Microsoft Word - å‘‚å–›æ³Łæfl¯å”�ä½fiæ£•æµ‰è¯Łå›‡çł™ 说柔书 160618

发 光 法 支 原 体 检 测 试 剂 盒 说 明 书 ( 版 本 PF18) 货 号 LM009 储 存 条 件 产 品 为 冻 干 品, 随 干 冰 或 冰 袋 运 输, 收 到 产 品 后, 溶 解 之 前, 请 放 -80 冰 箱 低 温 保 存 该 条 件 下, 至 少 可 以 保 存 1 年 当 冻 干 品 溶 解 后, 在 冰 上 操 作, 按 每 管 50 μl 分 装 到 1.5 ml 离 心 管 中, 在 -80 冰 箱 低 温 保 存 该 条 件 下, 可 以 保 存 1 年 左 右 产 品 用 途 发 光 法 支 原 体 检 测 试 剂 盒 专 门 用 于 检 测 体 外 培 养 的 哺 乳 动 物 细 胞 是 否 被 支 原 体 污 染 产 品 简 介 哺 乳 动 物 细 胞 的 培 养, 支 原 体 (Mycoplasma) 污 染 是 个 世 界 性 的 问 题 支 原 体 污 染 几 乎 可 以 改 变 细 胞 的 所 有 参 数, 导 致 实 验 结 果 的 不 准 确 甚 至 完 全 错 误 ( 支 原 体 污 染 对 细 胞 的 详 细 危 害, 请 参 考 本 公 司 的 网 站 : www.yisemed.com) 从 2013 年 开 始, Nature 期 刊 已 正 式 要 求 投 稿 的 文 章, 如 涉 及 细 胞 培 养 都 要 进 行 支 原 体 检 测 相 信 会 有 越 来 越 多 的 高 水 平 期 刊 将 做 出 同 样 的 支 原 体 检 测 要 求 培 养 法 是 相 对 可 靠 的 支 原 体 检 测 技 术, 但 是 该 方 法 非 常 耗 时 的, 需 要 数 周, 不 适 合 作 为 细 胞 培 养 液 中 支 原 体 污 染 的 快 速 检 测 此 外, 通 过 固 体 培 养 法 无 法 检 测 污 染 细 胞 的 一 种 最 常 见 的 支 原 体, 即 猪 鼻 支 原 体 (M.Hyorhinis) 这 是 因 为 猪 鼻 支 原 体 无 法 在 支 原 体 固 体 培 养 基 上 形 成 可 见 的 菌 落 而 猪 鼻 支 原 体 约 占 所 有 支 原 体 污 染 的 20-50% 有 的 实 验 室 使 用 荧 光 染 色 法 检 测 支 原 体, 但 是 该 方 法 灵 敏 度 太 低, 当 检 测 成 阳 性 时, 细 胞 经 常 已 经 严 重 污 染 目 前, 细 胞 培 养 液 中 支 原 体 污 染 的 检 测 通 常 使 用 的 是 PCR 法 但 是 PCR 法 也 有 明 显 的 缺 点 :(1) 整 个 过 程 大 约 需 要 3 个 小 时 ;(2) 由 于 细 胞 培 养 数 天 后, 培 养 液 中 经 常 含 有 严 重 抑 制 PCR 扩 增 的 代 谢 物, 所 以 样 品 的 前 处 理 一 般 是 PCR 法 不 可 或 缺 的 环 节 ;(3)PCR 产 物 的 电 泳, 需 要 用 到 EB 等 潜 在 的 致 癌 物 质 本 公 司 已 经 开 发 出 了 专 用 于 体 外 细 胞 培 养 的 一 步 法 恒 温 支 原 体 检 测 试 剂 盒, 与 PCR 法 支 原 体 检 测 相 比, 其 具 有 许 多 优 点 : 耗 时 短 灵 敏 度 高 操 作 简 单 不 会 被 细 胞 代 谢 产 物 抑 制 结 果 无 需 电 泳 肉 眼 可 直 接 判 断 等 尽 管 如 此, 一 步 法 恒 温 支 原 体 检 测 试 剂 盒 可 能 也 有 个 小 缺 点 : 因 为 一 步 法 恒 温 支 原 体 检 测 试 剂 盒 需 要 至 少 同 时 使 用 4 条 引 物 才 能 完 成 扩 增, 其 引 物 设 计 相 对 困 难 虽 然 经 我 们 测 试, 该 试 剂 盒 至 少 可 认 识 其 说 明 书 中 列 举 的 13 种 支 原 体, 而 这 13 种 支 原 体 大 约 占 污 染 细 胞 的 支 原 体 种 类 的 99% 左 右 但 是, 不 排 除 一 步 法 恒 温 支 原 体 检 测 试 剂 盒 无 法 识 别 个 别 在 体 外 细 胞 培 养 中 出 现 概 率 极 低 的 支 原 体 为 此, 我 们 特 意 开 发 了 具 有 广 谱 识 别 能 力 的 PCR 法 支 原 体 检 测 试 剂 盒 作 为 补 充 此 外, 作 为 支 原 体 检 测 领 域 的 共 识 : 单 独 使 用 目 前 市 面 上 的 任 何 一 种 支 原 体 检 测 试 剂 盒, 都 无 法 做 到 100% 正 确, 既 不 会 漏 检 ( 假 阴 性 ), 也 不 会 多 检 ( 假 阳 性 ) 严 格 的 支 原 体 检 测, 至 少 需 要 使 用 两 种, 最 好 使 用 三 种 不 同 原 理 的 支 原 体 检 测 方 法 同 时 进 行 检 测, 才 能 使 检 测 结 果 接 近 100% 正 确 为 了 进 一 步 满 足 支 原 体 快 速 检 测 市 场 的 需 求, 我 们 特 意 开 发 了 第 三 种 支 原 体 检 测 试 剂 盒, 即 发 光 法 支 原 体 检 测 试 剂 盒 如 果 您 想 得 到 100% 正 确 的 支 原 体 检 测 结 果 ( 比 如, 开 展 细 胞 治 疗 的 客 户, 进 行 干 细 胞 培 养 的 客 户, 生 产 血 清 胰 酶 培 养 液 的 客 户, 出 售 各 种 原 代 培 养 细 胞 系 和 肿 瘤 细 胞 系 的 客 户 等 ), 任 选 本 公 司 生 产 的 一 步 法 恒 温 支 原 体 检 测 试 剂 盒 PCR 法 支 原 体 检 测 试 剂 盒 和 发 光 法 支 原 体 检 测 试 剂 盒 中 的 两 种 进 行 检 测, 将 会 得 到 比 较 满 意 的 结 果, 检 测 的 正 确 率 应 该 在 99.9% 以 上 如 果 同 时 使 用 这 三 种 试 剂 盒 进 行 检 测, 检 测 的 正 确 率 应 该 在 99.99% 以 上 如 果 将 所 有 待 测 样 品 统 一 接 种 到 支 原 体 液 体 培 养 基, 然 后 在 37 培 养 箱 中 培 养 3 天 后, 再 用 本 公 司 三 种 支 原 体 检 测 试 剂 盒 同 时 进 行 检 测, 则 可 以 确 保 您 的 检 测 结 果 100% 正 确! 通 过 将 待 测 样 品 接 种 到 支 原 体 液 体 培 养 基 培 养 3 天 的 目 的 是 : 防 止 一 些 支 原 体 含 量 极 其 微 量 的 待 测 样 品 ( 比 如 : 细 胞 培 养 用 的 血 清 胰 酶 抗 生 素 培 养 液 和 极 个 别 的 细 胞 培 养 上 清 ), 如 果 不 经 过 大 量 繁 殖, 有 可 能 漏 检

产 品 原 理 发 光 法 支 原 体 检 测 试 剂 盒 通 过 检 测 支 原 体 含 有 的 特 异 性 ATP 合 成 相 关 酶 的 活 性 以 达 到 检 测 体 外 培 养 的 哺 乳 动 物 细 胞 是 否 被 支 原 体 污 染 的 目 的 在 支 原 体 裂 解 后, 该 支 原 体 特 异 性 的 酶, 在 底 物 存 在 下, 具 有 将 ADP 转 化 成 ATP 的 功 能 由 于 荧 光 素 酶 (Luciferase) 催 化 底 物 荧 光 素 (Luciferin) 产 生 光 的 反 应 需 要 ATP 的 参 与, 支 原 体 特 异 性 酶 催 化 产 生 的 ATP 含 量, 可 以 通 过 该 反 应 转 化 成 生 物 发 光 (Bioluminescence) 信 号, 该 信 号 可 以 使 用 专 门 的 发 光 检 测 仪 (Luminometer) 或 具 有 发 光 检 测 功 能 的 多 功 能 酶 标 仪 进 行 检 测, 发 光 的 强 度 与 ATP 的 含 量 成 正 比 具 体 的 反 应 如 下 : 通 过 比 较 细 胞 培 养 上 清 和 未 用 于 细 胞 培 养 而 成 分 完 全 相 同 的 培 养 液 二 者 的 支 原 体 特 异 性 酶 的 含 量, 即 可 知 道 培 养 的 细 胞 是 否 被 支 原 体 污 染 产 品 优 点 发 光 法 支 原 体 检 测 试 剂 盒 具 有 如 下 显 著 的 优 点 : 1 检 测 时 间 短 整 个 检 测 过 程 只 需 30 分 钟 左 右 2 发 光 法 支 原 体 检 测 试 剂 盒 检 测 的 是 活 支 原 体, 只 有 样 品 中 存 在 活 的 支 原 体, 才 会 生 产 阳 性 结 果, 可 以 区 分 支 原 体 的 死 活 而 一 步 法 恒 温 支 原 体 检 测 试 剂 盒 和 PCR 法 支 原 体 检 测 试 剂 盒 都 是 检 测 支 原 体 的 DNA, 不 论 支 原 体 的 死 活, 样 品 中 只 要 有 支 原 体 DNA 的 存 在, 就 会 生 产 阳 性 结 果, 所 以 无 法 区 分 支 原 体 的 死 活 细 胞 培 养 中, 最 关 心 的 是 细 胞 培 养 液 上 清 或 者 血 清 胰 酶 等 成 分 中, 是 否 有 活 的 支 原 体 而 如 果 仅 有 死 的 支 原 体 或 者 一 些 残 存 的 支 原 体 DNA, 是 无 关 紧 要 的 3 不 存 在 假 阳 性 由 于 一 步 法 恒 温 支 原 体 检 测 试 剂 盒 和 PCR 法 支 原 体 检 测 试 剂 盒 都 需 要 对 支 原 体 DNA 进 行 大 量 的 扩 增, 检 测 过 程 中, 只 要 有 微 量 的 支 原 体 DNA 或 者 扩 增 产 物 的 污 染, 就 会 出 现 假 阳 性 而 发 光 法 支 原 体 检 测 试 剂 盒 只 检 测 活 的 支 原 体, 不 存 在 扩 增 产 物 污 染 样 品 的 问 题 4 不 存 在 因 反 应 被 抑 制 导 致 的 假 阴 性 由 于 细 胞 培 养 数 天 后, 培 养 液 中 经 常 含 有 严 重 抑 制 PCR 扩 增 的 代 谢 物, 所 以 使 用 PCR 法 支 原 体 检 测 试 剂 盒 经 常 会 出 现 假 阴 性 的 问 题 该 问 题 在 发 光 法 支 原 体 检 测 试 剂 盒 不 存 在 5 发 光 法 支 原 体 检 测 试 剂 盒 对 支 原 体 的 识 别 率 极 高, 近 20 种 细 胞 培 养 中 出 现 过 的 支 原 体 全 部 含 有 该 酶, 所 以 这 些 支 原 体 全 部 可 以 被 发 光 法 支 原 体 检 测 试 剂 盒 识 别 目 前 为 止,100 多 种 已 知 的 支 原 体 中, 只 发 现 这 一 种 支 原 体 不 含 有 该 酶, 而 这 种 支 原 体 在 细 胞 培 养 中 出 现 的 概 率 几 乎 为 零, 所 以 该 方 法 支 原 体 的 识 别 率 应 该 在 99.99% 以 上 试 剂 盒 组 成 1 支 原 体 检 测 溶 液 :5.5 ml 2 试 剂 A( 已 冻 干 ):2.5 ml(50 次 检 测 ) 3 试 剂 B( 已 冻 干 ): 2.5 ml(50 次 检 测 ) 检 测 过 程 1 检 测 试 剂 的 准 备 收 到 的 产 品 为 冻 干 品, 溶 解 前, 请 放 -80 冰 箱 低 温 保 存 第 一 次 使 用 前, 在 冰 上 操 作, 分 别 用 2.5 ml 支 原 体 检 测 溶 液 溶 解 试 剂 A 和 试 剂 B, 按 每 管 50 μl 分 别 分 装 到 50 个 1.5 ml 离 心 管 中, 在 -80 冰 箱 低 温 保 存 使 用 时, 根 据 待 检 测 的 样 品 数 量 和 阴 性 对 照 数 量, 从 -80 冰 箱 取 出 相 应 数 量 的 试 剂 A 和 试 剂 B, 放 室 温 5 分 钟 左 右 ( 注 意 : 不 能 加 热 ), 等 其 熔 解 后 放 冰 上 待 用

注 意 : 试 剂 A 和 试 剂 B 只 能 在 每 次 检 测 之 前 从 -80 冰 箱 取 出 的, 熔 解 后 在 室 温 放 置 的 时 间 尽 可 能 的 短, 不 能 超 过 20 分 钟 熔 解 后, 放 冰 上 的 时 间 也 不 能 超 2 小 时 已 经 融 化 后 的 试 剂 A 和 试 剂 B 不 能 再 次 冻 存 使 用 2 阴 性 对 照 的 设 置 本 试 剂 盒 每 次 检 测 都 必 须 设 置 阴 性 对 照 阴 性 对 照 必 须 使 用 配 制 完 后 放 于 4 冰 箱, 未 用 于 细 胞 培 养 但 成 分 完 全 相 同 的 培 养 液, 包 括 其 中 的 血 清 抗 生 素 等 含 量 也 必 须 完 全 相 同 特 别 是 其 中 的 血 清 含 量 和 批 次, 对 发 光 的 本 底 值 影 响 很 大, 作 为 阴 性 对 照 的 培 养 液, 其 中 添 加 的 血 清, 必 须 与 用 于 细 胞 培 养 的 血 清 批 次 相 同 且 含 量 完 全 相 同 例 如 : 如 果 用 于 细 胞 培 养 的 培 养 液 为 含 有 10% 的 胎 牛 血 清 的 高 糖 DMEM, 那 么 阴 性 对 照 也 应 该 使 用 含 有 相 同 批 次 的 10% 的 胎 牛 血 清 的 高 糖 DMEM 如 果 用 于 细 胞 培 养 的 培 养 液 为 无 血 清 培 养 液, 那 么 阴 性 对 照 也 应 该 使 用 无 血 清 但 成 分 相 同 的 培 养 液 3 待 测 样 品 的 准 备 为 了 准 确 判 断 细 胞 是 否 有 支 原 体 的 污 染, 待 测 的 细 胞 培 养 液 样 品 最 好 来 源 于 至 少 培 养 3 天 且 汇 合 度 在 70-90% 左 右 的 细 胞 培 养 液 上 清 ( 贴 壁 细 胞 ) 悬 浮 培 养 的 细 胞 也 需 要 在 换 液 传 代 后, 至 少 让 细 胞 生 长 3 天 再 取 培 养 液 进 行 检 测 具 体 操 作 如 下 ( 请 严 格 按 照 相 应 的 体 积 进 行 操 作 ): (1) 取 180 μl 上 述 待 测 样 品, 在 普 通 台 式 离 心 机 上 200 g( 大 约 1500 rpm) 低 速 离 心 5 分 钟, 准 确 吸 取 离 心 后 的 上 清 120 μl 到 一 个 新 的 1.5 ml 离 心 管 内, 丢 弃 含 细 胞 沉 淀 的 原 有 离 心 管 注 意 : 本 步 骤 为 样 品 检 测 之 前 必 不 可 少 的 步 骤, 低 速 离 心 是 为 了 去 除 哺 乳 动 物 细 胞, 以 排 除 其 对 支 原 体 检 测 的 干 扰 所 以 离 心 力 要 严 格 控 制 在 200 g 左 右, 该 离 心 力 下, 哺 乳 动 物 细 胞 将 被 沉 淀 下 来 而 支 原 体 不 会 如 果 错 误 使 用 更 高 的 离 心 力 将 可 能 导 致 支 原 体 也 被 离 心 下 来, 可 能 导 致 假 阴 性 而 如 果 错 误 使 用 更 低 的 离 心 力 将 可 能 导 致 哺 乳 动 物 细 胞 不 能 被 离 心 沉 淀 下 来, 从 而 导 致 支 原 体 检 测 时, 哺 乳 动 物 细 胞 内 的 ATP 也 被 释 放 到 溶 液 中, 可 能 导 致 假 阳 性 (2) 将 含 有 120 μl 上 清 的 新 的 1.5 ml 离 心 管, 在 普 通 台 式 离 心 机 上 16000 g ( 大 约 13000 rpm) 高 速 离 心 3 分 钟, 小 心 吸 走 108 μl 离 心 后 的 上 清 并 丢 弃 ( 注 意 : 切 勿 让 吸 头 碰 到 离 心 管 底 部, 因 为 底 部 为 可 能 含 有 支 原 体 的 沉 淀 留 下 大 约 12 μl 培 养 液 的 目 的 也 是 为 了 防 止 吸 头 碰 到 离 心 管 底 部 而 将 可 能 含 有 支 原 体 的 沉 淀 吸 走 ) 往 离 心 管 内, 加 入 108 μl 作 为 阴 性 对 照 的 培 养 液, 并 上 下 吹 吸 10 次, 将 可 能 含 有 支 原 体 的 沉 淀 吹 打 均 匀 至 此, 该 样 品 方 可 用 于 后 续 的 支 原 体 检 测 注 意 : 本 步 骤 也 是 样 品 检 测 之 前 必 不 可 少 的 步 骤, 高 速 离 心 是 为 了 将 支 原 体 沉 淀 下 来, 而 将 培 养 液 替 换 成 阴 性 对 照 的 培 养 液 是 为 了 排 除 一 些 细 胞 代 谢 产 物 对 后 续 检 测 的 可 能 干 扰 4 待 测 样 品 的 保 存 收 集 并 经 过 低 速 离 心 去 除 细 胞 和 经 过 高 速 离 心 替 换 成 阴 性 对 照 培 养 液 的 待 测 样 品, 如 果 不 是 当 天 立 即 检 测, 请 放 于 -80 冰 箱 保 存, 不 得 放 于 室 温 4 或 -20 冰 箱 样 品 在 -80 可 以 保 存 一 年 左 右 注 意 :(1) 为 了 日 后 检 测 方 便, 应 该 同 时 冻 存 一 些 作 为 阴 性 对 照 的 培 养 液 (2) 未 经 过 低 速 离 心 去 除 细 胞 和 未 经 过 高 速 离 心 替 换 成 阴 性 对 照 培 养 液 的 待 测 样 品, 不 得 直 接 放 -80 冰 箱 保 存 5 检 测 之 前, 必 须 将 熔 解 后 的 试 剂 A 试 剂 B 阴 性 对 照 和 待 测 样 品 放 在 室 温 10 分 钟 左 右 ( 注 意 : 不 能 加 热 ), 以 便 其 温 度 与 室 温 相 同, 本 试 剂 盒 的 最 佳 反 应 温 度 为 18-30, 必 须 确 保 室 温 不 低 于 15 6 吸 取 50 μl 阴 性 对 照 或 者 已 经 经 过 低 速 离 心 去 除 细 胞 和 经 过 高 速 离 心 替 换 成 阴 性 对 照 的 培 养 液 的 待 测 样 品, 放 入 白 色 或 者 黑 色 不 透 明 的 96 孔 板 内, 加 入 50 μl 试 剂 A, 室 温 反 应 15 分 钟 7 加 入 50 μl 试 剂 B, 室 温 反 应 3 分 钟 后, 在 具 有 发 光 检 测 功 能 的 多 功 能 酶 标 仪 或 者 单 独 的 发 光 检 测 仪 (Luminometer) 上, 以 仪 器 默 认 的 参 数 ( 注 意 : 不 要 加 载 任 何 的 滤 光 片 ) 进 行 发 光 值 的 检 测,5 分 钟 内, 连 续 测 5 次 阴 性 对 照 和 待 测 样 品 的 发 光 值, 计 算 各 自 的 平 均 值

结 果 判 断 计 算 待 测 样 品 的 发 光 平 均 值 与 阴 性 对 照 的 发 光 平 均 值 的 比 值 : 1 如 果 比 值 >1.2, 说 明 待 测 样 品 有 支 原 体 污 染 ( 阳 性 ) 严 重 的 污 染, 该 比 值 可 以 达 到 10 以 上 2 如 果 比 值 在 1.1-1.2 之 间, 说 明 待 测 样 品 可 疑 有 支 原 体 污 染 ( 可 疑 阳 性 ) 但 该 样 品 需 要 继 续 培 养 24-48 小 时 后, 重 新 检 测 如 果 继 续 培 养 24-48 小 时 后, 重 新 检 测 的 比 值 仍 然 在 1.1-1.2 之 间, 应 该 判 为 阴 性 3 如 果 比 值 <1.1, 说 明 待 测 样 品 无 支 原 体 污 染 ( 阴 性 ) 注 意 事 项 1 本 试 剂 盒 灵 敏 度 与 30 cycles 的 PCR 基 本 相 当 2 问 : 如 果 配 制 完 后 放 于 4 冰 箱 未 用 于 细 胞 培 养 且 成 分 完 全 相 同 的 培 养 液 本 身 有 支 原 体 污 染 ( 比 如 加 入 的 血 清 本 身 含 支 原 体 ), 是 否 仍 然 可 以 用 作 阴 性 对 照? 答 : 可 以 因 为 : 即 使 作 为 阴 性 对 照 的 培 养 液 本 身 有 支 原 体 污 染, 其 中 的 含 量 也 是 极 其 微 量 的 而 待 测 样 品 是 经 过 培 养 3 天 以 上 的, 其 支 原 体 在 这 3 天 培 养 过 程 中, 会 大 量 繁 殖, 用 发 光 法 支 原 体 检 测 试 剂 盒 检 测 的 发 光 值, 肯 定 比 阴 性 对 照 的 发 光 值 高 得 多 3 本 试 剂 盒 与 Lonza 公 司 的 MycoAlert Plus Mycoplasma Detection Kit 的 原 理 一 样, 可 以 替 代 后 者 用 于 细 胞 培 养 上 清 的 支 原 体 检 测 4 如 发 现 细 胞 被 支 原 体 污 染, 本 公 司 提 供 细 胞 专 用 支 原 体 清 除 和 预 防 试 剂 附 注 如 何 检 测 血 清 是 否 含 有 支 原 体 污 染? 血 清 有 没 有 支 原 体 污 染 这 是 细 胞 培 养 用 户 非 常 关 心 的 问 题 其 检 测 方 法 有 相 当 的 特 殊 性, 现 介 绍 如 下 : 1. 必 须 认 识 到 血 清 不 适 合 直 接 检 测, 在 对 其 进 行 检 测 之 前, 必 须 将 其 中 可 能 含 有 的 支 原 体 进 行 大 量 的 繁 殖 这 是 因 为 :(1) 商 品 化 的 血 清 都 是 经 过 0.1 μm 的 滤 膜 多 次 过 滤 的 而 且 长 期 低 温 保 存 和 运 输, 其 中 即 使 含 有 支 原 体, 其 含 量 也 必 然 是 极 其 微 量 的 ( 比 如 1 ml 就 含 有 几 个 支 原 体 ), 直 接 检 测 一 般 是 检 测 不 出 来 的 ;(2) 如 果 不 对 其 进 行 大 量 繁 殖 而 直 接 用 一 步 法 恒 温 支 原 体 检 测 试 剂 盒 进 行 检 测, 由 于 该 试 剂 盒 灵 敏 度 非 常 高, 很 多 血 清 的 检 测 结 果 会 介 于 阳 性 和 阴 性 之 间 但 是 这 也 只 能 说 明 其 含 有 微 量 的 支 原 体 DNA, 不 能 说 明 其 含 有 活 的 支 原 体 当 然, 如 果 检 测 结 果 与 阳 性 对 照 完 全 一 样, 呈 典 型 的 蓝 绿 色, 说 明 其 支 原 体 DNA 的 含 量 确 实 较 高, 也 间 接 说 明 其 血 清 质 量 较 差, 在 其 生 产 过 程 中, 没 有 控 制 好 支 原 体 的 污 染 如 果 检 测 结 果 与 阴 性 对 照 完 全 一 样, 呈 典 型 的 紫 红 色, 也 间 接 说 明 其 血 清 质 量 较 高 但 是 以 上 几 种 结 果 都 不 能 直 接 说 明 该 血 清 一 定 含 有 活 的 支 原 体 或 者 一 定 不 含 有 活 的 支 原 体 (3) 血 清 往 往 含 有 抑 制 PCR 扩 增 的 成 分, 直 接 用 PCR 法 进 行 检 测 也 是 无 法 准 确 判 断 的 2. 血 清 样 品 中 支 原 体 的 繁 殖 方 法 : 将 1 ml 的 血 清 按 1:10 稀 释 到 支 原 体 液 体 培 养 基 中 注 意 :(1) 血 清 接 种 的 量 不 能 太 小, 一 般 接 种 不 少 于 1 ml, 否 则 可 能 漏 检 ;(2) 不 能 使 用 常 规 的 哺 乳 动 物 细 胞 培 养 液 代 替 支 原 体 液 体 培 养 基 因 为 经 我 们 测 试 : 在 没 有 动 物 细 胞 共 培 养 的 情 况 下, 支 原 体 在 含 10% 血 清 的 动 物 细 胞 培 养 液 如 DMEM 1640 MEM GMEM 中 繁 殖 非 常 缓 慢, 甚 至 完 全 不 繁 殖, 然 后 部 分 放 4 冰 箱, 部 分 放 37 二 氧 化 碳 培 养 箱 或 者 普 通 的 细 菌 培 养 箱 中 培 养 3 天 经 我 们 测 试 3 天 的 培 养 已 经 足 够 而 且 是 最 佳 选 择 3 天 后, 进 行 支 原 体 的 检 测 3. 培 养 3 天 后 的 样 品 中 支 原 体 的 检 测 方 法, 可 以 在 本 公 司 发 光 法 支 原 体 检 测 试 剂 盒 一 步 法 恒 温 支 原 体 检 测 试 剂 盒 和 PCR 法 支 原 体 检 测 试 剂 盒 中 任 选 1-3 种 进 行 检 测 由 于, 血 清 是 否 含 有 支 原 体, 事 关 重 大, 我 们 建 议 至 少 使 用 两 种 方 法 进 行 检 测 4. 如 果 条 件 许 可, 我 们 建 议 其 中 一 种 方 法 尽 量 选 择 发 光 法 支 原 体 检 测 试 剂 盒, 因 为 该 方 法 可 以 区 分 支 原 体 的 死 活, 而 且 可 以 进 行 定 量 的 分 析, 可 以 知 道 : 培 养 3 天 后, 支 原 体 繁 殖 了 多 少 倍 使 用 该 方 法, 具 体 操 作

如 下 : 以 放 4 冰 箱 的 含 10% 待 测 血 清 的 支 原 体 液 体 培 养 基 作 为 阴 性 对 照, 用 发 光 法 支 原 体 检 测 试 剂 盒 检 测 培 养 箱 中 培 养 3 天 的 培 养 液, 其 发 光 值 是 否 明 显 增 高, 从 而 判 断 最 初 加 入 的 血 清 是 否 含 支 原 体 5. 当 然, 培 养 3 天 后 的 样 品, 也 可 以 用 一 步 法 恒 温 支 原 体 检 测 试 剂 盒 和 PCR 法 支 原 体 检 测 试 剂 盒 进 行 检 测 用 这 两 种 方 法 进 行 检 测 时, 建 议 同 时 检 测 原 液 1:10 和 1:100 的 稀 释 液, 稀 释 液 用 PBS 这 是 因 为 :(1) 原 液 仍 然 含 有 10% 的 血 清, 其 仍 然 有 可 能 抑 制 PCR 的 扩 增 ;(2) 一 个 样 品 同 时 检 测 三 个 稀 释 度, 对 于 结 果 判 断 的 准 确 性 非 常 有 帮 助 结 果 判 断 如 下 :(1) 如 果 三 个 稀 释 度 的 检 测 结 果 都 为 阴 性, 说 明 血 清 没 有 支 原 体 污 染 ;(2) 三 个 稀 释 度 的 检 测 结 果 只 要 一 个 为 阳 性, 说 明 血 清 有 支 原 体 污 染, 而 且 极 有 可 能 是 污 染 了 活 支 原 体 最 常 见 的 结 果 是 三 个 稀 释 度 都 为 阳 性 或 三 个 稀 释 度 都 为 阴 性 6. 本 公 司 同 时 提 供 经 测 试 对 各 种 支 原 体 均 有 良 好 繁 殖 能 力 的 支 原 体 液 体 培 养 基 ( 干 粉 型 ) 产 品 大 家 购 买 后, 自 己 按 说 明 书 配 成 支 原 体 液 体 培 养 基, 其 中 的 马 血 清 可 以 不 加, 而 用 待 测 的 胎 牛 血 清 代 替 ( 终 浓 度 10% 即 可 ) 其 中 的 青 霉 素 可 以 不 用 添 加 或 者 用 细 胞 培 养 用 的 青 霉 素 和 链 霉 素 (100, 按 1:100 加 入 ) 代 替 1 瓶 支 原 体 液 体 培 养 基 ( 干 粉 型 ) 大 约 可 以 检 测 1000 个 血 清 样 品 7. 如 果 大 家 觉 得 上 述 检 测 非 常 繁 琐, 本 公 司 同 时 供 应 经 上 述 步 骤 严 格 检 测, 证 明 100% 不 含 活 支 原 体 的 精 选 进 口 胎 牛 血 清 其 他 : 如 何 检 测 胰 酶 抗 生 素 未 使 用 的 动 物 细 胞 培 养 液 等 细 胞 培 养 相 关 试 剂 是 否 含 有 支 原 体 污 染? 这 些 样 品 也 不 适 合 直 接 检 测 方 法 与 血 清 的 检 测 方 法 非 常 类 似, 在 对 其 进 行 检 测 之 前, 也 必 须 将 其 中 可 能 含 有 的 支 原 体 进 行 大 量 的 繁 殖 首 选, 必 须 先 检 测 支 原 体 液 体 培 养 基 中 含 有 的 血 清 是 否 被 支 原 体 污 染, 在 保 证 血 清 没 有 支 原 体 污 染 的 前 提 下, 配 制 含 10% 经 证 明 没 有 支 原 体 污 染 的 血 清 的 支 原 体 液 体 培 养 基, 然 后 将 不 少 于 1 ml 的 胰 酶 抗 生 素 或 者 动 物 细 胞 培 养 液 等 按 1:10 稀 释 到 该 培 养 基 中, 然 后 部 分 放 4 冰 箱, 部 分 放 37 二 氧 化 碳 培 养 箱 或 者 普 通 的 细 菌 培 养 箱 中 培 养 3 天,3 天 后 的 进 行 支 原 体 的 检 测, 方 法 同 上