检 验 过 程 临 床 PCR 检 验 标 本 的 处 理 保 存 及 核 酸 提 取 方 法 医 师 申 请 检 验 项 目 申 请 患 者 准 备 患 者 识 别 样 本 采 集 样 本 运 送 Ⅰ Ⅱ Ⅲ 分 析 测 定 样 本 处 理 分 析 前 分 析 中 分 析 后 报 告 临 床 应 用 烟 台 市 烟 台 山 医 院 赵 善 娜 结 合 临 床 资 料 分 析 结 果 并 确 认 出 具 检 验 报 告 并 解 释 结 果 用 于 临 床 诊 治 2 分 析 前 :68.2% 分 析 中 :13.3% 分 析 后 :18.5% Clinical Chemistry 1997, 43 (8) :1348~1351 3 4 临 床 标 本 采 集 运 送 以 及 保 存 的 特 点 标 本 的 正 确 采 集 1. 标 本 类 型 复 杂, 标 本 采 集 的 专 业 性 较 强 2. 涉 及 的 人 员 部 门 和 环 节 多 部 门 多 临 床 科 室 护 理 部 门 门 诊 采 血 处 病 理 科 等 医 生 对 患 者 病 情 和 实 验 室 检 测 的 了 解 患 者 是 否 被 详 细 的 告 知 人 员 多 临 床 医 师 护 士 工 人 受 检 者 检 验 人 员 等 3. 标 本 保 存 的 复 杂 性 和 时 效 性 是 否 全 面 考 虑 标 本 采 集 的 影 响 因 素 5 6 1
标 本 采 集 的 影 响 因 素 标 本 采 集 的 时 间 标 本 采 集 时 间 标 本 采 集 部 位 的 准 备 标 本 的 类 型 和 采 集 量 保 存 及 运 送 条 件 采 样 质 量 的 评 价 病 人 的 生 理 特 点 和 周 期 空 腹 采 集 血 清 避 免 血 脂 等 干 扰 无 创 产 前 DNA 检 测 推 荐 时 间 为 妊 娠 期 13-26 周 检 测 时 间 和 后 续 检 测 和 治 疗 的 时 效 性 无 创 产 前 DNA 检 测 也 要 考 虑 核 型 分 析 的 最 佳 检 测 时 间 7 患 者 疾 病 发 展 的 不 同 时 期 以 方 便 患 者 和 检 验 人 员 集 中 收 集 标 本 及 时 检 测 为 原 则 8 标 本 的 类 型 和 采 集 量 采 集 部 位 的 准 备 根 据 疾 病 分 型 判 断 检 测 对 象 是 否 具 有 检 测 意 义 非 小 细 胞 肺 癌 or 其 他 根 据 所 检 测 的 病 原 体 ( 目 的 基 因 ) 的 部 位 决 定 标 本 的 类 型 HBV-DNA 检 测 的 标 本 类 型 为 血 清 肿 瘤 个 体 化 治 疗 检 测 标 本 类 型 多 为 肿 瘤 组 织 的 石 蜡 切 片 耳 聋 基 因 检 测 标 本 类 型 为 全 血 标 本 或 干 血 片 清 洁 消 毒 标 本 采 集 部 位 去 掉 污 染 的 微 生 物 及 其 他 杂 物 清 洁 消 毒 需 适 度 由 经 过 培 训 的 专 业 人 员 进 行 采 集 量 根 据 实 验 室 所 采 用 的 检 测 方 法 和 试 剂 盒 而 定 分 子 诊 断 采 血 量 一 般 不 少 于 2mL, 无 创 产 前 DNA 检 测 不 少 于 7mL 9 10 采 样 运 输 容 器 和 防 污 染 措 施 标 本 的 运 送 样 本 一 经 采 集, 则 应 尽 可 能 快 的 送 至 检 测 实 验 室 标 本 采 集 采 用 一 次 性 材 料 应 选 用 EDTA 或 枸 橼 酸 钠 抗 凝 的 采 血 管 收 集 全 血 标 本 应 装 在 封 闭 的 无 菌 一 次 性 容 器 中 特 殊 标 本 应 收 集 在 专 用 的 容 器 中 用 于 提 取 RNA 的 标 本 应 收 集 在 无 RNase 污 染 的 容 器 无 创 DNA 产 前 筛 查 远 距 离 运 输 时 使 用 Streck 管 11 样 本 中 如 加 入 了 适 当 的 稳 定 剂, 如 用 于 RNA 测 定 加 入 GITC 的 血 清 ( 浆 ) 样 本 和 用 于 DNA 测 定 的 EDTA 抗 凝 血 等, 则 可 在 室 温 下 运 送 或 邮 寄 实 验 室 应 根 据 待 测 靶 核 酸 的 特 性, 对 各 种 临 床 样 本 的 运 送 条 件 作 出 相 应 的 规 定 2
采 集 质 量 的 评 价 标 本 的 拒 收 原 因 血 液 标 本 是 否 发 生 溶 血 脂 浊 和 黄 疸 等 情 况 标 本 采 集 后 的 保 存 条 件 以 及 运 送 时 间 是 否 符 合 要 求 临 床 所 提 供 的 标 本 是 不 是 试 剂 盒 所 能 检 测 的 类 型 需 要 其 他 科 室 进 行 采 集 质 量 评 价 的 情 况 下, 要 充 分 的 进 行 沟 通 和 交 流 经 查 对 标 本 的 病 人 信 息 与 LIS 系 统 不 符 采 集 的 标 本 类 型 不 符 合 要 求 采 集 量 不 足 标 本 送 检 前 保 存 的 条 件 不 符 合 要 求 未 使 用 正 确 的 抗 凝 剂 血 液 标 本 出 现 严 重 的 凝 血 溶 血 等 异 常 情 况 13 没 有 医 嘱, 来 历 不 明 的 标 本 临 床 标 本 的 处 理 和 保 存 血 清 ( 浆 ) 血 清 ( 浆 ) 全 血 痰 棉 拭 子 脓 液 体 液 组 织 对 于 DNA 测 定 的 标 本, 可 按 照 一 般 的 血 清 标 本 处 理 程 序, 对 测 定 影 响 不 大 对 于 RNA 测 定 的 标 本 ( 如 HCV), 抗 凝 后 6 小 时 内 分 离 血 浆, 如 使 用 血 清 标 本, 则 需 尽 快 (2 小 时 内 ) 分 离 血 清, 标 本 的 短 期 (15 天 内 ) 保 存 可 在 -20 下, 较 长 期 保 存 应 在 - 70 下 全 血 痰 抗 凝 剂 不 能 选 择 肝 素 全 血 标 本 主 要 是 提 取 单 个 核 细 胞 中 的 核 酸 : 基 因 组 DNA 线 粒 体 DNA 和 总 RNA 等 单 个 核 细 胞 的 制 备 途 径 : 临 床 上 主 要 用 作 结 核 杆 菌 DNA 测 定 样 本 含 有 大 量 的 粘 蛋 白 和 杂 质, 因 此 在 核 酸 提 取 时, 要 用 4% 的 NaOH 液 化, 去 除 粘 蛋 白, 然 后 提 取 核 酸 1. 使 用 淋 巴 细 胞 分 离 液 分 离 制 备 2. 使 用 红 细 胞 裂 解 液 裂 解 全 血 中 的 红 细 胞, 再 经 过 生 理 盐 水 洗 涤 即 可 得 到 单 个 核 细 胞 单 个 核 细 胞 如 果 不 提 取 核 酸, 可 保 存 于 -70 17 3
常 用 方 法 一 定 体 积 的 痰 加 入 4 倍 体 积 4%NaOH 取 1mL 液 化 后 的 痰 液 加 到 1.5mLEppendorf 管 中 物 摇 匀, 室 温 放 置 30min 左 右 液 化 生 理 盐 水 洗 涤 2 遍 体 液 体 液 标 本, 包 括 胸 水 腹 水 脑 脊 液 尿 液 等, 可 直 接 离 心, 取 物 提 取 核 酸 血 性 胸 腹 水, 可 使 用 红 细 胞 裂 解 液 处 理 : 加 入 等 体 积 红 细 胞 裂 解 液, 震 荡 混 匀, 静 置 10min 10000rpm, 离 心 5 分 钟, 弃 上 清 物 经 生 理 盐 水 洗 涤 后 用 于 核 酸 提 取 DNA 提 取 棉 拭 子 脓 液 用 PCR 方 法 检 测 性 病 病 原 体 时 ( 衣 原 体 支 原 体 淋 球 菌 梅 毒 螺 旋 体 HPV 等 ) 临 床 标 本 一 般 为 棉 拭 子 标 本 取 材 是 关 键, 衣 原 体 等 病 原 体 感 染 上 皮 细 胞, 因 此 取 材 一 定 要 取 到 细 胞 分 枝 杆 菌 同 痰 液 粘 稠 脓 液 非 分 枝 杆 菌 加 入 适 量 生 理 盐 水 震 荡, 静 置 取 上 清 后 离 心 水 样 脓 液 直 接 离 心 洗 涤, 再 离 心 处 理 时 将 棉 拭 子 置 于 适 量 的 生 理 盐 水 中, 充 分 震 荡 洗 涤 后, 室 温 静 止 5-10 分 钟, 取 上 清, 离 心 后 的, 经 生 理 盐 水 洗 涤 一 次 后, 可 用 于 核 酸 提 取 核 酸 提 取 组 织 组 织 有 新 鲜 组 织 块 和 石 蜡 切 片 新 鲜 组 织 块 的 处 理 步 聚 首 先 用 生 理 盐 水 洗 两 次, 然 后 将 其 捣 碎 或 切 碎, 加 入 生 理 盐 水 后 剧 烈 震 荡 混 匀, 离 心, 弃 上 清, 再 用 蛋 白 酶 K 消 化 后 提 取 核 酸 新 鲜 组 织 最 好 是 保 存 于 50% 乙 醇 中, 具 体 作 法 是, 先 用 生 理 盐 水 将 组 织 洗 一 次, 切 成 宽 度 小 于 1cm 的 小 片, 加 入 适 量 的 生 理 盐 水, 然 后, 边 摇 边 加 入 无 水 乙 醇 至 终 浓 度 为 50%. 这 样 固 定 的 组 织 标 本 室 温 下 可 保 存 数 日,4 可 保 存 6 年 EGFR 等 检 测 推 荐 使 用 10% 的 福 尔 马 林 固 定 : 活 检 小 标 本 固 定 6-24h, 手 术 切 除 的 大 标 本 固 定 8-48h 石 蜡 切 片 用 于 核 酸 提 取, 需 先 用 辛 烷 或 二 甲 苯 脱 蜡, 再 用 蛋 白 酶 K 消 化 后 即 可 进 行 DNA 提 取 临 床 标 本 的 滤 纸 上 保 存 临 床 标 本 置 于 经 过 处 理 的 滤 纸 片 上, 如 靶 核 酸 为 DNA, 可 室 温 保 存 数 月 至 数 年, 如 靶 核 酸 为 RNA, 则 可 稳 定 数 周 保 存 在 滤 纸 上 的 标 本, 保 存 时 间 长, 还 可 因 为 标 本 中 的 PCR 抑 制 物 如 血 红 蛋 白 酶 免 疫 球 蛋 白 等 吸 附 于 滤 纸 上, 而 不 对 后 面 的 扩 增 检 测 造 成 影 响 不 管 是 全 血 血 清 ( 浆 ) 还 是 尿 液 粪 便 分 泌 物 等 均 可 此 种 方 法 4
案 例 分 析 核 酸 的 分 离 纯 化 下 午, 临 床 医 师 打 电 话 咨 询, 有 一 个 病 人, 上 午 已 经 抽 血 做 了 生 化 检 测, 但 是 还 想 检 测 HCV-RNA, 由 于 患 者 不 想 二 次 抽 血, 可 不 可 以 用 生 化 的 标 本, 再 做 一 下 HCV-RNA 的 检 测? 容 易 污 染, 必 须 专 管 单 独 检 测 容 易 降 解, 处 理 保 存 条 件 不 合 理 经 典 方 法 煮 沸 法 硅 吸 附 法 磁 珠 法 商 品 化 试 剂 盒 对 其 核 酸 提 取 的 有 效 性 进 行 评 价 26 DNA 提 取 的 经 典 方 法 材 料 准 备 破 碎 细 胞 核 酸 释 放 与 纯 化 优 点 : 提 取 的 DNA 纯 度 高 AC 或 吸 附 核 酸, 进 一 步 纯 化 核 酸 溶 解 于 缓 冲 液 或 水 中 缺 点 : 操 作 复 杂 DNA 损 失 严 重 不 适 于 模 板 量 较 小 的 标 本 28 煮 沸 法 的 基 本 原 理 煮 沸 法 提 取 DNA 应 用 : HBV-DNA 提 取 TB-DNA 提 取 质 粒 提 取 小 分 子 量 的 环 状 DNA 血 清 加 入 浓 缩 液 离 心, 去 上 清 原 理 :1. 血 清 等 溶 液 在 加 热 处 理 后 蛋 白 质 和 DNA 均 会 变 性 2. 线 状 染 色 体 DNA 容 易 发 生 变 性, 共 价 闭 环 的 DNA 虽 然 也 会 变 性, 但 冷 却 时 即 恢 复 其 天 然 构 象 优 点 : 操 作 简 单 缺 点 : 血 清 成 分 容 易 干 扰 PCR 加 入 DNA 提 取 液 混 匀 100 加 热 10min 加 入 DNA 提 取 液 优 点 : 可 以 显 著 地 去 除 血 清 成 分 的 干 扰 3. 变 性 染 色 体 DNA 片 段 与 变 性 的 蛋 白 质 和 细 胞 碎 片 结 合 形 成 4. 复 性 的 超 螺 旋 共 价 闭 合 环 状 DNA 分 子 以 溶 解 的 状 态 存 在 与 液 相 中 从 而 通 过 离 心 将 两 者 分 开 4 冷 却 离 心 取 上 清 进 行 反 应 缺 点 : 操 作 复 杂 去 上 清 时 容 易 吸 走 造 成 结 果 偏 低 30 5
固 相 吸 附 法 RNA 的 不 稳 定 性 二 氧 化 硅 吸 附 法 磁 珠 法 RNA 容 易 被 RNA 酶 切 割 水 解 RNA 酶 含 量 丰 富, 加 热 后 仍 能 正 确 折 叠 恢 复 活 性, 不 易 失 活 31 提 取 RNA 的 注 意 事 项 经 常 更 换 新 手 套 使 用 灭 过 菌 的 一 次 性 塑 料 制 品 和 枪 头, 且 避 免 交 叉 污 染 实 验 室 用 的 普 通 玻 璃 器 皿 经 常 有 RNase 污 染, 使 用 前 必 须 于 180 干 烤 8 小 时 以 上, 或 用 0.1% 焦 碳 酸 二 乙 酯 (DEPC) 的 水 溶 液 浸 泡 用 于 制 备 RNA 的 烧 杯, 试 管 和 其 它 用 品 配 制 溶 液 的 用 水 必 须 高 压 灭 菌, 配 好 的 溶 液 先 用 0.1% 的 DEPC37 处 理 12 小 时, 高 压 去 除 痕 量 的 DEPC RNA 提 取 的 常 用 方 法 表 面 活 性 剂 加 蛋 白 酶 K, 酚 氯 仿 抽 提 法 胍 盐 提 取 结 合 酚 氯 仿 抽 提 法 结 合 玻 璃 粉 二 氧 化 硅 等 颗 粒 悬 浮 吸 附 法 等 RNA 提 取 的 步 骤 异 硫 氰 酸 胍 (GuSCN) 结 合 氯 仿 - 酚 提 取 法 材 料 的 裂 解 异 硫 氰 酸 胍, 亚 硫 氢 胍, 蛋 白 酶 K 等, 使 细 胞 及 核 蛋 白 复 合 物 变 性, 释 放 RNA, 同 时 可 以 有 效 抑 制 RNase 活 性 杂 质 的 去 除 苯 酚, 氯 仿, 异 丙 醇 抽 提 去 除 杂 质, 使 DNA 及 蛋 白 到 中 间 层 和 有 机 相,RNA 则 存 在 于 水 相 中 RNA 的 吸 附 和 硅 质 材 料 吸 附 或 用 异 丙 醇 浓 缩 RNA 经 DEPC 处 理 的 水 溶 解 RNA 6
核 酸 提 取 质 量 的 评 价 核 酸 的 完 整 性 凝 胶 电 泳 核 酸 的 纯 度 15kb 纯 化 的 DNA 的 完 整 性 利 用 凝 胶 电 泳 的 方 法 观 察 核 酸 电 泳 条 带 分 光 光 度 计 核 酸 的 浓 度 1000bp 分 光 光 度 计 real-time PCR 250bp RNA38 纯 化 的 RNA 的 完 整 性 核 酸 提 取 纯 度 和 浓 度 的 评 价 利 用 凝 胶 电 泳 的 方 法 观 察 核 酸 电 泳 条 带 正 常 时,28S RNA 的 荧 光 强 度 约 为 18S RNA 的 2 倍, 否 则 提 示 RNA 的 降 解 分 光 光 度 计 法 方 便 快 捷 成 本 较 低 微 量 分 光 光 度 计 实 时 定 量 PCR 成 本 较 高 基 因 测 序 39 40 分 光 光 度 计 法 原 理 DNA 纯 度 和 浓 度 判 断 纯 DNA OD260/OD280=1.8 一 般 1.7-1.9 之 间 RNA 污 染 OD260 OD280 > 1.9 加 入 RNA 酶 纯 RNA OD260/OD280=2.0 一 般 1.8-2.2 之 间 蛋 白 质 或 酚 污 染 OD260 OD280 < 1.6 用 酚 氯 仿 抽 提 1OD=50µg/mL DNA 42 7
RNA 纯 度 的 判 断 RNA 降 解 OD260 OD280 > 2.2 重 新 提 取 谢 谢! 蛋 白 质 或 酚 污 染 OD260 OD280 < 1.8 用 氯 仿 异 丙 醇 抽 提 1OD=40µg/mL RNA 43 8