生物工程学报 Chin J Biotech 2008, November 25; 24(11): 1874-1879 journals.im.ac.cn Chinese Journal of Biotechnology ISSN 1000-3061 cjb@im.ac.cn 2008 Institute of Microbiology, CAS & CSM, All rights reserved 研究报告 rhepo-l-fc 融合蛋白的表达 生物活性和初步药动学 分析 祝强 1,2, 黄智华 2, 黄予良 2, 覃扬 1 1 四川大学华西基础医学与法医学院生物化学与分子生物学教研室, 成都 610041 2 健能隆医药技术 ( 上海 ) 有限公司, 上海 201203 摘要 : 为了延长人促红细胞生成素 (hepo) 体内半衰期以达到更好的药效, 制备通过柔性接头相连接的重组人红细胞生成素 -IgG1 Fc 融合蛋白 (rhepo-l-fc), 并对其生物学活性和体内药动学进行初步研究 利用 PCR 技术构建 rhepo-l-fc 融合基因, 克隆至表达载体 poptivec-topo, 在二氢叶酸还原酶缺陷型中国仓鼠卵巢细胞 (CHO-dhfr ) 表达 Protein A 亲合层析柱纯化融合蛋白, SDS-PAGE 质谱 Western blotting 鉴定表达产物, 细胞增殖实验检测融合蛋白的体外活性, 动物实验检测融合蛋白的体内活性和半衰期 成功构建 poptivec-topo -rhepo-l-fc 重组子, 实现了在 CHO 细胞表达, 纯化后的 rhepo-l-fc 融合蛋白经鉴定, 其分子量和特异性均与理论值相符, 能刺激体外培养的 EPO 依赖型细胞生长, ED 50 为 2 ng/ml, 且明显增加大鼠外周血网织红细胞数, 体内消除半衰期达到 27 h rhepo-l-fc 融合蛋白能延长 hepo 体内半衰期, 为其临床研究奠定了基础 关键词 : rhepo-l-fc 融合蛋白, 半衰期, CHO 细胞表达 Expression of rhepo-l-fc Fusion Protein and Analysis of Its Bioactivity and Pharmacokinetics Qiang Zhu 1,2, Zhihua Huang 2, Yuliang Huang 2, and Yang Qin 1 1 Department of Biochemistry and Molecular Biology, College of Preclinical and Forensic Medicine, Sichuan University, Chengdu 610041, China 2 Generon Corporation, Shanghai 201203, China Abstract: To prolong serum half-life of human Erythropoietin for better efficacy, a new form of recombinant human erythropoietin (rhepo-l-fc) was generated by fusion of a full length human erythropoietin gene and the Fc fragment of human IgG1 with flexible linker sequence. The fusion gene rhepo-l-fc was constructed by PCR, then inserted into expression vector poptivec -TOPO, and expressed in Chinese Hamster Ovary cells deficient in the DHFR enzyme(cho-dhfr - ). The chimeric protein was purified by Protein A affinity chromatography, showed expected molecular weight and demonstrated a similar bioactivity compared to that of the native recombinant human erythropoietin (rhepo) in an EPO-dependent cell-based assay. In vivo pharmacokinetic studies showed that the rhepo-l-fc had an elimination half-life of 27 h. In vivo efficacy studies showed that a single dose administration of rhepo-l-fc in rats increased the reticulocyte number in the peripheral blood significantly. These results demonstrated that the new engineered rhepo-l-fc may become alternative therapeutic approach to extend the half-time of rhepo to treat anemia. Keywords: rhepo-l-fc fusion protein, half-life, CHO expression Received: March 25, 2008; Accepted: May 28, 2008 Corresponding author: Yang Qin. Tel: +86-28-85501716; E-mail: qin_1@sina.com
祝强等 : rhepo-l-fc 融合蛋白的表达 生物活性和初步药动学分析 1875 促红细胞生成素 (Erythropoietin, EPO) 是一种刺激骨髓造血的高度糖基化蛋白类激素, 分子量为 30.4 kd, 由 166 个氨基酸组成, 含 3 条 N- 连接寡糖链和 1 条 O- 连接寡糖链, 约占分子量 40% 的糖链在 EPO 生物合成 三维结构维持 体内活性发挥中起着非常重要的作用 [1] 在胎儿 EPO 主要由肾脏和肝脏合成, 而在成人体内主要来源于肾脏, 正常人体内血液中 EPO 含量为 10~30 miu/ml; 体内缺氧时, 其含量可提高 1000 倍以上 [2] EPO 与骨髓红细胞前体细胞上的特异受体结合, 促进其增殖 分化并成熟为红细胞, 增加骨髓向循环血液中的红细胞释放量 EPO 已广泛应用于临床上各种贫血性疾病治疗, 其中最有效的是肾衰 尿毒症所伴随贫血的治疗, 对肿瘤相关性贫血 人类免疫缺陷病毒 (HIV) 相关贫血 骨髓移植后贫血 早产儿和孕产妇贫血 围手术期减少异源性输血等方面也有良好的疗效 [3] 1989 年美国 Amgen 公司在国际上首次研制成功 rhepo, 用于治疗肾性贫血, 取得了令人瞩目的疗效, 但 rhepo 体内半衰期短, 给患者带来极大不便 IgG 类免疫球蛋白为人体血液中最丰富的蛋白之一, 半衰期达到 21 d, 其半衰期与 Fc 片段密切相关, 且已有报道将 IgG Fc 片段与其他蛋白融合可显著延长目的蛋白的半衰期, 提高体内生物活性, 目前已应用于临床上一些重要的细胞因子和可溶性受 [4, 体并获得了成功, 如 : IL-2 stnf-αr IFN-α 等 5] 本研究将 hepo 和人 IgG1 Fc 进行融合表达, 希望该重组蛋白既能保留 hepo 生物活性又能延长半衰期, 更适合于临床应用 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 质粒和菌株质粒 pbluescript pbluescript-rhepo pgem-t- Fc 为健能隆医药技术 ( 上海 ) 有限公司保存, poptivec - TOPO 购自 Invitrogen, 感受态大肠杆菌 DH5α 为健能隆医药技术 ( 上海 ) 有限公司制备 1.1.2 动物细胞和培养基 CHO-dhfr 细胞 32D-EPOR 细胞为健能隆医药技术 ( 上海 ) 有限公司保存, FBS IMDM DMEM 均为 GIBCO 产品, EX-CELL TM 302 无血清培养基购自 SIGMA 1.1.3 酶和试剂高保真 Pfu DNA 聚合酶 Taq DNA 聚合酶 各种限制性内切酶 (BamHⅠ XbaⅠ Hind Ⅲ Pvu Ⅰ) 均购自 MBI 质粒小量制备试剂盒购自上海捷瑞生物工程有限公司 ; 质粒中量制备试剂盒 (QIAGEN plasmid midikit) 购自 QIAGEN; UNIQ-10 柱式 DNA 胶回收试剂盒购自上海生工生物工程技术服务有限公司 ; 引物合成及 DNA 测序由上海英骏生物技术有限公司完成 ; 羊抗人 IgG1 Fc-HRP 抗体为 KPL 公司产品 ; HT MTX 购自 SIGMA; Lipofectamine TM 2000 Reagent 购自 Invitrogen; 重组人红细胞生成素 (rhepo) 为沈阳三生制药有限责任公司产品 ; BCA Protein Assay Kit 为 Pierce 公司产品 ; Cell Counting Kit-8 (CCK-8 ) 是日本株式会社同仁化学研究所产品 ; Quantikine IVD EPO Kit 购自 R & D systems 1.2 方法 1.2.1 真核表达载体 poptivec -TOPO -rhepo- L-Fc 的构建 1) 克隆载体 pbluescript-linker-fc 构建 : 以 1-F 2-F 为正向引物, 3-R 为反向引物, pgem-t-fc 为模板, 采用高保真 Pfu DNA 聚合酶合成融合基因 Linker-Fc, 将 16 个氨基酸 (GSGGGSGGGGSGGGGS) 的柔性多肽 Linker 与去掉 N 端 5 个氨基酸的 Fc 铰链 (Hinge) 相连 融合基因 5 端带有 BamHⅠ 酶切位点, 3 端含 Hind III 酶切位点, 反应条件 : 94 o C 预变性 4 min, 94 o C 变性 1 min, 62 o C 退火 30 s, 72 o C 延伸 100 s, 循环 25 次, 72 o C 延伸 10 min, PCR 产物和质粒 pbluescript 相应双酶切后胶回收, 连接产物转化感受态大肠杆菌 DH5α, 提取质粒, 酶切鉴定正确后送测序确认 cdna 序列 引物序列如下 : 1-F: 5 -GAGGCGGAAGCGGCGGTGGAGGATCAGA CAAAACTCACACATGCCCAC-3 2-F: 5 -CACGGATCCGGTGGCGGTTCCGGTGGAGG BamHⅠ CGGAAGCGGCGGTG-3 3-R: 5 -CAGAAGCTTTTATCATTTACCCGGAGACA-3 Hind III 2) 克隆载体 pbluescript-rhepo-l-fc 构建 : 以 4-F 为正向引物, 5-R 为反向引物, pbluescriptrhepo 为模板, 扩增 rhepo cdna 序列, 5 端含 Xba I 酶切位点和 Kozak 序列, 3 端含 BamHⅠ 酶切位点, 反应条件 : 94 o C 预变性 4 min, 94 o C 变性 1 min, 65 o C 退
1876 ISSN1000-3061 CN11-1998/Q Chin J Biotech November 25, 2008 Vol.24 No.11 火 30 s, 72 o C 延伸 80 s, 循环 25 次, 72 o C 延伸 10 min, PCR 产物和质粒 pbluescript-linker-fc 经相应双酶 切, 胶回收目的片段连接, 连接产物转化感受态大 肠杆菌 DH5α, 抽提质粒, 酶切鉴定正确后送测序确 认 cdna 序列 引物序列如下 : 4-F: 5 -CAGTCTAGAGCCGCCACCATGGGG GTGCA XbaⅠ CGAATGTCCTG-3 5-R: 5 -GTGGGATCCTCTGTCCCCTGTCCTGCAGG BamHⅠ CCTC-3 3) 重组真核表达载体 poptivec -TOPO - rhepo-l-fc 的构建 : XbaⅠ Hind III 双酶切重组克 隆载体 pbluescript-rhepo-linker-fc, 胶回收目的片 段与经同样双酶切的真核表达载体 poptivec - TOPO 相连接, 酶切鉴定后测序分析 1.2.2 细胞培养与质粒转染 CHO-dhfr - 细胞培养于含次黄嘌呤及胸苷 (HT) 和 10% 胎牛血清 (FBS) 的 IMDM 完全培养基中 QIAGEN plasmid midikit 提取 rhepo-l-fc 表达质 粒 重组质粒经线性化后, 用 Lipofectamine TM 2000 Reagent 脂质体转染至细胞, 根据试剂盒说明书操 作 转染 24 h 后 1:10 传代稀释, 48 h 后换成无 HT 的缺陷培养基筛选稳定转染细胞 1.2.3 表达产物检测和细胞加压筛选 32D-EPOR 细胞为 IL-3 或 EPO 依赖型, 32D- EPOR 细胞增殖实验检测稳定转染细胞培养上清中 是否有 rhepo-l-fc 融合蛋白表达, 以培养于完全培 养基中的未转染 CHO-dhfr - 细胞上清为对照 有限稀 释稳定转染细胞以获得单克隆, 通过 32D-EPOR 细 胞增殖实验比较各个单克隆细胞 rhepo-l-fc 融合 蛋白表达水平, 挑选较高表达水平的单克隆进行 甲氨喋呤 (MTX) 加压筛选以提高细胞蛋白表达量 1.2.4 rhepo-l-fc 融合蛋白的表达 纯化 选择表达量高的单克隆扩大培养, 然后悬浮培 养于无血清培养基, 收集上清, 0.45 μm 滤膜过滤, 调节 ph 至 7.4, 用 HiTrap Protein-A Sepharose affinity column 纯化融合蛋白, 5 倍柱床体积的去离 子水洗出保护剂溶液, 再用 5 倍柱床体积的起始缓 冲液平衡柱子, 洗出液与起始缓冲液 ph 相同时进样, 收集流出液 用 10 倍体积磷酸缓冲液 (0.02 mol/l, ph 7.4) 洗涤除去杂蛋白, 5 倍体积的柠檬酸缓冲液 (0.1 mol/l, ph 3.2) 洗脱, 中和洗脱液至 ph 7.0, BCA 法测定蛋白质浓度 1.2.5 rhepo-l-fc 融合蛋白质量鉴定 1) SDS-PAGE 检测 : 8% SDS-PAGE 电泳观察蛋白纯度和分子量大小 ; 2) MALDI-TOF-MS 精确测定分子量 : 由复旦大学蛋白组研究中心完成 ; 3) Western blotting: 以羊抗人 IgG1 Fc-HRP 抗体进行 Western blotting 分析 1.2.6 体外活性检测将 rhepo 按 0.0066 ng/ml 0.02 ng/ml 0.066 ng/ml 0.2 ng/ml 0.66 ng/ml 2 ng/ml 6.67 ng/ml 20 ng/ml 66.7 ng/ml 200 ng/ml 稀释于含有 10% FBS 的 DMEM 细胞培养基, 根据 EPO 肽链在整个 rhepo-l-fc 肽链分子中的比例, 计算等量的 rhepo 所需的 rhepo-l-fc 融合蛋白量 接种对数生长期 32D-EPOR 细胞 1 10 4 / 孔于 96 孔板, 100 μl/ 孔, 16 h 后分别加入 rhepo rhepo-l-fc 融合蛋白, 每个稀释度做 3 个孔, 37 o C 5% CO 2 培养箱中培养 48 h, 每孔再加入 10 μl CCK-8 试剂, 37 o C 培养 2.5 h 后测 450 nm 处吸光度, 参比波长 650 nm, 将浓度对数与吸光度 (OD) 作图 1.2.7 体内药代动力学初步检测给 3 只 SD 大鼠以 100 μg/kg 单次皮下注射 rhepo-l-fc 融合蛋白, 于给药后的 0.5 h 2 h 4 h 8 h 24 h 48 h 72 h 96 h 120 h 尾静脉采血, 分离血浆, 夹心 ELISA 检测血浆中 rhepo-l-fc 融合蛋白含量, 采用 3p97 软件进行数据处理, 计算相关药代动力学参数 1.2.8 体内活性初步检测给 3 只 SD 大鼠以 100 μg/kg 单次皮下注射 rhepo- L-Fc 融合蛋白, 于给药后 0 d 7 d 14 d 尾静脉采血, 300 μl/ 只, 4 h 内检测网织红细胞数 2 结果 2.1 rhepo-l-fc 融合基因及表达载体鉴定用 PCR 方法成功构建 rhepo-l-fc 融合基因, 测序结果表明, 融合基因序列与设计一致, 其中 hepo 基因长 579 bp, 编码 27 个氨基酸的信号肽和 166 个氨基酸 ; Linker 基因长 48 bp, 编码 16 个氨基酸 (GSGGGSGGGGSGGGGS), Fc 基因长 681 bp, 编码 227 个氨基酸, 将融合基因连入表达载体构建重组
祝强等 : rhepo-l-fc 融合蛋白的表达 生物活性和初步药动学分析 1877 质粒 poptivec -TOPO -rhepo-l-fc 浮培养于 EX-CELL TM 302 无血清培养基中, 细胞培 养上清中目的蛋白表达量达到 150 μg/ml 将继续 提高 MTX 浓度加压筛选, 以进一步提高表达水平 Fig. 2 图 2 rhepo-l-fc 融合基因结构图 General structure of fusion gene rhepo-l-fc 图 1a rhepo-l-fc PCR 产物 1% 琼脂糖凝胶电泳 Fig. 1a Analysis of PCR products by 1% agarosegel electrophoresis 1: DL2000 DNA marker; 2: PCR product of Linker-Fc; 3: PCR product of rhepo; 4:PCR product of rhepo-l-fc 2.3 rhepo-l-fc 融合蛋白初步纯化与质谱鉴定经 Protein A 亲和层析柱纯化的样品, 8% SDS- PAGE 显示有一条清晰蛋白条带, 非还原分子量约为 185 kd, 还原型约为 70 kd, 以羊抗人 IgG1 Fc- HRP 抗体为直标抗体进行免疫印迹分析表明, 分子量约为 185 kd 的蛋白条带能与羊抗人 IgG1 Fc-HRP 抗体特异结合 ( 图 3), 质谱检测分子量为 108549.9922 D, 与理论分子质量大小相符, rhepo-l-fc 融合蛋白含有 10 个糖基化位点, SDS-PAGE 显示的表观分子量大于其理论分子量, 这与文献报道一致 [6], 说明该蛋白条带确实为表达的 rhepo-l-fc 融合蛋白 图 1b 重组质粒酶切分析 Fig. 1b Analysis of recombinant vectors 1, 5: DNA marker; 2: pbluescript-rhepo-l-fc digested with Xba I/Hind III; 3: poptivec -TOPO -rhepo-l-fc digested with Xba I/Hind III; 4: poptivec -TOPO -rhepo-l-fc digested with BamH I/Hind III 2.2 获得表达 rhepo-l-fc 融合蛋白的 CHO 细胞系 重组表达质粒转染细胞后, 经无 HT 的缺陷培 养基筛选和有限稀释, 共获得了 30 个单克隆 32D-EPOR 细胞增殖实验比较各个单克隆细胞培养 上清中目的蛋白表达水平, 选择 6 个表达水平相对 较高的单克隆, 分别进行 MTX 加压筛选 MTX 浓 度为 50 nmol/l 时, 将表达量最高的单克隆细胞悬 图 3 纯化的 rhepo-l-fc 融合蛋白 SDS-PAGE Western blotting 图谱 Fig. 3 SDS-PAGE, Western blotting analysis of the purified rhepo-l-fc fusion protein 1: high weight protein marker; 2: monomeric form of rhepo-l-fc fusion protein in reduced condition; 3: chimeric form of rhepo-l-fc fusion protein in non-reduced condition; 4: Western blotting band 2.4 体外活性检测 32D-EPOR 细胞增殖实验显示, rhepo 和 rhepo-l-fc 分别在 0.0066 ng/ml~20 ng/ml 与
1878 ISSN1000-3061 CN11-1998/Q Chin J Biotech November 25, 2008 Vol.24 No.11 0.066 ng/ml~66.7 ng/ml 范围内, 体外活性随浓度的升高而增强, 两者均表现出明显的量效关系, rhepo ED 50 为 0.86 ng/ml, rhepo-l-fc ED 50 为 2 ng/ml( 图 4) rhepo-l-fc 融合蛋白具有体内活性 图 6 Fig. 6 网织红细胞计数检测 rhepo-l-fc 融合蛋白 体内活性 In vivo efficacy of rhepo-l-fc was tested by reticulocyte count 图 4 rhepo-l-fc 融合蛋白体外活性分析 Fig. 4 Biological activity analysis of fusion protein rhepo-l-fc in vitro 2.5 体内药代动力学初步检测 ELISA 检测给药后不同时间点大鼠血浆中 rhepo-l-fc 融合蛋白含量 ( 图 5), 经 3p97 软件计算, 100 μg/kg 单次皮下给予 rhepo-l-fc 后, 达峰时间 (t max ) 为 27 h, 达峰浓度 (Cmax) 为 9.2 ng/ml, 药 - 时曲 线下面积 (AUC 0-120 ) 为 923 ng/(ml h), 消除半衰期 (t 1/2β ) 为 27 h 图 5 rhepo-l-fc 单次皮下注射大鼠血浆浓度 - 时间曲线 Fig. 5 Concentration-time curve of rhepo-l-fc after sc administration to rat 2.6 体内活性初步检测 网织红细胞计数显示, 给药后第 7 d 网织红细 胞明显增加, 到 14 d 时基本降到基础水平, 说明 3 讨论 延长药物的体内半衰期是提高药物疗效的一个重要途径, hepo 人体静脉注射的消除半衰期约为 3 h~14 h, 皮下注射的出峰时间为 5 h~24 h, 消除半衰期约为 17 h [7,8], 为了维持疗效, 病人需每周注射 2 或 3 次, 因此延长 EPO 体内半衰期可以提高病人生活质量, 降低治疗费用 目前已有多种策略用于延长 EPO 的体内半衰期, 提高其体内生物活性 一种方法是增加 EPO 分子量 : EPO 分子聚乙二醇修饰 (PEG 化 ) 或 EPO 分子与载体蛋白 人白蛋白连接, 或通过多肽 (3 至 17 个氨基酸 ) 连接成为同源二聚体 ; 另一种方法是采用基因工程技术提高 EPO 分子糖基化程度 : Amgen 公司生产的第二代重组人 EPO(Aranesp TM ), 在 EPO 分子原有基础上另外增加 2 条 N- 连接糖链, 增加含糖量 [7] 尽管这些方法都在一定程度上延长了 EPO 半衰期, 但有可能改变了 EPO 的分子结构和功能, 带来免疫原性, 降低其活性 Fc 片段是 IgG 保持体内较长半衰期的主要原因, 同时具有稳定蛋白的作用, 因此本研究将 hepo 与 IgG1 Fc 融合表达 IgG1 Fc 片段包括铰链区 (Hinge) 和重链恒定区 (C H 2 C H 3), 铰链区有 3 个半胱氨酸 (C220 C226 C229),C220 与 IgG1 轻链二硫键的形成有关, C226 和 C229 在 2 条重链间形成两对链间二硫键构成 Fc 片段 将 rhepo 与 Fc 融合表达, 使
祝强等 : rhepo-l-fc 融合蛋白的表达 生物活性和初步药动学分析 1879 其分子结构与 IgG 分子结构相似, EPO 分子将变得 更加稳定 ; 而去掉 Fc 铰链 N 端最开始 5 个氨基酸 (E216-C220), 可以防止 C220 形成干扰融合蛋白分 子构相的非特异性二硫键 ; 另外, hepo 分子 C 端第 161 位为半胱氨酸, 该半胱氨酸与铰链区的第一个 半胱氨酸至少应间隔 12 个氨基酸 [6], 因此我们将 hepo 与 Fc 铰链通过 Linker 相连接 (Linker 由 10-20 个选自甘氨酸, 丝氨酸, 丙氨酸, 苏氨酸的氨基酸 组成, 本研究采用 16 个氨基酸 Linker GSGGGSG GGGSGGGGS [9] ), 一方面使 hepo 与 Fc 不能形成干 扰分子结构的二硫键, 另一方面避免 hepo 分子之 间以及 hepo 与 Fc 之间形成空间位阻, 使整个分子 具有更大的柔性, 促使 hepo 能有效与其受体 (EPO-Rc) 结合 ; 根据本试验的设计, hepo 与 Fc 形成 融合蛋白使 hepo 分子量增加了约 3.5 倍, Fc 与 neonatal Fc (FcRn) 受体结合 [10], 动物实验表明 rhepo-l-fc 融合蛋白体内半衰期达到 27 h, 根据文 献报道 [11 13], 大鼠静脉注射 rhepo 的消除半衰期约 为 2.5 h~3 h, 大鼠单次剂量皮下注射后出峰时间 t max 为 8 h~12 h, 消除半衰期 t 1/2β 约为 10 h, 因此 rhepo-l-fc 融合蛋白能延长 hepo 体内半衰期, 同 时具有体内活性, 为系统性的动物药动学实验和药 效实验奠定了基础, 有可能减少注射次数或降低注 射剂量就能达到相应的治疗效果, 带来广阔的市场 前景 致谢 究的资助 感谢健能隆医药技术 ( 上海 ) 有限公司对本研 REFERENCES [1] Fisher JW. Erythropoietin: physiologic and pharmacologic aspects. Proc Soc Exp Biol Med, 1997, 216(3): 358 369. [2] Cohen J, Supino-Rosin L, Barzilay E, et al. Erythropoietin and its receptor: signaling and clinical manifestations. IMAJ, 2002, 4(11): 1072 1076. [3] Blackwell K, Gascon P, Siqounas G, et al. rhepo and improved treatment outcomes: potential modes of action. Oncologist, 2004, 9(suppl 5): 41 47. [4] Jones TD, Halon M, Smith BJ, et al. The development of a modified human IFN-α2b linked to the Fc portion of human IgGl as a novel potential therapeutic for the treatment of hepatitis C virus infection. J Interferon Cytokine Res, 2004, 24(9): 560 572. [5] Lo KM, Sudo Y, Chen J, et al. High level expression and secretion of Fc-X fusion proteins in mammalian cells. Protein Eng, 1998, 11(6): 495 500. [6] Wang HT, Du Y, Zhang R, et al. Recombinant human EPO-Fc fusion proteins with prolonged half-life and enhanced erythropoietic activity in vivo: PCT, WO 2007/ 085084 A1. [7] Macdougall IC. An overview of the efficacy and safety of novel erythropoiesis stimulating protein(nesp). Nephrol Dial Transplant, 2001, 16(suppl 3): 14 21. [8] Joy MS. Darbepoetin-alfa: a novel erythropoiesisstimulating protein. Ann Pharmacother, 2002, 36(7-8): 1183 1192. [9] Sytkowski AJ, Sytkowski, Lunn ED, et al. An erythropoietin fusion protein comprised of identical repeating domains exhibits enhanced biological proterties. J Biol Chem, 1999, 274(35): 24773 24778. [10] Hinton PR, Xiong JM, Johlfs MG, et al. An engineered human IgG1 antibody with longer serum half-life. J Immunol, 2006, 176(1): 346 356. [11] Egrie JC, Dwyer E, Browne JK, et al. Darbepoetin-alfa has a longer circulating half-life and greater in vivo potency than recombinant human erythropoietin. Exp Hematol, 2003, 31(4): 290 299. [12] Egrie JC, Browne JK. Development and characterization of novel erythropoiesis stimulating protein (NESP). Nephrol Dial Transplant, 2001, 16(suppl 3): 3 13. [13] Kato M, Miura K, Kamiyama H, et al. Immunological response to repeated administration of recombinant human erythropoietin in rats. Drug Metab Dispos, 1997, 25(9): 1039 1044.