灰葡萄孢分离物基因组 DNA 进行 PCR 扩增 [12], 扩增 出的 Bc-hch 基因片段用 Hha I 酶 (New England Biolabs,USA) 进行酶切 PCR 反应体系为 25 μl: 2.5 μl 10 PCR buffer(200 mmol L -1 Tris-HCl,200 mmol L -1 KCl,15 mmol L -1 MgCl 2 ),0.5 μl 10 mmol L -1 dntps, 上下游引物 (10 μmol L -1 ) 各 1μL,Taq 酶 1.5 U, 模板 25 ng PCR 反应程序为 :94 变性 5 min, 94 变性 30 s,50 退火 30 s,72 延伸 90 s,35 个 循环, 最后 72 延伸 10 min; 取 10 μl PCR 扩增产物 用 1% 琼脂糖凝胶电泳, 在 UV 紫外光下观察扩增结 果 限制性酶消化在 37 水浴中进行 1.5 h, 反应体系 为 20 μl, 包括 2 μl 10 NEBuffer,5 μl PCR 产物, 0.2 μl 100 BSA(10 mg ml -1 ),0.5 μl Hha I,12.3 μl 灭菌双蒸水 终止反应后, 酶切产物用 1.5% 琼脂糖凝 胶电泳, 在 UV 紫外光下观察酶切结果 1.6 SSR 分析 [25] 利用 Fournier 等设计的 9 对 SSR 引物对 100 个 灰葡萄孢分离物基因组 DNA 进行 PCR 扩增 PCR 反 应体系为 10 μl: 包括 1 μl 10 PCR buffer(200 mmol L -1 Tris-HCl,200 mmol L -1 KCl,15 mmol L -1 MgCl 2 ),0.15 μl 10 mmol L -1 dntps, 上下游引物 (10 μmol L -1 ) 各 0.15 μl,taq DNA 聚合酶 0.3 U,DNA 模板 10 ng, 水补足 10 μl PCR 反应程序为 :95 预 变性 4 min;94 变性 40 s,50 59 ( 依引物而定 ) 退火 40 s,72 延伸 1 min,36 个循环 ;72 预延伸 10 min,pcr 扩增产物用 8% 非变性聚丙烯酰胺凝胶电 泳检测,PCR 扩增至少重复 2 次 1.7 群体遗传分析 利用 PopGene1.32 进行数据分析 [26], 计算等位基 因的频率 观察等位基因数 有效等位基因数 Nei s 基因多样性和 Shannon s 信息指数 群体间的遗传相 似性系数和遗传距离 分离物的聚类分析采用非加权 类平均法 (UPGMA) [27], 聚类分析的数据运算在 NTSYS-PC2.1 上进行 [28] 利用 Arlequin3.5 软件中的 AMOVA(analysis of molecular variance) 进行分子方 差分析 [29] 基因型多样性 多位点基因型 (mutlilocus genotype, MLG) 数量 标准关联指数 (r D ) 群体间遗传固定
2338 中国农业科学 47 卷 指数 (F ST ) 和基因流 (Nm) 用 Multilocus 1.3b 软件计算 [30] 关联指数是多位点连锁不平衡的度量, 提供在一个位点享有相同等位基因的两个不同个体是否在另一个位点更可能具有相同等位基因的信息 r D 不依赖于所考虑的位点数量, 在 0( 完全随机交配 ) 和 1( 没有重组 ) 变化 遗传固定指数 (F ST ) 是依据等位基因频率获得的群体间遗传分化程度, 其中 F ST 值在 0 0.05 时群体间有小的遗传分化, 在 0.05 0.15 时群体间有中度的遗传分化, 在 0.15 0.25 时群体间有大的遗传分化, 大于 0.25 时群体间有极大的遗传分化 用 STRUCTURE v.2.3.4 对 92 个灰葡萄孢克隆矫正单倍型进行群体结构分析 [31] 基于每个等位基因的频率,STRUCTURE 利用贝叶斯 (Bayesian) 推理方法将个体指派到 K 个组群 STRUCTURE 进行的所有分析采用假设的等位基因频率相关和混合模型 对于每组数据, 在进行 500 000 次初始运算后, 马尔科夫链蒙特卡洛 (Markov chain MonteCarlo,MCMC) 运算重复 500 000 次 组群数目 (K) 设定为 1 15, 每个组数据运行 10 次以确定每个假设组群 (K) 真数的后验概率 (posterior probability)lnp(d) 变异水平, 再根据 Evanno 等描述方法计算 ΔK 值, 确定最合适的组群数 [32] ΔK 值计算用在线 STRUCTURE HARVESTER v0.6.93 软件完成 [33] 2 结果 2.1 菌落特征在 PDA 上培养 14 d 后, 灰葡萄孢分离物之间菌落特征表现出明显差异 根据菌落特征, 分离物分可划分为菌核型 菌丝型和分生孢子型 3 种类型 菌丝型分离物菌落不产菌核, 不产生或仅产生少量分生孢子 ; 菌核型分离物产生菌核, 少量或不产生分生孢子 ; 分生孢子型产生大量分生孢子, 少量或无菌核产生 在 100 个分离物中, 菌核型分离物最多, 为 76 个, 占所有分离物 76.0%, 有 17 个 (17.0%) 分离物为菌丝型, 只有 7 个 (7.0%) 分离物为孢子型 重庆和四川分离物均为菌核型,7 个分生孢子型分离物均为甘肃分离物 菌丝型分布于江苏 甘肃 青海和河北分离物, 分离频率为 9.5% 29.6% 22.2% 和 23.1% 2.2 转座子和 Bc-hch 基因型利用 Boty 转座子特异性引物对 BotyF/BotyR 扩增灰葡萄孢分离物基因组 DNA, 在含有 Boty 转座子的分离物中扩增大小为 764 bp 的特异性片段 ; 利用 Flipper 转座子特异性引物 F300/F1550 扩增灰葡萄孢分离物基因组 DNA, 含有 Flipper 转座子的分离物产生大小为 1 250 bp 的特异性片段 在检测的 100 个分离物中, 有 92 个分离物为 transposa 型, 占 92.0%, 其中有 61 个分离物含 Boty, 占 61.0%, 含 Flipper 的分离物 21 个, 占 21.0%, 有 10 个分离物同时存在 Boty 和 Flipper, 占 10.0%;vacuma 型分离物有 8 个, 占 8.0% 在 6 个地理群体中, 只有青海群体包括不含转座子的 vacuma 型分离物, 其分离频率为 44.4%, 而其他 55.6% 的分离物为含有 Flipper + Boty 的 transposa 型 ; 其他群体的分离物均为 transposa 型, 其中江苏分离物只含有单一 Flipper, 重庆 四川 甘肃和河北分离物只含有 Boty( 表 1) 用 Bc-hch 基因特异性引物对 262/520L 对灰葡萄孢分离物基因组 DNA 进行 PCR 分析, 在 100 个分离物均扩增出 1 171 bp 片段 扩增产物用限制性内切酶 Hha I 酶切, 所有分离物均产生相同的带谱和 2 条 517 和 367 bp 的大片段, 其中 517 bp 片段为灰葡萄孢类群 II 特异性片段, 表明所有分离物都属于类型 II( 图 1) 2.3 遗传多样性和群体结构在 100 个灰葡萄孢分离物中,9 对 SSR 引物共扩增出 38 个等位基因, 变异范围 2 6 个, 平均 4.2 个 M 1171 bp 517 bp 367 bp Fig. 1 图 1 引物对 262/520L 对部分灰葡萄孢分离物 Bc-hch 的扩增 ( 上 ) 和扩增产物 Hha I 酶切鉴定 ( 下 ) PCR amplification of Bc-hch using primer pair 262/520L (top) and digestion of amplicons using Hha I (bottom) in partial isolates of B. cinerea
12 期 黄燕等 : 灰葡萄孢蚕豆分离物的遗传多样性 2339 表 1 用于本研究不同地理来源的灰葡萄孢蚕豆分离物 Table 1 B. cinerea isolates isolated from broad bean used in this study 分离物 Isolate 采集地 Location 分离时间 Date of isolation 培养特性 Cultural characteristic 转座子 Transposa Js1 江苏溧水 Lishui, Jiangsu 2011-04 菌丝型 Mycelial type flipper Js2 江苏溧水 Lishui, Jiangsu 2011-04 菌丝型 Mycelial type flipper Js3 江苏溧水 Lishui, Jiangsu 2011-04 菌核型 Sclerotial type flipper Js4 江苏溧水 Lishui, Jiangsu 2011-04 菌核型 Sclerotial type flipper Js5 江苏溧水 Lishui, Jiangsu 2011-04 菌核型 Sclerotial type flipper Js6 江苏溧水 Lishui, Jiangsu 2011-04 菌核型 Sclerotial type flipper Js7 江苏溧水 Lishui, Jiangsu 2011-04 菌核型 Sclerotial type flipper Js8 江苏溧水 Lishui, Jiangsu 2011-04 菌核型 Sclerotial type flipper Js9 江苏如东 Rudong, Jiangsu 2010-06 菌核型 Sclerotial type flipper Js10 江苏如东 Rudong, Jiangsu 2010-06 菌核型 Sclerotial type flipper Js11 江苏如东 Rudong, Jiangsu 2010-06 菌核型 Sclerotial type flipper Js12 江苏如东 Rudong, Jiangsu 2010-06 菌核型 Sclerotial type flipper Js13 江苏如东 Rudong, Jiangsu 2010-06 菌核型 Sclerotial type flipper Js14 江苏启东 Qidong, Jiangsu 2010-06 菌核型 Sclerotial type flipper Js15 江苏启东 Qidong, Jiangsu 2010-06 菌核型 Sclerotial type flipper Js16 江苏启东 Qidong, Jiangsu 2010-06 菌核型 Sclerotial type flipper Js17 江苏启东 Qidong, Jiangsu 2010-06 菌核型 Sclerotial type flipper Js18 江苏南通 Nantong, Jiangsu 2010-06 菌核型 Sclerotial type flipper Js19 江苏南通 Nantong, Jiangsu 2010-06 菌核型 Sclerotial type flipper Js20 江苏南通 Nantong, Jiangsu 2010-06 菌核型 Sclerotial type flipper Js21 江苏南通 Nantong, Jiangsu 2010-06 菌核型 Sclerotial type flipper Hb1 河北崇礼 Chongli, Hebei 2010-10 菌丝型 Mycelial type Boty Hb2 河北崇礼 Chongli, Hebei 2010-10 菌丝型 Mycelial type Boty Hb3 河北崇礼 Chongli, Hebei 2010-10 菌丝型 Mycelial type Boty Hb4 河北崇礼 Chongli, Hebei 2010-10 菌核型 Sclerotial type Boty Hb5 河北崇礼 Chongli, Hebei 2010-10 菌核型 Sclerotial type Boty Hb6 河北崇礼 Chongli, Hebei 2010-10 菌核型 Sclerotial type Boty Hb7 河北崇礼 Chongli, Hebei 2010-10 菌核型 Sclerotial type Boty Hb8 河北崇礼 Chongli, Hebei 2010-10 菌核型 Sclerotial type Boty Hb9 河北崇礼 Chongli, Hebei 2010-10 菌核型 Sclerotial type Boty Hb10 河北崇礼 Chongli, Hebei 2010-10 菌核型 Sclerotial type Boty Hb11 河北崇礼 Chongli, Hebei 2010-10 菌核型 Sclerotial type Boty Hb12 河北崇礼 Chongli, Hebei 2010-10 菌核型 Sclerotial type Boty Hb13 河北崇礼 Chongli, Hebei 2010-10 菌核型 Sclerotial type Boty Cq1 重庆黔江 Qianjiang, Chongqing 2011-04 菌核型 Sclerotial type Boty Cq2 重庆黔江 Qianjiang, Chongqing 2011-04 菌核型 Sclerotial type Boty Cq3 重庆黔江 Qianjiang, Chongqing 2011-04 菌核型 Sclerotial type Boty Cq4 重庆黔江 Qianjiang, Chongqing 2011-04 菌核型 Sclerotial type Boty Cq5 重庆黔江 Qianjiang, Chongqing 2011-04 菌核型 Sclerotial type Boty Cq6 重庆黔江 Qianjiang, Chongqing 2011-04 菌核型 Sclerotial type Boty Sc1 四川达州 Dazhou, Sichuan 2011-04 菌核型 Sclerotial type Boty Sc2 四川达州 Dazhou, Sichuan 2011-04 菌核型 Sclerotial type Boty Sc3 四川达州 Dazhou, Sichuan 2011-04 菌核型 Sclerotial type Boty Sc4 四川达州 Dazhou, Sichuan 2011-04 菌核型 Sclerotial type Boty Sc5 四川南通 Nantong, Sichuan 2011-04 菌核型 Sclerotial type Boty Sc6 四川南通 Nantong, Sichuan 2011-04 菌核型 Sclerotial type Boty Sc7 四川南通 Nantong, Sichuan 2011-04 菌核型 Sclerotial type Boty Sc8 四川南通 Nantong, Sichuan 2011-04 菌核型 Sclerotial type Boty Sc9 四川南通 Nantong, Sichuan 2011-04 菌核型 Sclerotial type Boty
2340 中国农业科学 47 卷 续表 1 Continued Table 1 分离物 Isolate 采集地 Location 分离时间 Date of isolation 培养特性 Cultural characteristic 转座子 Transposa Sc10 四川简阳 Jianyang, Sichuan 2011-04 菌核型 Sclerotial type Boty Sc11 四川简阳 Jianyang, Sichuan 2011-04 菌核型 Sclerotial type Boty Sc12 四川简阳 Jianyang, Sichuan 2011-04 菌核型 Sclerotial type Boty Sc13 四川简阳 Jianyang, Sichuan 2011-04 菌核型 Sclerotial type Boty Sc14 四川成都 Chengdu, Sichuan 2011-04 菌核型 Sclerotial type Boty Sc15 四川成都 Chengdu, Sichuan 2011-04 菌核型 Sclerotial type Boty Gs1 甘肃康乐 Kangle, Gansu 2010-08 菌丝型 Mycelial type Boty Gs2 甘肃康乐 Kangle, Gansu 2010-08 菌丝型 Mycelial type Boty Gs3 甘肃康乐 Kangle, Gansu 2010-08 菌丝型 Mycelial type Boty Gs4 甘肃康乐 Kangle, Gansu 2010-08 菌丝型 Mycelial type Boty Gs5 甘肃康乐 Kangle, Gansu 2010-08 孢子型 Conidial type Boty Gs6 甘肃康乐 Kangle, Gansu 2010-08 孢子型 Conidial type Boty Gs7 甘肃康乐 Kangle, Gansu 2010-08 孢子型 Conidial type Boty Gs8 甘肃康乐 Kangle, Gansu 2010-08 孢子型 Conidial type Boty Gs9 甘肃康乐 Kangle, Gansu 2010-08 菌核型 Sclerotial type Boty Gs10 甘肃康乐 Kangle, Gansu 2010-08 菌核型 Sclerotial type Boty Gs11 甘肃康乐 Kangle, Gansu 2010-08 菌核型 Sclerotial type Boty Gs12 甘肃康乐 Kangle, Gansu 2010-08 菌核型 Sclerotial type Boty Gs13 甘肃康乐 Kangle, Gansu 2010-08 菌核型 Sclerotial type Boty Gs14 甘肃康乐 Kangle, Gansu 2010-08 菌核型 Sclerotial type Boty Gs15 甘肃兰州 Lanzhou, Gansu 2010-08 菌丝型 Mycelial type Boty Gs16 甘肃兰州 Lanzhou, Gansu 2010-08 菌丝型 Mycelial type Boty Gs17 甘肃兰州 Lanzhou, Gansu 2010-08 菌丝型 Mycelial type Boty Gs18 甘肃兰州 Lanzhou, Gansu 2010-08 菌丝型 Mycelial type Boty Gs19 甘肃兰州 Lanzhou, Gansu 2010-08 孢子型 Conidial type Boty Gs20 甘肃兰州 Lanzhou, Gansu 2010-08 孢子型 Conidial type Boty Gs21 甘肃兰州 Lanzhou, Gansu 2010-08 孢子型 Conidial type Boty Gs22 甘肃兰州 Lanzhou, Gansu 2010-08 菌核型 Sclerotial type Boty Gs23 甘肃兰州 Lanzhou, Gansu 2010-08 菌核型 Sclerotial type Boty Gs24 甘肃兰州 Lanzhou, Gansu 2010-08 菌核型 Sclerotial type Boty Gs25 甘肃兰州 Lanzhou, Gansu 2010-08 菌核型 Sclerotial type Boty Gs26 甘肃兰州 Lanzhou, Gansu 2010-08 菌核型 Sclerotial type Boty Gs27 甘肃兰州 Lanzhou, Gansu 2010-08 菌核型 Sclerotial type Boty Qh1 青海西宁 Xining, Qinghai 2010-08 菌丝型 Mycelial type vacuma Qh2 青海西宁 Xining, Qinghai 2010-08 菌丝型 Mycelial type vacuma Qh3 青海西宁 Xining, Qinghai 2010-08 菌丝型 Mycelial type vacuma Qh4 青海西宁 Xining, Qinghai 2010-08 菌核型 Sclerotial type vacuma Qh5 青海西宁 Xining, Qinghai 2010-08 菌核型 Sclerotial type vacuma Qh6 青海西宁 Xining, Qinghai 2010-08 菌核型 Sclerotial type vacuma Qh7 青海西宁 Xining, Qinghai 2010-08 菌核型 Sclerotial type vacuma Qh8 青海西宁 Xining, Qinghai 2010-08 菌核型 Sclerotial type vacuma Qh9 青海西宁 Xining, Qinghai 2010-08 菌核型 Sclerotial type flipper+boty Qh10 青海西宁 Xining, Qinghai 2010-08 菌核型 Sclerotial type flipper+boty Qh11 青海西宁 Xining, Qinghai 2010-08 菌核型 Sclerotial type flipper+boty Qh12 青海西宁 Xining, Qinghai 2010-08 菌核型 Sclerotia type flipper+boty Qh13 青海互助 Huzhu, Qinghai 2010-08 菌丝型 Mycelial type flipper+boty Qh14 青海互助 Huzhu, Qinghai 2010-08 菌核型 Sclerotial type flipper+boty Qh15 青海互助 Huzhu, Qinghai 2010-08 菌核型 Sclerotial type flipper+boty Qh16 青海互助 Huzhu, Qinghai 2010-08 菌核型 Sclerotial type flipper+boty Qh17 青海互助 Huzhu, Qinghai 2010-08 菌核型 Sclerotial type flipper+boty Qh18 青海互助 Huzhu, Qinghai 2010-08 菌核型 Sclerotial type flipper+boty
12 期黄燕等 : 灰葡萄孢蚕豆分离物的遗传多样性 2341 此外, 引物 BC2 BC6 和 BC7 在甘肃群体中还分别扩增 1 2 和 1 个私家等位基因,BC9 和 BC10 引物在青海群体中分别扩增 1 个私家基因 ;9 个 SSR 标记的基因多样性指数 (H) 变化范围为 0.4352 0.7960, 平均为 0.6452;Shannon 多样性指数 (I) 变化范围为 0.6269 1.5997, 平均为 1.1673( 表 2) 在检测的 100 个灰葡萄孢分离中, 共获得 92 个多位点基因型 (MLG) 随机选择一个位点检测到的基因型多样性为 0.6654, 选择 5 9 个位点检测到的基因型多样性为 0.9898 0.9982 随机选择 1 9 个位点在 100 个分离物中检测到不同多位点基因型的比率分别为 4.6% 92.0%( 表 3) 这些结果表明, 用于本研究的 9 个 SSR 标记可以准确有效地评价灰葡萄孢的遗传多样性 在 92 个 MLG 中, 有 84 个只观察到 1 次,7 个观察到 2 次,1 个观察到 3 次 重庆 甘肃和青海群体 中所有分离物均为不同 MLG, 基因多样性为 1.0000, 河北群体 13 分离物中含有 11 个 MLG, 基因多样性最低, 为 0.9615( 表 3) 在甘肃群体和河北群体中存在一个相同 MLG 标准相关指数 (r D ) 用于度量群体内多位点连锁不平衡或重组 在 6 个地理群体多位点连锁不平衡估计 r D 值见表 3, 范围为 0.0312 0.1261, 这表明各灰葡萄孢群体以有性繁殖为主并存在低 但显著水平的无性系 (clonality) 6 个不同地理来源的灰葡萄孢分离物遗传多样性指数见表 3 6 个群体的 Nei s 基因多样性指数在 0.4198 0.6255, 平均为 0.5140, 甘肃分离物群体基因多样性指数 (0.6255) 最高, 之后依次是青海 江苏 四川 河北和重庆 6 个群体的 Shannon 多样性指数的高低与其基因多样性指数一致 表 2 9 个 SSR 位点在 100 个灰葡萄孢蚕豆分离物中的等位基因频率及其他多样性指数 Table 2 Allelic frequencies and other diversity indices of 9 SSR loci in 100 isolates of B. cinerea SSR 位点 SSR locus 观测等位基因数 Observed number of alleles (Na) 有效等位基因数 Effective number of alleles (Ne) 基因多样性指数 Gene diversity index (H) Shannon 指数 Shannon index (I) BC1 6.0000 4.1186 0.7572 1.5624 BC2 4.0000 2.7518 0.6366 1.0856 BC3 3.0000 2.8233 0.6458 1.0686 BC4 2.0000 1.7705 0.4352 0.6269 BC5 5.0000 4.9020 0.7960 1.5997 BC6 6.0000 4.0022 0.7501 1.4710 BC7 4.0000 2.2402 0.5536 0.9837 BC9 4.0000 2.6885 0.6280 1.0862 BC10 4.0000 2.5291 0.6046 1.0219 平均值 Means 4.2222 3.0918 0.6452 1.1673 表 3 6 个灰葡萄孢分离物地理种群遗传多样性分析 Table 3 群体 Population Genetic diversity in 6 geographical populations of B. cinerea 菌株数 Number of isolates 观测等位基因数 Observed number of alleles (Na) 基因多样性指数 Gene diversity index (H) Shannon 指数 Shannon index (I) 多位点基因型数 Number of MLG 基因型多样性 Genotypic diversity 标准关联指数 Standardized index of association (r D) 江苏 Jiangsu 21 3.2222 0.5508 0.9334 19 0.9905 0.0505 河北 Hebei 13 2.7778 0.4472 0.7603 11 0.9615 0.0857 重庆 Chongqing 6 2.0000 0.4198 0.6103 6 1.0000 0.0312 四川 Sichuan 15 2.8889 0.4871 0.8092 12 0.9714 0.1261 甘肃 Gansu 27 3.7778 0.6255 1.1206 27 1.0000 0.0424 青海 Qinghai 18 3.2222 0.5533 0.9407 18 1.0000 0.0668 总数 Total/ 平均值 Means a 100 2.9815 0.5140 0.8624 92 0.9982 0.0491 a 菌株数 多位点基因型数 基因型多样性和标准关联指数为总数 观测等位基因数 基因多样性指数和 Shannon 指数为平均数 a Number of isolates, number of MLG, genotypic diversity, and standardized index of association was total number, respectively. Observed number of alleles, gene diversity index, and Shannon index was average value, respectively
2342 中国农业科学 47 卷 6 个灰葡萄孢群体总的遗传固定指数 (F ST ) 为 0.1330, 表明中国灰葡萄孢蚕豆分离物群体总体上存在中等程度的遗传分化 F ST 两两比较或基因流 (Nm) 估计表明, 灰葡萄孢群体间存在不同程度的遗传分化 ( 表 4) 其中, 重庆群体与青海群体间 F ST 值最大, 为 0.2650,Nm 值最小, 为 1.3868, 表明两个群体间具有很大的遗传分化 重庆群体与四川群体间 F ST 值最小, 为 0.0085,Nm 值最大, 为 58.3235, 表明两个群体间具有小的遗传差异 基因型流动或迁移的直接证据在甘肃群体和河北群体内被检测到, 两个群体存在一个相同的多位点基因型 根据 SSR 统计分析结果, 计算不同种群间的遗传相似性与遗传距离, 结果见表 5 基于遗传相似性或遗传距离的群体间遗传关系与基于 F ST 或 Nm 的结果相同 四川和重庆两个种群间的遗传相似性最高, 相似性系数为 0.9345 青海和重庆两个群体间的遗传相似性最低, 相似性系数为 0.4815 遗传距离与遗传相似性系数相对应, 遗传距离最小的为四川与重庆的分离物, 遗传距离为 0.0677, 最大的为青海与重庆的分离物, 遗传距离为 0.7308 这些结果表明, 灰葡萄孢群体间遗传关系与其地理距离相关, 地理距离近的群体遗传相似性高, 遗传分化程度小, 而地理距离远的群体遗传相似性低, 遗传分化程度高 进一步对 6 个不同地理群体进行 AMOVA 分析, 结果表明灰葡萄孢蚕豆分离物地理群体间和群体内存在遗传变异, 其中群体间的遗传变异占总变异的 13.30%(P<0.0001), 群体内遗传变异占总变异的 86.70%(P<0.0001)( 表 5), 遗传变异主要来源于群体内, 说明地理条件和生态环境对灰葡萄孢遗传分化有显著影响 UPGMA 聚类分析表明, 在相似系数为 0.67 时, 100 个灰葡萄孢分离物被分为两个遗传组 (I II), 第 I 组包含 6 个不同地理来源的 91 个分离物, 而第 II 组仅由来源于青海的 8 个分离物和 1 个四川分离物组成 ( 图 2) 在相似系数为 0.75 是时,100 个分离物被划分为 10 个遗传组 (A J), 除 E 组单独由 7 个河北分离物组成和 H 组仅含 1 个甘肃分离物外, 其他遗传组均包含 2 6 不同地理来源的分离物, 其中最大遗传组为 G 组, 包含 20 个分离物, 分别来源于除青海外的 5 个不同地理群体 这些结果表明, 灰葡萄孢遗传聚类与地理来源无关, 但一些地理群体存在独特的基因型 通过贝叶斯 (Bayesian) 推理对 92 个灰葡萄孢克隆矫正单倍型进行群体结构分析表明,K 值为 2 时获得的 K 值最大 ( 图 3), 表明 92 个多位点基因型可 表 4 基于 9 个 SSR 标记数据计算的 6 个灰葡萄孢地理群体间的固定指数 (FST) 和基因流 (Nm) 估计 Table 4 Pairise comparison of Fixation index (F ST ) and gene flow (Nm) estimated from nine SSR loci between populations of B. cinerea from 6 geographical regions 群体 Population 江苏 Jiangsu 河北 Hebei 重庆 Chongqing 四川 Sichuan 甘肃 Gansu 青海 Qinghai 江苏 Jiangsu **** 0.1706 * 0.1672 0.1526 0.0388 0.1386 河北 Hebei 2.4308 **** 0.2437 0.2281 0.1039 * 0.2149 * 重庆 Chongqing 2.4904 1.5517 **** 0.0085 0.0597 0.2650 四川 Sichuan 2.7765 1.6920 58.3235 **** 0.0459 0.2434 甘肃 Gansu 12.3866 4.3123 7.9003 10.3932 **** 0.1188 青海 Qinghai 3.1075 1.8267 1.3868 1.5542 3.7088 **** 对角线以上为固定指数 F ST, 对角线以下基因流 Nm = 0.5(1 F ST)/F ST,*P 值 <0.001 Up the diagonal was Fixation index F ST and down was gene flow Nm = 0.5(1-F ST)/F ST, *P value<0.001 表 5 6 个不同地理来源灰葡萄孢群体基于 SSR 标记的遗传变异分析 (AMOVA) Table 5 AMOVA analysis of genetic variation in 6 B. cinerea populations from different geographical regions based on SSR markers 变异来源 Source of variation 自由度 df 平方和 Sum of squares 方差分量 Variance component 方差分量比率 Percentage of variation (%) 显著性概率 群体间 Among populations 5 46.159 0.40722 13.30 <0.0001 群体内 Within population 94 249.501 2.65427 86.70 <0.0001 合计 Total 99 295.660 3.06149 100.00 - P value
12 期黄燕等 : 灰葡萄孢蚕豆分离物的遗传多样性 2343 I II 0.67 0.75 0.83 0.92 Coefficient 1.00 Js1 Gs27 Hb7 Gs26 Gs23 Js15 Js16 Gs25 Qh1 Qh3 Gs24 Qh8 Qh9 Js2 Js3 Js17 Js18 Hb8 Hb10 Hb9 Sc1 Qh15 Qh16 Qh17 Qh18 Js4 Js21 Gs17 Gs20 Js5 Gs18 Gs19 Sc7 Sc11 Sc10 Gs2 Sc9 Sc12 Sc13 Js6 Sc8 Js7 Js10 Js13 Js14 Hb13 Gs6 Cq1 Cq2 Qh14 Gs1 Gs13 Hb1 Hb2 Hb3 Hb4 Hb5 Hb6 Hb12 Cq4 Gs12 Gs3 Gs5 Gs10 Js8 Js9 Gs4 Hb11 Gs16 Js11 Cq3 Sc2 Sc3 Cq6 Sc14 Cq5 Sc4 Sc5 Sc6 Sc15 Gs9 Gs11 Gs21 Gs22 Gs15 Js12 Js20 Qh2 Gs7 Gs8 Gs14 Js19 Qh6 Qh7 Qh12 Qh4 Qh5 Qh13 Qh10 Qh11 A B C D E F G H I J A J 分别代表不同的基因型组, 分离物代号同表 1 A-J indicated different genotype clusters, and isolate codes were same as Table 1 Fig. 2 图 2 基于遗传相似系数构建的 100 个灰葡萄孢分离物的 UPGMA 聚类分析图 The UPGMA dendrograms of 100 B. cinerea isolates based on genetic similarity
2344 中 国 农业 科学 47 卷 表 6 灰葡萄孢不同地理种群的遗传相似性系数和遗传距离 Table 6 Genetic similarity coefficient and genetic distance among 6 geographical groups of B. cinerea 群体 Population 江苏 Jiangsu 河北 Hebei 重庆 Chongqing 四川 Sichuan 甘肃 Gansu 青海 Qinghai 江苏 Jiangsu **** 0.7336 0.7021 0.7398 0.9085 0.7410 河北 Hebei 0.3098 **** 0.6365 0.6557 0.8135 0.6431 重庆 Chongqing 0.3536 0.4518 **** 0.9345 0.8392 0.4815 四川 Sichuan 0.3014 0.4221 0.0677 **** 0.8972 0.5246 甘肃 Gansu 0.0960 0.2064 0.1753 0.1085 **** 0.7393 青海 Qinghai 0.2997 0.4415 0.7308 0.6451 0.3020 **** 对角线以上为遗传相似性系数, 对角线以下为遗传距离 Up the diagonal was genetic identity and down was genetic distance ΔK 160 140 120 100 80 60 40 20 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 K 图 3 确定不同地理来源灰葡萄孢多位点基因型最可能遗传聚类数的每个 K 值水平上 K 的大小 Fig. 3 The magnitude of K at each level of K used to the most probable number of genetic clusters for B. cinerea MLGs from 6 geographical regions 分为两个遗传类群, 重庆和四川群体具为一类, 青海群体单独具为一类, 而江苏 河北和甘肃群体分为两个不同聚类 ( 图 4) 3 讨论 灰葡萄孢已被证明是含有隐存种的复合种, 多基因谱系分析将其区分为两个称作类群 I 和类群 II 的同胞种, 两个隐存种间不存在基因交流 [12-13] 最近, 类群 I 已正式被鉴定为一个新的葡萄孢种假灰葡萄孢 (B. pseudocinerea) [19] 类群 II 根据转座子的有无分为 transposa 和 vacuma 两种类型, 但是系统发育及寄主分析不能区分两种转座子类型分离物, 二者间也不存在基因交流的障碍 [19], 被确定为严格意义上灰葡萄孢 (B. cinerea sensu stricto) [13] 此外,2013 年一个新的灰葡萄孢类群 S(Botrytis group S) 在德国草莓灰葡萄孢分离物中被鉴定 [16] 本研究对中国灰葡萄孢蚕豆分离物遗传特征进行研究, 在 6 个不同地理来源的群体中只检测到类群 II 分离物, 表明中国蚕豆上的灰葡萄孢群体仅由类群 II 组成, 是严格意义上灰葡萄孢 实际上, 转座子分析表明,92.0% 分离物含有转座子, 已表明属于类群 II, 只有 8.0% 的分离物为 vacuma 类型, 而 Bc-hch 基因 PCR-RFLP 分析证明它们也属于类 1.00 0.80 0.60 0.40 0.20 0.00 JS HB CQ SC GS QH JS = 江苏, HB = 河北, CQ = 重庆, SC = 四川, GS = 甘肃, QH = 青海 每个条形代表一个不同的单倍型, 每种颜色表示不同的遗传类群 JS = Jiangsu, HB = Hebei, CQ = Chongqing, SC = Sichuan, GS = Gansu, QH = Qinghai. Each bar represented a different MLG and each colour indicated a different genetic cluster Fig. 4 图 4 6 个地理来源的 92 个灰葡萄孢多位点基因型在 K 值为 2 时多位点基因型分配的条形结构图 Structure bar-plot showing the assignment of MLGs at K = 2 from 92 B. cinerea MLGs from 6 geographical regions
12 期黄燕等 : 灰葡萄孢蚕豆分离物的遗传多样性 2345 群 II 最近一些研究表明, 南亚的孟加拉国 印度和 尼泊尔 澳大利亚 北非的突尼斯 南美的智利和阿 根廷包括番茄 葡萄 草莓 蚕豆 鹰嘴豆 小扁豆 等多种寄主的灰葡萄孢分离物中也没有发现类群 I 灰 葡萄孢的存在 [9,21,34-35] 类群 I 灰葡萄孢在亚洲 澳大 利亚 北非和南美没有检测到, 可能表明亚洲 / 澳大利 亚 / 北非 / 南美和欧洲 / 美洲间的基因流被限制 类群 I 灰葡萄孢在欧洲超越地理障碍的迁移已被证明, 目前 已从西欧蔓延到欧洲中部的匈牙利和南非 [17-18] 由于 类群 I 灰葡萄孢侵染葡萄 草莓和油菜, 并且对环酰 菌胺具有自然抗药性 [15], 中国应该加强对类群 I 灰葡 萄孢检疫和田间监测 许多研究表明灰葡萄孢具有丰富的表型多样 性 [8,36-38] 基于在培养基上的菌落形态, 灰葡萄孢被 分为菌核型 菌丝型和孢子型 [38] 本研究结果表明, 中国灰葡萄孢蚕豆分离物以菌核型为主, 占所有检测 分离物的 76.0%, 这一研究结果与国内外许多研究相 似 [37-38] 灰葡萄孢的表型变异可能与非整倍体 (aneuoploidy) 异核性 (heterokaryosis) 及转座子 有关 [37,39] 类群 II 灰葡萄孢分离物含有两类转座子 Boty 和 Flipper, 根据转座子的有无分为 4 种转座子基因型, 即不含转座子的 vacuma 含有 Boty 和 Flipper 只含 Boty 和只含 Flipper 的分离物 本研究中, 检测的 100 个灰葡萄孢蚕豆分离物中有 92 个分离物含有转座子, [38] 只有 8 个分离物为 vacuma 基因型, 这一结果与张静 的研究结果一致 然而, 在转座子基因型的分布上本 研究结果与张静的结果有较大差异 本研究 100 个分 离物中,61.0% 只含 Boty,21.0% 只含 Flipper,10.0% 同时存在 Boty 和 Flipper, 而张静研究表明, 在含有 转座子的分离物中同时含有 Boty 和 Flipper 分离物最 多, 而只含 Boty 的最少 [38] 产生这种差异的原因可能 与分离物的地理来源有关, 张静研究的分离物仅来自 湖北, 而本研究分离物来自江苏 河北 重庆 四川 甘肃和青海 6 个不同地理区域 事实上, 本研究结果 已表明, 灰葡萄孢转座子基因型分布有明显的地域性, 如江苏分离物只含有单一 Flipper, 重庆 四川 甘肃 和河北分离物只含有 Boty, 而青海中分离物转座子基 [21] 因型都同时含有 Flipper 和 Boty Isenegger 等对孟 加拉国 印度 尼泊尔 澳大利亚的灰葡萄孢分离物 研究表明, 转座子基因型的分布与地理来源相关, 如灰葡萄孢在孟加拉国以只含 Flipper 的分离物为 主, 在印度和尼泊尔以只含 Boty 的分离物为主, 而 在澳大利亚以含同时含有 Boty 和 Flipper 分离物为 主 大量研究表明, 类群 II 灰葡萄孢 vacuma 基因 型在不同地理来源或不同寄主来源群体中均只占较 低比例 [9,14-15,17,21] 同样, 本研究仅在青海分离物中发 [37] 现少量的 vacuma 基因型 Martinez 等研究葡萄园 灰葡萄孢转座子基因型分布表明, 转座子基因型在收 获期为优势基因型, 而 vacuma 基因型主要在衰老的 花冠上分离到 导致这种差异分布原因是转座子基因 型比 vacuma 基因型毒力强, 后者更具有腐生性 [9] 利用 SSR 分析灰葡萄孢蚕豆分离物群体的遗传结 构发现,100 个分离物被分为 92 个多位点基因型或单 倍型, 平均基因多样性指数 (H) 和基因型多样性分 别为 0.5140 和 0.9982, 表明所有地理群体都存在丰富 的遗传多样性和基因型多样性 6 个不同地理群体的 r D 值范围为 0.0312 0.1261, 平均 0.0491, 表明所有 群体中都存在一定程度的连锁不平衡, 繁殖方式以有 性繁殖模式为主, 同时存在低水平的无性克隆繁殖 虽然在自然条件下灰葡萄孢只产生无性分生孢子, 但 严格的遗传检验已清楚证明灰葡萄孢中有性重组的存 在, 如法国灰葡萄孢群体和匈牙利葡萄园灰葡萄孢群 体都存在强的有性重组 [13,39] 由于有性重组导致新的 基因型产生而贡献遗传多样性和进化潜力, 灰霉菌有 性重组可能是一个决定群体结构重要因素 基因流是决定群体结构的一个主要进化力, 它影 响遗传变异的水平和分布, 从而影响群体间遗传分化 的水平 在灰葡萄孢中, 由于高的基因流导致低的种 群分化被报道 [14,40] 在本研究中, 基于 F ST 估计的高 基因流值 (Nm=58.3235) 在四川和重庆两地灰葡萄孢 群体间被检测到, 这表明病原菌的迁移事件在这两个 地区之间发生普遍 四川与重庆地理相连, 生态气候 相同, 灰葡萄孢分生孢子随气流传播, 导致两地间病 原菌频繁交流而具有高度的遗传相似性 ( 表 6) 甘 肃与江苏的灰葡萄孢群体间也存在较高的基因流 (Nm=12.3866), 这似乎也表明这两地之间也存在一 定水平的病原菌迁移 由于灰葡萄孢的气传特性和广 泛的寄主范围, 江苏与甘肃虽然地理距离很远且生态 条件显著不同, 但这些因素不能阻碍灰葡萄孢的迁移 [17] Fekete 等认为假灰葡萄孢可以超越阿尔卑斯山等地 理障碍从西欧蔓延到匈牙利的潘诺尼亚平原 本研究 遗传聚类也表明, 分别有 81.0% 和 81.5% 江苏分离物 和甘肃分离物聚类到相同的遗传组 然而, 转座子研 究表明, 江苏分离物只含有单一 Flipper 转座子而甘肃 分离物只含有 Boty 转座子, 显然两个群体分属明显不
2346 中国农业科学 47 卷 同的转座子基因型, 这一结果不支持两地之间病原菌的交流 出现这一矛盾结果的原因可能是笔者检测不同地区的分离物数量太少 4 结论 中国蚕豆上的灰葡萄孢群体均由灰葡萄孢类群 II 组成, 是严格意义上灰葡萄孢 分离物的菌落形态以菌核型为主, 存在 transposa 和 vacuma 两种类型, 其中以 transposa 类型为主, 转座子基因型的分布明显存在地域差异 调查的 6 个群体都具有高水平的遗传多样性, 遗传变异主要来源于群体内, 生殖方式以有性繁殖为主, 大部分群体间存在中等到大的遗传分化 References [1] Alghamdi S S, Migdadi H M, Ammar M H, Paull J G, Siddique K H M. Faba bean genomics: current status and future prospects. Euphytica, 2012, 186(3): 609-624. [2] Harrison J G. The biology of Botrytis spp. on Vicia beans and chocolate spot disease-a review. Plant Pathology, 1988, 37(2): 168-201. [3] 俞大绂. 蚕豆病害. 北京 : 科学出版社, 1979. Yu D F. Diseases of Broad Bean. Beijing: Science Press, 1979. (in Chinese) [4] 王昆, 沈友康, 郑江, 沈亚萍, 王其礼, 刘锦生. 蚕豆赤斑病流行趋势预报的模糊识别模式研究. 植物病理学报, 1995, 25(3): 279-284. Wang K, Shen Y K, Zheng J, Shen Y P, Wang Q L, Liu J S. On the fuzzy recognition models of epidemic trend forecasting of chocolate spot of broad bean (Botrytis fabae Sardina). Acta Phytopathologica Sinica, 1995, 25(3): 279-284. (in Chinese) [5] 黄燕, 段灿星, 陆鸣, 东方阳, 朱振东. 蚕豆赤斑病病原菌鉴定. 植物保护, 2012, 38(6): 115-118. Huang Y, Duan C X, Lu M, Dongfang Y, Zhu Z D. Identification of pathogens causing chocolate spot on broad bean. Plant Protection, 2012, 38(6): 115-118. (in Chinese) [6] Zhang J, Wu M D, Li G Q, Yang L, Yu L, Jiang D H, Huang H C, Zhuang W Y. Botrytis fabiopsis, a new species causing chocolate spot of broad bean in central China. Mycologia, 2010, 102(5): 1114-1126. [7] Williamson B, Tudzynski B, Tudzynski P, van Kan J A. Botrytis cinerea: the cause of grey mould disease. Molecular Plant Pathology, 2007, 8(5): 561-580. [8] Mirzaei S, Mohammadi Goltapeh E, Shams-Bakhsh M, Safaie N, Chaichi M. Genetic and phenotypic diversity among Botrytis cinerea isolates in Iran. Journal of Phytopathology, 2009, 157: 474-482. [9] Esterio M, Muñoz G, Ramos C, CofréG, Estévez R, Salinas A, Auger J. Characterization of Botrytis cinerea isolates present in Thompson seedless table grapes in the Central Valley of Chile. Plant Disease, 2011, 95(6): 683-690. [10] Giraud T, Fortini D, Levis C, Leroux P, Brygoo Y. RFLP markers show genetic recombination in Botryotinia fuckeliana (Botrytis cinerea) and transposable elements reveal two sympatric species. Molecular Biology and Evolution, 1997, 14(11): 1177-1185. [11] Giraud T, Fortini D, Levis C, Lamarque C, Leroux P, LoBuglio K, Brygoo Y. Two sibling species of the Botrytis cinerea complex, transposa and vacuma, are found in sympatry on numerous host plants. Phytopathology, 1999, 89(10): 967-973. [12] Fournier E, Levis C, Fortini D, Giraud T, Leroux P, Brygoo Y. Characterization of Bc-hch, the Botrytis cinerea homolog of the Neurospora crassa het-c vegetative incompatibility locus, and its use as a population marker. Mycologia, 2003, 95(2): 951-961. [13] Fournier E, Giraud T, Albertini C, Brygoo Y. Partition of the Botrytis cinerea complex in France using multiple gene genealogies. Mycologia, 2005, 97(6): 1251-1267. [14] Ma Z H, Michailides T J. Genetic structure of Botrytis cinerea populations from different host plants in California. Plant Disease, 2005, 89(10): 1083-1089. [15] Kretschmer M, Hahn M. Fungicide resistance and genetic diversity of Botrytis cinerea isolates from a vineyard in Germany. Journal of Plant Diseases and Protection, 2008, 115(5): 214-219. [16] Leroch M, Plesken C, Weber R W, Kauff F, Scalliet G, Hahn M. Gray mold populations in German strawberry fields are resistant to multiple fungicides and dominated by a novel clade closely related to Botrytis cinerea. Applied and Environmental Microbiology, 2013, 79(1): 159-167. [17] Fekete É, Fekete E, Irinyi L, Karaffa L, Árnyasi M, Asadollahi M, Sándro E. Genetic diversity of a Botrytis cinerea cryptic species complex in Hungary. Microbiological Research, 2012, 167(5): 283-291. [18] Wessels B A, Lamprecht S C, Linde C C, Fourie P H, Mostert L. Characterization of the genetic variation and fungicide resistance in Botrytis cinerea populations on rooibos seedlings in the Western Cape of South Africa. European Journal of Plant Pathology, 2013, 136(2): 407-417. [19] Walker A S, Gautier A, Confais J, Martinho D, Viaud M, Le Pêcheur P, Dupont J, Fournier E. Botrytis pseudocinerea, a new cryptic species causing gray mold in French vineyards in sympatry with Botrytis
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