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227 ELISA 刘 沙 洲 1,2, 桑 小 雪 1, 欧 阳 华 学 3, 雷 绍 荣 3, 白 林 含 1, * (1. 四 川 大 学 生 命 科 学 学 院, 四 川 成 都 610065;2. 成 都 市 食 品 药 品 检 测 中 心, 四 川 成 都 610045; 3. 四 川 省 农 业 科 学 院 分 析 测 试 中 心, 四 川 成 都 610066) 目 的 : 比 较 直 接 和 间 接 竞 争 酶 联 免 疫 法 (enzyme linked immunosorbent assay,elisa) 的 优 缺 点, 建 立 新 霉 素 残 留 ELISA 检 测 方 法 方 法 : 利 用 自 制 的 新 霉 素 多 克 隆 抗 体, 采 用 直 接 竞 争 和 间 接 竞 争 ELISA 方 法 检 测 新 霉 素 残 留, 并 比 较 两 种 方 法 的 优 缺 点 结 果 : 新 霉 素 抗 血 清 和 庆 大 霉 素 的 交 叉 反 应 率 为 2.04%, 和 卡 那 霉 素 的 交 叉 反 应 率 为 0.02%, 和 氨 苄 青 霉 素 红 霉 素 四 环 素 的 交 叉 反 应 率 均 小 于 0.01% 初 步 测 试 新 霉 素 间 接 竞 争 ELISA 法 的 准 确 性 和 回 收 率 板 内 误 差 小 于 4%, 板 间 误 差 小 于 11%, 回 收 率 为 135.5%~191.3% 直 接 竞 争 和 间 接 竞 争 ELISA 方 法 的 检 测 极 限 分 别 为 28.58ng/mL 和 51.74ng/mL, 达 到 了 国 家 对 新 霉 素 规 定 的 500μg/kg MRL 检 测 限 结 论 : 建 立 了 直 接 竞 争 和 间 接 ELISA 吸 附 检 测 方 法, 条 件 优 化 更 成 功 的 间 接 竞 争 ELISA 可 用 于 开 发 新 霉 素 检 测 试 剂 盒 新 霉 素 ; 多 克 隆 抗 体 ; 竞 争 酶 联 免 疫 法 (enzyme linked immunosorbent assay,elisa); 方 法 建 立 Development of Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Neomycin LIU Sha-zhou 1,2,SANG Xiao-xue 1,OUYANG Hua-xue 3,LEI Shao-rong 3,BAI Lin-han 1, * (1. School of Life Sciences, Sichuan University, Chengdu 610065, China;2. Food and Drug Testing Center, Chengdu 610045, China;3. Analysis and Testing Center, Sichuan Academy of Agricultural Sciences, Chengdu 610066, China) Abstract:In this study, we describe the advantages and disadvantages of direct competitive enzyme-linked immunosorbent assay (dc-elisa) and indirect competitive ELISA (idc-elisa) and ELISA methods for the detection of neomycin. Antineomycin polyclonal antibodies were prepared and used to detect neomycin by dc-elisa and idc-elisa. The cross-reaction rates of prepared anti-neomycin polyclonal antibodies with gentamincin and kanamycin were 2.04% and 0.02%, respectively, and with ampicillin, erythromycin and tetracycline all less than 0.01%. The accuracy and recovery of idc-elisa were tested with an intra-plate error of less than 4%, an inter-plate error of less than 11% and a recovery between 135.5% and 191.3%. The detection limits of dc-elisa and idc-elisa were 28.58 ng/ml and 51.74 ng/ml, respectively, both of which were below the national maximum residue limit (MRL) of 500μg/kg. Therefore, a dc-elisa method and an idc-elisa method to detect neomycin have successfully established. Further, the idc-elisa method where the working conditions were better optimized can be used for the development of neomycin test kit. Key words:neomycin;polyclonal antibodies;competitive enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA);method establishment 中 图 分 类 号 :S854 文 献 标 识 码 :A 文 章 编 号 :1002-6630(2011)14-0227-05 从 全 球 来 看, 在 食 用 动 物 中 限 用 禁 用 抗 生 素 饲 料 添 加 剂 已 经 成 为 一 种 发 展 趋 势 在 1997 年, 联 合 国 粮 农 组 织 (food and agriculture organization,fao) 就 要 求 停 止 或 禁 止 使 用 抗 生 素 饲 料 添 加 剂,1998 年 12 月 又 提 议 在 10 年 内 淘 汰 抗 生 素 饲 料 添 加 剂 2004 年, WHO FAO 和 世 界 动 物 卫 生 组 织 (office international des epizooties,oie) 联 合 召 开 了 一 次 专 题 讨 论 会, 讨 论 了 非 人 用 抗 生 素 的 使 用 和 抗 生 素 的 耐 药 性 问 题 发 达 国 家 和 有 关 国 际 组 织 都 对 抗 生 素 在 动 物 饲 料 中 使 用 进 行 了 越 来 越 严 格 的 限 制 特 别 是 不 准 将 人 用 抗 生 素 用 于 动 物, 收 稿 日 期 :2010-04-26 基 金 项 目 : 四 川 省 公 益 性 研 究 计 划 项 目 (2008NG004) 作 者 简 介 : 刘 沙 洲 (1983 ), 女, 硕 士, 主 要 从 事 微 生 物 学 与 生 物 检 测 研 究 E-mail:liushazhou566@sina.com * 通 信 作 者 : 白 林 含 (1970 ), 女, 教 授, 博 士, 主 要 从 事 微 生 物 分 子 生 物 学 研 究 E-mail:bailinhan@scu.edu.cn

228 2011, Vol. 32, No. 14 食 品 科 学 分 析 检 测 在 食 用 动 物 中 禁 用 限 用 抗 生 素 饲 料 添 加 剂 已 经 成 为 世 [1-2] 界 共 识, 是 大 势 所 趋 然 而 我 国 长 期 存 在 滥 用 不 合 理 使 用 抗 生 素 饲 料 添 加 剂 的 情 况, 动 物 性 食 品 中 抗 生 素 残 留 的 问 题 十 分 严 重, 不 仅 给 消 费 者 带 来 健 康 上 的 损 害, 而 且 阻 碍 了 我 国 动 物 产 品 的 出 口 近 几 年, 我 国 不 断 加 强 对 在 食 用 动 物 中 使 用 抗 生 素 现 象 的 监 督 管 理, 以 最 大 限 度 地 减 少 对 食 品 安 全 和 人 类 健 康 的 威 胁 除 了 制 订 修 订 法 律 法 规 建 立 健 全 监 督 检 验 体 系 开 展 残 留 监 控 工 作 外, 还 不 断 对 残 留 的 限 量 作 出 规 定 2002 年, 农 业 部 重 新 [3] 修 订 发 布 兽 药 在 动 物 性 食 品 中 的 最 高 残 留 限 量, 使 规 定 限 量 的 兽 药 达 到 134 种, 主 要 是 抗 生 素 类 药 物, 其 中 就 包 括 新 霉 素 酶 联 免 疫 吸 附 法 (enzyme-linked immunosorbent assay,elisa) 灵 敏 度 高 特 异 性 强 可 用 于 大 量 样 品 的 快 速 筛 选 仪 器 化 程 度 低 检 测 速 度 快 样 品 前 处 理 相 对 简 单 价 格 低 和 适 于 开 发 成 携 带 方 便 的 试 剂 盒 等 优 点, 是 国 内 兽 药 检 测 现 场 监 控 大 量 样 本 筛 查 的 主 要 方 法 用 于 抗 生 素 残 留 检 测 的 主 要 方 法 有 直 接 竞 争 ELISA 法 和 间 接 竞 争 ELISA 法, 本 实 验 拟 比 较 直 接 和 间 接 ELISA 法 的 优 缺 点, 以 建 立 新 霉 素 残 留 ELISA 检 测 方 法 1 材 料 与 方 法 1.1 材 料 试 剂 与 仪 器 [4] KLH-NEO 抗 血 清 包 被 抗 原 BSA-NEO 自 制 ; 牛 血 清 白 蛋 白 HRP-NEO 新 霉 素 硫 酸 盐 庆 大 霉 素 硫 酸 盐 卡 那 霉 素 硫 酸 盐 氨 苄 青 霉 素 红 霉 素 四 环 素 盐 酸 盐 上 海 华 舜 生 物 工 程 有 限 公 司 ; 辣 根 过 氧 化 物 酶 标 羊 抗 兔 IgG 博 士 德 生 物 工 程 有 限 公 司 0.1mol/L 柠 檬 酸 0.2mol/L 十 二 水 磷 酸 氢 二 钠 邻 苯 二 胺 过 氧 化 氢 2mol/L 硫 酸 ph7.4 磷 酸 缓 冲 盐 水 -0.05% Tween20( 简 称 PBS-Tween 20) ph9.6 碳 酸 盐 缓 冲 液 磷 酸 盐 缓 冲 液 (PBS) 3550 型 酶 标 测 定 仪 美 国 Bio-RAD 公 司 ; 酶 标 板 成 都 博 瑞 克 生 物 技 术 有 限 公 司 1.2 方 法 1.2.1 直 接 竞 争 ELISA 反 应 条 件 的 建 立 1.2.1.1 最 佳 包 被 抗 血 清 用 量 与 最 佳 HRP-NEO 配 比 采 用 方 阵 测 定 法, 包 被 不 同 质 量 浓 度 的 抗 血 清 和 阴 性 血 清, 直 接 测 定 HRP-NEO, 以 OD45nm 接 近 于 1.0 为 最 佳 反 应 条 件 1.2.1.2 最 佳 反 应 时 间 设 定 抗 血 清 和 HRP-NEO 的 反 应 时 间 为 20 40 60 80 100 120min, 选 择 适 当 的 反 应 时 间 1.2.1.3 采 用 直 接 竞 争 ELISA 法 建 立 新 霉 素 标 准 曲 线 用 系 列 已 知 质 量 浓 度 的 新 霉 素 和 酶 标 新 霉 素 HRP- NEO 进 行 直 接 竞 争 ELISA 反 应, 然 后 以 B /B 0(B 0 为 0ng/mL 孔 的 显 色 值,B 为 其 他 质 量 浓 度 孔 的 显 色 值 ) 为 纵 坐 标, 新 霉 素 质 量 浓 度 的 常 用 对 数 为 横 坐 标 作 图, 得 到 标 准 曲 线 根 据 待 测 样 品 的 B / B 0 值, 可 由 标 准 曲 线 推 算 出 待 测 样 品 中 新 霉 素 的 质 量 浓 度 1.2.2 间 接 竞 争 ELISA 反 应 条 件 的 优 化 1.2.2.1 酶 标 抗 体 工 作 用 量 的 选 择 包 被 一 抗 直 接 测 二 抗, 以 值 接 近 于 1.0 时 的 酶 标 二 抗 稀 释 度 为 最 适 工 作 用 量 1.2.2.2 最 佳 包 被 抗 原 用 量 与 最 佳 反 应 血 清 用 量 采 用 方 阵 测 定 法, 加 入 BSA-NEO 作 为 包 被 抗 原, 再 加 入 KLH-NEO 抗 血 清 和 阴 性 血 清, 按 ELISA 操 作 程 序 进 行, 最 后 测 定 值, 以 值 接 近 于 1.0 为 最 佳 反 应 条 件 1.2.2.3 最 佳 反 应 时 间 设 定 抗 血 清 和 BSA-NEO 的 反 应 时 间 为 20 40 60 80 100min, 选 择 适 当 的 反 应 时 间 1.2.2.4 采 用 间 接 竞 争 ELISA 法 建 立 新 霉 素 标 准 曲 线 用 系 列 已 知 质 量 浓 度 的 新 霉 素 和 抗 血 清 进 行 间 接 竞 争 ELISA 反 应, 然 后 以 B/B0(B0 为 0ng/mL 孔 的 显 色 值, B 为 其 他 质 量 浓 度 孔 的 显 色 值 ) 为 纵 坐 标, 新 霉 素 质 量 浓 度 常 用 对 数 为 横 坐 标 作 图, 得 到 标 准 曲 线 根 据 待 测 样 品 的 B/B0 值, 可 由 标 准 曲 线 推 算 出 待 测 样 品 中 新 霉 素 的 质 量 浓 度 [5] 1.2.3 交 叉 反 应 的 测 定 采 用 间 接 竞 争 ELISA 法 测 定 庆 大 霉 素 卡 那 霉 素 氨 苄 青 霉 素 四 环 素 红 霉 素 和 KLH-NEO 抗 血 清 的 结 合 反 应 新 霉 素 的 I 50 与 这 些 抗 生 素 的 I 50 的 百 分 比 为 交 叉 反 应 率, 交 叉 反 应 率 的 高 低 决 定 了 它 们 对 新 霉 素 检 测 干 扰 程 度 的 大 小 1.2.4 方 法 准 确 性 的 测 定 人 工 添 加 新 霉 素 到 PBS 空 白 液 中, 使 其 在 PBS 中 的 终 质 量 浓 度 为 60 250ng/mL 以 板 内 误 差 及 板 间 误 差 来 表 示 该 方 法 的 精 确 度 板 内 测 定 为 同 一 酶 标 板 上 同 一 样 本 若 干 孔 的 平 均 值, 板 间 测 定 为 不 同 酶 标 板 上 几 次 测 定 结 果 的 平 均 值, 本 实 验 中 板 内 误 差 和 板 间 误 差 均 取 3 次 测 定 的 平 均 值 为 准 1.2.5 回 收 率 的 测 定 回 收 率 测 定 实 验 主 要 检 验 检 测 方 法 的 可 靠 性 将 新 霉 素 质 量 浓 度 为 60 250ng/mL 的 PBS 溶 液 各 取 0.1mL 进 行 间 接 竞 争 ELISA 同 时 以 没 有 加 入 新 霉 素 的 PBS 作 为 正 对 照 测 定 时 每 个 样 品 质 量 浓 度 设 定 3 个 重 复, 并 重 复 3 次 实 验 然 后 进 行 间 接 竞 争 ELISA 测 定, 计

229 算 抑 制 率, 代 入 标 准 回 归 方 程, 计 算 NEO 的 含 量, 并 根 据 下 式 计 算 回 收 率 : 实 测 值 回 收 率 /% = 100 添 加 值 2 结 果 与 分 析 2.1 直 接 竞 争 ELISA 法 2.1.1 反 应 条 件 的 建 立 2.1.1.1 最 佳 包 被 抗 血 清 用 量 与 最 佳 HRP-NEO 配 比 表 1 最 佳 包 被 抗 血 清 用 量 与 最 佳 HRP-NEO 配 比 Table 1 Determination of optimal coating antiserum concentration and HRP/NEO ratio HRP-NEO OD 450nm 配 比 (g/ml) 抗 血 清 1:500 抗 血 清 1:1000 抗 血 清 1:2000 抗 血 清 1:4000 抗 血 清 1:8000 1:250 0.470 0.469 0.461 0.433 0.427 1:500 0.437 0.502 0.468 0.450 0.443 1:1000 0.386 0.419 0.427 0.403 0.407 1:2000 0.211 0.280 0.281 0.275 0.274 1:4000 0.140 0.113 0.145 0.158 0.154 2.1.2 新 霉 素 标 准 曲 线 的 建 立 B/B0/% 120 100 80 y= - 16.657x + 114.26 R 2 =0.9966 60 40 20 0 0 2 4 6 图 2 新 霉 素 标 准 曲 线 ( 直 接 竞 争 ELISA 法 ) Fig.2 Standard curve for neomycin determination by dc-elisa 如 图 2 所 示,B/B0 达 到 90% 时 的 新 霉 素 质 量 浓 度 为 该 实 验 的 最 低 检 测 极 限, 根 据 回 归 方 程, 计 算 出 该 直 接 竞 争 ELISA 检 测 方 法 的 检 测 限 是 28.58ng/mL, 达 到 了 国 家 对 新 霉 素 规 定 的 500μg/kg MRL 检 测 限 2.2 间 接 竞 争 ELISA 法 2.2.1 反 应 条 件 的 确 立 新 霉 素 质 量 浓 度 (ng/ml) 常 用 对 数 2.2.1.1 酶 标 二 抗 工 作 用 量 由 表 1 可 知, 在 抗 血 清 用 量 为 1:1000 HRP-NEO 配 比 为 1:500 时, 最 大, 初 步 确 定 最 佳 包 被 抗 血 清 用 量 1:1000 最 佳 HRP-NEO 配 比 1:500 作 为 对 照 的 阴 性 血 清 几 乎 没 有 显 色 2.1.1.2 最 佳 反 应 时 间 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 20 40 60 80 100 120 反 应 时 间 /min 图 1 直 接 竞 争 ELISA 法 最 佳 反 应 时 间 Fig.1 Determination of optimal reaction time of dc-elisa 由 图 1 可 知, 反 应 时 间 60min 时, 显 色 效 果 最 好, 因 此 确 定 直 接 竞 争 ELISA 法 的 显 色 时 间 为 60min 表 2 酶 标 二 抗 用 量 的 确 定 Table 2 Determination of optimal enzyme labeled secondary antibody concentration 一 抗 用 量 (g/ml) 二 抗 1:1000 二 抗 1:2000 二 抗 1:4000 二 抗 1:8000 二 抗 1:16000 二 抗 1:32000 1:500 1.730 0.779 0.524 0.360 0.242 0.091 1:1000 1.754 0.915 0.681 0.516 0.343 0.130 1:2000 1.775 1.059 0.846 0.676 0.403 0.207 1:4000 1.775 1.106 0.930 0.726 0.418 0.260 1:8000 1.782 1.159 1.139 0.800 0.522 0.291 1:16000 1.797 1.189 1.074 0.822 0.587 0.345 1:32000 1.778 1.207 1.011 0.699 0.512 0.287 1:64000 1.698 0.902 0.819 0.470 0.348 0.167 由 表 2 可 知, 二 抗 稀 释 倍 数 为 2000 的 时 候, 值 最 接 近 1.0 所 以, 确 定 二 抗 的 最 佳 用 量 为 1:2000 2.2.1.2 最 佳 包 被 抗 原 质 量 浓 度 与 最 佳 反 应 血 清 用 量 由 表 3 可 知, 抗 血 清 1:2000 稀 释 抗 原 1:400 稀 释 时, 值 接 近 1.0, 且 相 近 数 据 差 别 不 大 所 以, 确 定 KLH-NEO 抗 血 清 1:2000 稀 释 BSA-NEO 抗 原 1:400 抗 原 用 量 (g/ml) 表 3 包 被 抗 原 用 量 和 血 清 用 量 的 确 定 Table 3 Determination of optimal coating antigen and serum concentrations 一 抗 1:500 一 抗 1:1000 一 抗 1:2000 一 抗 1:4000 一 抗 1:8000 一 抗 1:16000 一 抗 1:32000 一 抗 1:64000 1:50 1.359 1.188 0.948 0.767 0.457 0.162 0.109 0.005 1:100 1.275 1.177 0.832 0.730 0543 0.203 0.047 0.006 1:200 1.230 1.204 0.999 0.629 0.540 0.086 0.010 0.005 1:400 1.070 1.062 1.105 1.105 0.565 0.060 0.003 0.003 1:800 0.955 0.873 0.893 0.680 0.343 0.058 0.003 0.004

230 2011, Vol. 32, No. 14 食 品 科 学 分 析 检 测 稀 释 作 为 对 照 的 阴 性 血 清 几 乎 没 有 显 色 2.2.1.3 最 佳 反 应 时 间 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 20 40 60 80 100 反 应 时 间 /min 图 3 间 接 竞 争 ELISA 法 最 佳 反 应 时 间 Fig.3 Determination of optimal reaction time of idc-elisa 由 图 3 可 知, 反 应 时 间 为 60min 时, 显 色 效 果 最 好 2.2.2 新 霉 素 标 准 曲 线 的 建 立 B/BO/% 120 100 80 y= - 11.337x + 109.43 R 2 =0.9939 60 40 20 0 0 2 4 6 新 霉 素 质 量 浓 度 (ng/ml) 常 用 对 数 图 4 新 霉 素 标 准 曲 线 ( 间 接 竞 争 ELISA 法 ) Fig.4 Standard curve for neomycin determination by idc-elisa 如 图 4 所 示, 根 据 回 归 方 程, 计 算 出 标 准 曲 线 中 I50 为 174.58μg/mL 间 接 竞 争 ELISA 检 测 方 法 的 检 测 极 限 是 51.74ng/mL, 达 到 了 国 家 标 准 对 新 霉 素 规 定 的 500 μg/kg MRL 检 测 限 2.2.3 新 霉 素 抗 体 和 其 他 抗 生 素 的 交 叉 反 应 率 表 4 新 霉 素 抗 体 和 其 他 抗 生 素 交 叉 反 应 率 实 验 结 果 Table 4 Cross-reaction rates of prepared anti-neomycin antibodies with other antibiotics 生 素 庆 大 霉 素 卡 那 霉 素 氨 苄 青 霉 素 红 霉 素 四 环 素 交 叉 反 应 率 /% 2.04 0.02 < 0.01 < 0.01 < 0.01 新 霉 素 的 I50 与 其 他 抗 生 素 的 I50 的 百 分 比 为 交 叉 反 应 率, 交 叉 反 应 率 的 高 低 决 定 了 它 们 对 新 霉 素 检 测 的 干 扰 程 度 大 小 本 实 验 选 取 了 5 种 抗 生 素 来 进 行 交 叉 反 应 率 的 测 定 其 中, 庆 大 霉 素 卡 那 霉 素 属 于 氨 基 糖 苷 类 抗 生 素, 和 新 霉 素 属 同 一 大 类 ; 由 表 4 可 知, 新 霉 素 抗 体 和 庆 大 霉 素 及 卡 那 霉 素 存 在 一 定 的 交 叉 反 应, 与 青 霉 素 四 环 素 红 霉 素 几 乎 没 有 交 叉 反 应 (< 0.01%), 这 说 明 抗 体 的 特 异 性 好 新 霉 素 抗 体 与 庆 大 霉 素 卡 那 霉 素 存 在 交 叉 反 应 是 因 为 庆 大 霉 素 卡 那 霉 素 和 新 霉 [6] 素 同 属 氨 基 糖 苷 类 抗 生 素, 存 在 结 构 上 的 相 似 性 而 青 霉 素 属 内 酰 胺 类 抗 生 素 ; 四 环 素 属 四 环 素 类 抗 生 素 ; [7] 红 霉 素 属 大 环 内 酯 类 抗 生 素 2.2.4 方 法 准 确 性 的 考 察 表 5 变 异 系 数 实 验 结 果 Table 5 Coefficients of variation for inter-plate and intra-plate precision of idc-elisa NEO 质 量 浓 板 间 板 内 度 /(ng/ml) B/B0/% 变 异 系 数 /% B/B0/% 变 异 系 数 /% 60 95.7 83.9 77.5 10.7 95 95.1 97 1.18 250 82.8 79.3 76.9 4.39 86.5 80.7 81.2 3.88 如 表 5 所 示,NEO 添 加 质 量 浓 度 为 60ng/mL 时,3 次 重 复 测 定 的 板 内 变 异 系 数 为 1.18%, 板 间 变 异 系 数 为 10.7%;NEO 添 加 质 量 浓 度 为 250ng/mL 时,3 次 重 复 测 定 的 板 内 变 异 系 数 为 3.88%, 板 间 变 异 系 数 为 4.39%; 说 明 该 方 法 的 稳 定 性 较 好 2.2.5 回 收 率 表 6 回 收 率 考 察 实 验 结 果 Table 6 Results of spike recovery test of idc-elisa NEO 添 加 质 量 浓 度 /(ng/ml) 实 测 值 /(ng/ml) 回 收 率 /% 60 114.82 191.3 250 338.84 135.54 如 表 6 所 示,NEO 添 加 质 量 浓 度 为 60ng/mL 时 的 回 收 率 不 及 添 加 质 量 浓 度 为 250ng/mL 时 的 回 收 率 理 想, 可 能 因 为 60ng/mL 已 接 近 于 该 方 法 的 检 测 限 51.29ng/mL, 导 致 误 差 较 大 3 讨 论 本 实 验 采 用 直 接 竞 争 和 间 接 竞 争 ELISA 初 步 建 立 了 新 霉 素 残 留 的 酶 联 免 疫 测 定 方 法 两 种 方 法 检 测 极 限 都 达 到 了 国 家 对 新 霉 素 规 定 的 500μg/kg MRL 检 测 限 在 本 实 验 进 行 的 3 次 实 验 中, 间 接 竞 争 ELISA 法 的 稳 定 性 明 显 的 强 于 直 接 竞 争 ELISA 法, 这 可 能 与 本 实 验 室 制 备 的 新 霉 素 多 克 隆 抗 体 质 量 有 关 抗 体 是 酶 联 免 疫 测 定 中 最 关 键 的 成 分, 提 高 检 测 方 法 的 稳 定 性 灵 敏 性, 关 键 在 于 提 高 抗 体 的 质 量, 要 解 决 这 个 问 题, 首 先 可 以 [8-12] 从 制 备 新 霉 素 单 克 隆 抗 体 入 手 相 对 于 多 克 隆 抗 体, 单 克 隆 抗 体 具 有 更 高 的 特 异 性 纯 度 均 质 性 和 重 复 性 建 立 一 个 成 熟 的 酶 联 免 疫 测 定 方 法, 需 要 进 行 稳 定 性 实 验, 用 大 量 的 实 验 数 据 考 察 方 法 的 交 叉 反 应 率 板

231 内 误 差 板 间 误 差 和 回 收 率 在 此 基 础 上 还 需 要 增 加 [13] [14] 检 测 基 质 的 种 类, 进 行 样 品 添 加 实 验, 如 在 牛 奶 [15] 动 物 组 织 中 人 工 添 加 新 霉 素 后 再 测 定 回 收 率 总 体 来 说, 要 得 到 一 个 成 熟 稳 定 的 检 测 体 系, 在 抗 体 基 质 等 方 面 还 有 许 多 的 工 作 要 做 参 考 文 献 : [1] 张 彦 明, 佘 锐 萍. 动 物 性 食 品 卫 生 学 [M]. 3 版. 北 京 : 中 国 农 业 出 版 社, 2002: 73-86. [2] 赵 红 梅, 金 升 藻. 滥 用 抗 生 素 对 人 畜 的 危 害 及 对 策 研 究 [J]. 国 外 医 药 : 抗 生 素 分 册, 2003, 24(4): 164-167. [3] 农 业 部 第 235 号 公 告. 动 物 性 食 品 中 兽 药 最 高 残 留 限 量 [S]. 2002. [4] 刘 沙 洲, 黄 非, 王 丽 丽, 等. 新 霉 素 酶 联 免 疫 检 测 方 法 的 研 究 : 新 霉 素 抗 体 的 制 备 [J]. 食 品 科 技, 2007(3): 208-211. [5] 石 德 时, 王 桂 枝, 毕 丁 仁, 等. 氯 霉 素 抗 体 的 制 备 [J]. 华 中 农 业 大 学 学 报, 2001, 20(5): 463-465. [6] LOOMANS E E, Van WILTENBURG J, KOETS M, et al. Neomin as an immunogen for the development of a generic ELISA detecting gentamicin, kanamycin, and neomycin in milk[j]. Journal of agricultural and food chemistry, 2003, 51(3): 587-593. [7] STOLKER A A, BRINKMAN U A. Analytical strategies for residue analysis of veterinary drugs and growth-promoting agents in food-producing animals: a review[j]. Journal of Chromatography A, 2005, 1067 (1/2): 15-33. [8] 葛 红 霞. 单 克 隆 抗 体 技 术 及 其 应 用 [J]. 畜 牧 兽 医 科 技 信 息, 2007(3): 9-10. [9] 谭 雅 丽, 石 德 时, 王 桂 枝, 等. 抗 氯 霉 素 单 克 隆 抗 体 的 制 备 及 鉴 定 [J]. 中 国 预 防 兽 医 学 报, 2000( 增 刊 1): 63-65. [10] 魏 书 林, 曹 振, 沈 建 忠, 等. 抗 氯 霉 素 单 克 隆 抗 体 的 制 备 和 鉴 定 [J]. 中 国 兽 医 杂 志, 2004, 40(8): 62-64. [11] 王 选 年, 杨 艳 艳, 李 青 梅, 等. 盐 酸 克 伦 特 罗 单 克 隆 抗 体 的 制 备 及 其 特 性 [J]. 河 南 农 业 科 学, 2002(6): 30-33. [12] 蔡 勤 仁, 曾 振 灵, 杨 桂 香. 恩 诺 沙 星 单 克 隆 抗 体 的 制 备 及 鉴 定 [J]. 中 国 农 业 科 学, 2004, 37(7): 1060-1064. [13] 许 艇, 秦 治 翔, 王 文 珺, 等. 甲 萘 威 ELISA 方 法 的 建 立 及 初 步 应 用 [J]. 应 用 与 环 境 生 物 学 报, 2004, 10(5): 569-572. [14] 李 利 东, 宓 晓 黎, 袁 建 兴, 等. 酶 联 免 疫 检 测 试 剂 盒 应 用 于 牛 奶 中 四 环 素 残 留 的 测 定 [J]. 乳 业 科 学 与 技 术, 2004(2): 52-54. [15] 关 嵘. 应 用 酶 联 免 疫 技 术 检 测 动 物 源 性 食 品 中 氯 霉 素 残 留 的 研 究 [J]. 检 验 检 疫 科 学, 2002, 12(4): 5-10.