中 草 药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 44 卷 第 8 期 2013 年 4 月 989 养 阴 清 肺 糖 浆 指 纹 图 谱 研 究 1, 姜 姗 2, 冯 丽 君 2, 孔 慧 2, 曲 昌 海 2, 尹 兴 斌 2, 倪 健 1. 北 京 中 医 药 大 学 教 务 处, 北 京 100029 2. 北 京 中 医 药 大 学 中 药 学 院, 北 京 100102 2* 摘 要 : 目 的 建 立 养 阴 清 肺 糖 浆 指 纹 图 谱, 研 究 不 同 厂 家 和 同 一 厂 家 不 同 批 次 样 品 的 指 纹 图 谱 差 异, 为 完 善 该 制 剂 的 质 量 评 价 体 系 奠 定 基 础 方 法 采 用 高 效 液 相 色 谱 法 (HPLC) 进 行 测 定,Agilent TC-18 色 谱 柱 (250 mm 4.6 mm,5 μm), 乙 腈 -0.1% 磷 酸 水 溶 液 梯 度 洗 脱, 检 测 波 长 为 254 nm, 柱 温 为 30, 体 积 流 量 为 0.8 ml/min 结 果 建 立 了 养 阴 清 肺 糖 浆 HPLC 指 纹 图 谱, 标 定 共 有 峰 23 个 ; 不 同 厂 家 养 阴 清 肺 糖 浆 相 似 度 差 别 明 显, 质 量 差 异 较 大 ; 同 一 厂 家 不 同 批 次 间 相 似 度 较 大, 质 量 稳 定 通 过 聚 类 分 析, 将 11 个 厂 家 的 养 阴 清 肺 糖 浆 聚 为 4 类 结 论 不 同 厂 家 生 产 的 养 阴 清 肺 糖 浆 质 量 差 异 显 著, 有 必 要 对 其 建 立 完 善 的 质 量 评 价 体 系 关 键 词 : 养 阴 清 肺 糖 浆 ;HPLC; 指 纹 图 谱 ; 质 量 评 价 体 系 ; 聚 类 分 析 中 图 分 类 号 :R286.02 文 献 标 志 码 :A 文 章 编 号 :0253-2670(2013)08-0989 - 06 DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2013.08.014 Study on fingerprint of Yangyin Qingfei Syrup JIANG Shan 1, 2, FENG Li-jun 2, KONG Hui 2, QU Chang-hai 2, YIN Xing-bin 2, NI Jian 2 1. Academic Affairs Office, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China 2. School of Chinese Materia Medica, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100102, China Abstract: Objective To establish the HPLC fingerprint of Yangyin Qingfei Syrup (YQS), to discuss the differences among the samples from different manufactories and different batches from the same manufactory, and to lay a foundation for optimizing the quality evaluation system. Methods HPLC was used with Agilent TC-18 column (250 mm 4.6 mm, 5 μm), gradient eluted with acetonitrile-0.1% phosphoric acid. The detection wavelength was 254 nm, column temperature was 30, and flow rate was 0.8 ml/min. Results The HPLC fingerprint of YQS was established, and 23 common peaks were marked. Obvious differences of similarity and qualities from the different manufactories were observed, and the similarity and qualities from the same manufactory were found to be stable. The 11 samples from the different manufactories were classified into four clusters by cluster analysis. Conclusion The quality of YQS from the different manufactories is obviously different. It is necessary to establish a comprehensive quality evaluation system for YQS. Key words: Yangyin Qingfei Syrup; HPLC; fingerprint; quality evaluation system; cluster analysis 养 阴 清 肺 糖 浆 收 载 于 部 颁 标 准, 由 地 黄 玄 参 白 芍 牡 丹 皮 等 8 味 中 药 组 成, 具 有 养 阴 清 肺 清 热 利 咽 的 功 效 [1-2] 临 床 常 用 于 治 疗 咽 喉 干 燥 疼 痛 干 咳 少 痰 痰 中 带 血 等 病 症 养 阴 清 肺 糖 浆 作 为 中 药 复 方 制 剂, 全 国 共 有 24 个 生 产 厂 家, 其 提 取 工 艺 复 杂 工 艺 参 数 多 样, 影 响 该 药 的 质 量 因 素 众 多, 但 其 在 部 颁 标 准 收 载 的 质 量 评 价 内 容 仅 限 于 对 全 方 中 2 个 指 标 性 成 分 进 行 研 究, 即 薄 荷 脑 定 性 和 芍 药 苷 定 量 研 究, 难 以 对 其 质 量 进 行 全 面 控 制 本 研 究 以 市 售 11 个 厂 家 和 同 一 厂 家 不 同 批 次 生 产 的 养 阴 清 肺 糖 浆 为 研 究 对 象, 建 立 HPLC 指 纹 图 谱, 以 期 完 善 该 制 剂 的 质 量 评 价 体 系, 也 为 进 一 步 探 讨 引 起 其 质 量 差 异 的 原 因 奠 定 基 础, 以 保 证 该 药 的 质 量 和 临 床 疗 效 稳 定 收 稿 日 期 :2012-09-18 基 金 项 目 : 国 家 重 大 新 药 创 制 科 技 重 大 专 项 (2012ZX09103201-026); 国 家 中 医 药 管 理 局 中 医 药 行 业 科 研 专 项 项 目 : 中 成 药 生 产 过 程 再 现 的 关 键 技 术 示 范 研 究 (200807038); 北 京 中 医 药 大 学 复 方 中 药 制 药 创 新 团 队 (2011-CX70-13) 作 者 简 介 : 姜 姗 (1983 ), 女, 北 京 人, 实 验 师, 硕 士, 就 职 于 北 京 中 医 药 大 学, 研 究 方 向 为 中 药 新 剂 型 与 新 技 术 Tel: (010)64286447 18701677004 E-mail: jiangshan1503@sina.com * 通 信 作 者 倪 健, 教 授, 博 士 生 导 师 Tel: (010)84738607 E-mail: njtcm@263.net 网 络 出 版 时 间 :2013-03-07 网 络 出 版 地 址 :http://www.cnki.net/kcms/detail/12.1108.r.20130307.1736.001.html
990 中 草 药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 44 卷 第 8 期 2013 年 4 月 1 仪 器 与 试 药 Agilent 1260 高 效 液 相 色 谱 仪 ( 包 括 G1311C 1260 Quat 四 元 泵 G1314B 1260VWD VL 检 测 器 G1329B 1260ALS 进 样 器 Rev.B.04.03 [52] 液 相 色 谱 工 作 站, 美 国 安 捷 伦 公 司 );BT 125D 天 平 ( 赛 多 利 斯 );KH5200E 型 超 声 波 清 洗 器 ( 昆 山 禾 创 超 声 仪 器 有 限 公 司 );G16 型 医 用 高 速 离 心 机 ( 河 北 白 洋 离 心 机 厂 );SHZ D(III) 循 环 水 式 真 空 泵 ( 上 海 振 捷 实 验 设 备 有 限 公 司 ) 对 照 品 芍 药 苷 ( 批 号 110736-200629) 丹 皮 酚 ( 批 号 110708-200506) 哈 巴 俄 苷 ( 批 号 111730-201106) 肉 桂 酸 ( 批 号 110786-200503) 甘 草 酸 铵 ( 批 号 110731-20111) 均 购 自 中 国 食 品 药 品 检 定 研 究 院 ; 苯 甲 酸 钠 ( 分 析 纯, 北 京 北 化 福 瑞 化 工 有 限 公 司 ), 乙 腈 ( 色 谱 纯,Fisher Scientific), 其 他 液 体 试 剂 均 为 分 析 纯 ( 北 京 化 工 厂 ), 水 为 娃 哈 哈 纯 净 水 市 售 养 阴 清 肺 糖 浆 11 个 厂 家 样 品 分 别 为 北 京 同 仁 堂 有 限 公 司 同 仁 堂 制 药 厂 ( 批 号 9150006) 北 京 北 卫 药 业 有 限 公 司 ( 批 号 081063) 北 京 协 和 康 友 制 药 有 限 公 司 ( 批 号 20081102) 天 津 中 新 药 业 集 团 股 份 有 限 公 司 乐 仁 堂 制 药 厂 ( 低 醇 型, 批 号 D138262080 ) 天 津 泰 达 药 业 有 限 公 司 ( 批 号 0807231) 哈 药 集 团 中 药 二 厂 ( 批 号 090115) 哈 尔 滨 东 方 制 药 有 限 公 司 ( 批 号 090402) 内 蒙 古 京 新 药 业 有 限 公 司 ( 批 号 090203) 新 疆 制 药 厂 ( 批 号 091201) 黄 山 市 天 目 药 业 有 限 公 司 ( 批 号 090217 ) 株 洲 千 金 药 业 股 份 有 限 公 司 ( 批 号 20090319), 对 其 随 机 编 号, 依 次 记 为 S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 S11 同 一 厂 家 S1 不 同 批 次 样 品 批 号 分 别 为 D138266 B138455095 B138406120 B138437033 B138427035 B138419042 2 方 法 与 结 果 2.1 色 谱 条 件 色 谱 柱 为 Agilent TC-18 柱 (250 mm 4.6 mm, 5 μm); 流 动 相 为 乙 腈 -0.1% 磷 酸 水 溶 液, 梯 度 洗 脱 : 0~50 min,5%~36% 乙 腈 ;50~70 min,36%~50% 乙 腈 ;70~75 min,50%~100% 乙 腈 ; 柱 温 30 ; 检 测 波 长 254 nm; 体 积 流 量 0.8 ml/min; 进 样 量 10 μl 所 有 组 分 于 75 min 内 被 检 测 完 2.2 对 照 品 溶 液 的 制 备 精 密 称 取 芍 药 苷 丹 皮 酚 哈 巴 俄 苷 肉 桂 酸 甘 草 酸 单 铵 盐 对 照 品 各 2 mg, 置 量 瓶 中, 分 别 用 甲 醇 甲 醇 30% 甲 醇 30% 甲 醇 和 70% 乙 醇 定 容 至 10 ml [3] 制 成 质 量 浓 度 均 为 0.2 mg/ml 的 对 照 品 溶 液, 过 0.45 μm 微 孔 滤 膜, 取 续 滤 液 作 为 对 照 品 溶 液, 即 得 另 取 防 腐 剂 苯 甲 酸 钠 0.15 g, 用 水 稀 释 至 50 ml, 制 成 0.3% 苯 甲 酸 钠 溶 液, 即 得 2.3 供 试 品 溶 液 的 制 备 精 密 量 取 不 同 厂 家 及 同 一 厂 家 不 同 批 次 养 阴 清 肺 糖 浆 5 ml, 精 密 加 入 50% 乙 醇 25 ml, 超 声 提 取 10 min, 离 心 10 min(4 500 r/min),0.22 μm 微 孔 滤 膜 滤 过, 取 续 滤 液 作 为 供 试 品 溶 液, 即 得 2.4 参 照 峰 的 选 择 在 养 阴 清 肺 糖 浆 指 纹 图 谱 中, 选 择 峰 面 积 较 大 且 稳 定, 峰 分 离 度 较 好 的 22 号 峰 ( 丹 皮 酚 ) 作 为 参 照 峰 在 以 下 研 究 中, 均 以 各 供 试 品 色 谱 图 中 丹 皮 酚 色 谱 峰 保 留 时 间 和 峰 面 积 积 分 值 为 参 照, 计 算 主 要 色 谱 峰 的 相 对 保 留 时 间 和 相 对 峰 面 积 2.5 方 法 学 考 察 2.5.1 精 密 度 试 验 取 S2 样 品 1 份, 按 2.3 项 下 方 法 制 备, 连 续 进 样 6 次, 记 录 色 谱 图 计 算 各 共 有 峰 的 相 对 保 留 时 间 和 相 对 峰 面 积 结 果 显 示, 各 共 有 峰 的 相 对 保 留 时 间 的 RSD 在 0.03%~0.31%, 相 对 峰 面 积 的 RSD 在 0.64%~2.85%, 表 明 仪 器 精 密 度 良 好 2.5.2 重 复 性 试 验 取 S2 样 品, 分 别 按 2.3 项 下 方 法 制 备 供 试 品 溶 液 6 份, 记 录 色 谱 图 计 算 各 共 有 峰 的 相 对 保 留 时 间 和 相 对 峰 面 积 结 果 显 示, 各 共 有 峰 的 相 对 保 留 时 间 的 RSD 在 0.02%~0.66%, 相 对 峰 面 积 的 RSD 在 0.27%~2.98%, 表 明 方 法 重 复 性 良 好 2.5.3 稳 定 性 试 验 取 S2 样 品 1 份, 按 2.3 项 下 方 法 制 备, 分 别 在 0 2 8 10 12 24 h 按 2.1 项 下 色 谱 条 件 测 定, 记 录 色 谱 图 计 算 各 共 有 峰 的 相 对 保 留 时 间 和 相 对 峰 面 积 结 果 显 示, 各 共 有 峰 的 相 对 保 留 时 间 的 RSD 在 0.24%~1.46%, 相 对 峰 面 积 的 RSD 在 1.09%~2.92%, 表 明 供 试 品 溶 液 在 24 h 内 稳 定 2.6 不 同 厂 家 指 纹 图 谱 测 定 分 别 准 确 吸 取 5 种 对 照 品 溶 液 各 5 μl 混 合 均 匀 后 取 样 10 μl 苯 甲 酸 钠 溶 液 10 μl 11 个 厂 家 养 阴 清 肺 糖 浆 供 试 品 溶 液 各 10 μl 进 样, 按 照 上 述 色 谱 方 法 及 测 定 方 法 进 行 测 定, 记 录 指 纹 图 谱 见 图 1 2
中 草 药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 44 卷 第 8 期 2013 年 4 月 991 A 3 4 2 B 6 5 1 0 10 20 30 40 50 60 70 0 10 20 30 40 50 60 70 1- 芍 药 苷 2- 哈 巴 俄 苷 3- 肉 桂 酸 4- 丹 皮 酚 5- 甘 草 酸 6- 苯 甲 酸 钠 1-paeoniflorin 2-harpagoside 3-cinnamic acid 4-paeonol 5-glycyrrhizic acid 6-sodium benzoate 图 1 混 合 对 照 品 (A) 和 苯 甲 酸 钠 (B) 的 HPLC 色 谱 图 Fig. 1 HPLC chromatograms of mixed reference substances (A) and sodium benzoate (B) 1 A 15 2 6 3 4 7 5 8 9 10 11 13 12 14 16 17 18 19 20 21 22 23 S11 S10 S9 S8 S7 S6 S5 S4 S3 S2 S1 0 10.87 21.73 32.60 43.47 54.34 65.20 76.07 15 B 1 14 22 2 6 3 7 4 5 8 9 10 13 11 12 16 17 18 192021 23 0 10.87 21.73 32.60 43.47 54.34 65.20 76.07 9- 芍 药 苷 15- 苯 甲 酸 钠 20- 哈 巴 俄 苷 21- 肉 桂 酸 22- 丹 皮 酚 23- 甘 草 酸 9-paeoniflorin 15-sodium benzoate 20-harpagoside 21-cinnamic acid 22-paeonol 23-glycyrrhizic acid 图 2 11 个 厂 家 养 阴 清 肺 糖 浆 的 HPLC 指 纹 图 谱 (A) 及 其 对 照 指 纹 图 谱 (B) Fig. 2 HPLC fingerprints of YQS from 11 manufactories (A) and their reference fingerprint (B)
992 中 草 药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 44 卷 第 8 期 2013 年 4 月 经 与 对 照 品 鉴 定,26.685 46.701 47.854 55.127 63.311 min 出 峰 分 别 为 芍 药 苷 哈 巴 俄 苷 肉 桂 酸 丹 皮 酚 甘 草 酸 ;35.708 min 为 防 腐 剂 苯 甲 酸 钠 的 峰 以 丹 皮 酚 为 参 照 峰 的 HPLC 指 纹 图 谱 确 定 共 有 峰 23 个, 计 算 各 共 有 峰 的 相 对 保 留 时 间 和 相 对 峰 面 积 值, 结 果 见 表 1~2 表 1 不 同 厂 家 养 阴 清 肺 糖 浆 HPLC 指 纹 图 谱 共 有 峰 相 对 保 留 时 间 Table 1 Relative retention time of common peaks in HPLC fingerprint of YQS from different manufactories 样 品 相 对 保 留 时 间 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 (S) 23 S1 0.168 0.198 0.208 0.278 0.336 0.349 0.358 0.404 0.477 0.507 0.531 0.574 0.587 0.611 0.629 0.677 0.745 0.761 0.798 0.836 0.856 1.000 1.134 S2 0.165 0.196 0.205 0.275 0.333 0.346 0.354 0.400 0.475 0.505 0.529 0.572 0.586 0.609 0.627 0.677 0.745 0.761 0.798 0.837 0.856 1.000 1.135 S3 0.167 0.197 0.207 0.277 0.336 0.348 0.356 0.402 0.476 0.506 0.531 0.580 0.587 0.611 0.628 0.678 0.745 0.760 0.799 0.837 0.856 1.000 1.136 S4 0.167 0.197 0.207 0.277 0.336 0.348 0.356 0.402 0.476 0.506 0.531 0.580 0.587 0.611 0.628 0.678 0.745 0.760 0.799 0.837 0.856 1.000 1.136 S5 0.167 0.197 0.207 0.277 0.336 0.348 0.356 0.403 0.477 0.506 0.531 0.574 0.587 0.611 0.629 0.679 0.745 0.761 0.800 0.838 0.857 1.000 1.137 S6 0.168 0.198 0.208 0.279 0.339 0.350 0.358 0.404 0.479 0.512 0.535 0.577 0.591 0.615 0.632 0.683 0.751 0.761 0.799 0.842 0.855 1.000 1.145 S7 0.167 0.196 0.207 0.277 0.337 0.348 0.355 0.403 0.476 0.506 0.530 0.574 0.587 0.611 0.628 0.679 0.746 0.761 0.799 0.838 0.856 1.000 1.138 S8 0.167 0.197 0.207 0.277 0.337 0.347 0.355 0.403 0.476 0.506 0.530 0.574 0.587 0.611 0.628 0.679 0.746 0.762 0.799 0.838 0.856 1.000 1.138 S9 0.167 0.197 0.207 0.277 0.338 0.348 0.355 0.403 0.476 0.506 0.530 0.574 0.587 0.611 0.628 0.679 0.746 0.761 0.799 0.838 0.856 1.000 1.139 S10 0.166 0.197 0.207 0.277 0.337 0.347 0.355 0.402 0.477 0.506 0.530 0.573 0.587 0.611 0.618 0.679 0.747 0.761 0.799 0.839 0.856 1.000 1.139 S11 0.167 0.198 0.208 0.278 0.339 0.349 0.357 0.403 0.477 0.507 0.531 0.574 0.588 0.611 0.629 0.678 0.746 0.761 0.799 0.838 0.857 1.000 1.138 RSD / % 0.498 0.355 0.401 0.354 0.499 0.315 0.365 0.278 0.217 0.367 0.290 0.470 0.219 0.229 0.549 0.238 0.236 0.071 0.068 0.185 0.063 0.000 0.255 表 2 不 同 厂 家 养 阴 清 肺 糖 浆 HPLC 指 纹 图 谱 共 有 峰 相 对 峰 面 积 Table 2 Relative peak area of common peaks in HPLC fingerprint of YQS from different manufactories 样 品 相 对 峰 面 积 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 (S) 23 S1 1.080 0.708 0.194 0.101 0.059 0.190 0.175 0.071 0.118 0.137 0.054 0.089 0.245 0.160 1.706 0.070 0.026 0.039 0.027 0.029 0.150 1.000 0.207 S2 0.633 0.070 0.121 0.063 0.068 0.181 0.169 0.064 0.147 0.198 0.073 0.100 0.129 0.339 2.090 0.107 0.080 0.055 0.033 0.078 0.195 1.000 0.408 S3 0.512 0.237 0.068 0.055 0.086 0.103 0.143 0.055 0.161 0.225 0.065 0.026 0.074 0.593 2.117 0.062 0.023 0.032 0.047 0.069 0.167 1.000 0.039 S4 37.65 1.562 3.347 4.589 1.002 3.791 3.328 2.854 4.969 10.92 5.994 1.602 13.99 15.32 55.37 2.584 0.527 1.062 0.651 2.136 3.766 1.000 5.779 S5 0.748 0.182 0.211 0.137 0.031 0.162 0.167 0.130 0.214 0.367 0.076 0.114 0.174 0.205 2.852 0.089 0.040 0.043 0.031 0.077 0.228 1.000 0.258 S6 15.882 0.484 1.057 1.812 0.834 1.512 3.113 1.237 3.394 0.499 0.751 1.313 1.677 0.606 47.64 1.478 0.391 0.618 0.422 0.887 1.065 1.000 7.696 S7 0.619 0.026 0.036 0.046 0.117 0.159 0.130 0.130 0.179 0.291 0.114 0.117 0.137 0.442 2.714 0.099 0.038 0.056 0.039 0.110 0.157 1.000 0.206 S8 0.304 0.059 0.020 0.048 0.045 0.209 0.080 0.181 0.110 0.184 0.073 0.053 0.322 0.221 1.797 0.066 0.022 0.100 0.032 0.062 0.196 1.000 0.115 S9 0.362 0.016 0.036 0.036 0.023 0.084 0.084 0.053 0.062 0.103 0.097 0.053 0.061 0.226 1.415 0.032 0.029 0.034 0.017 0.044 0.106 1.000 0.218 S10 4.591 0.592 0.625 0.640 0.402 1.427 0.975 0.452 1.084 2.193 0.382 0.482 0.991 0.600 162.8 0.147 0.194 0.368 0.191 0.107 1.179 1.000 0.103 S11 3.648 0.920 0.372 0.271 0.166 0.477 0.559 0.213 0.781 0.772 0.484 0.104 0.578 1.714 10.47 0.216 0.100 0.112 0.105 0.158 0.384 1.000 0.914 RSD / % 190.7 109.3 176.9 196.1 134.0 150.3 150.6 173.0 160.2 221.4 236.7 151.0 246.3 241.6 186.3 182.5 128.3 145.0 142.4 188.4 157.6 0.000 183.5 2.7 同 一 厂 家 不 同 批 次 样 品 指 纹 图 谱 测 定 取 S1 厂 家 的 6 批 次 样 品, 各 10 μl, 按 照 前 述 色 谱 方 法 及 测 定 方 法 进 行 测 定, 记 录 指 纹 图 谱 结 果 见 图 3 2.8 指 纹 图 谱 相 似 度 测 定 将 养 阴 清 肺 糖 浆 指 纹 图 谱 数 据 导 入 指 纹 图 谱 相 似 性 评 价 软 件 ( 中 药 色 谱 指 纹 图 谱 相 似 度 评 价 系 统, 2004A), 以 S1 图 谱 为 参 照 谱, 进 行 多 点 校 正, 匹 配 色 谱 峰, 以 中 位 数 法 生 成 对 照 图 谱 ( 图 2) 不 同 厂 家 养 阴 清 肺 糖 浆 的 指 纹 图 谱 相 似 度 测 定 结 果 S1~S11 为 0.910 0.986 0.695 0.903 0.979 0.940 0.992 0.931 0.963 0.037 0.972 可 知,S2 S5 S7 S9 S11 相 似 度 良 好, 大 于 0.95;S1 S4 S6 S8 相 似 度 大 于 0.9, 均 符 合 要 求 ;S3 S10 相 似 度
中 草 药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 44 卷 第 8 期 2013 年 4 月 993 B138406120 B138455095 B138419042 B138427035 B138437033 D138266 0 10.87 21.73 32.60 43.47 54.34 65.20 76.07 图 3 同 一 厂 家 不 同 批 次 养 阴 清 肺 糖 浆 的 HPLC 指 纹 图 谱 Fig. 3 HPLC fingerprint of different batches of YQS from same manufactory 均 在 0.9 以 下, 分 别 为 0.695 和 0.037, 这 2 个 厂 家 样 品 相 似 度 低 ; 说 明 不 同 厂 家 养 阴 清 肺 糖 浆 质 量 有 明 显 差 异 同 一 厂 家 不 同 批 次 养 阴 清 肺 糖 浆 的 指 纹 图 谱 相 似 度 测 定 结 果 为 0.964 0.968 0.997 0.969 0.996 0.993 可 知,6 批 次 样 品 相 似 度 良 好, 均 大 于 0.95, 说 明 同 一 厂 家 不 同 批 次 样 品 质 量 稳 定 2.9 样 品 色 谱 数 据 的 系 统 聚 类 分 析 运 用 SPSS 软 件, 对 所 得 高 效 液 相 指 纹 图 谱 数 据 进 行 聚 类 分 析 将 11 个 厂 家 养 阴 清 肺 糖 浆 共 有 峰 相 对 峰 面 积 导 入 SPSS 软 件, 采 用 组 件 均 连 法 (average linkage between groups), 利 用 夹 角 余 弦 (cosine) 作 为 样 品 的 测 度 进 行 分 析 聚 类 分 析 将 不 同 厂 家 样 品 分 为 4 类 其 中 S2 S3 S5 S7 S8 S9 分 在 第 I 类,S1 分 在 第 II 类,S6 S10 S11 分 在 第 III 类,S4 分 在 第 IV 类 根 据 图 4 聚 类 分 析 结 果 可 知, 不 同 厂 家 的 养 阴 清 肺 糖 浆 样 品 存 在 明 显 质 量 差 异 2.10 指 纹 图 谱 相 似 度 及 聚 类 分 析 结 果 比 较 分 析 根 据 11 个 厂 家 养 阴 清 肺 糖 浆 指 纹 图 谱 测 定 及 相 似 度 评 价 结 果, 说 明 不 同 厂 家 质 量 差 异 较 大 其 中,S1 的 2 号 峰 较 高,14 号 峰 较 小, 在 68.686 min 有 其 他 厂 家 没 有 的 特 殊 峰 ;S3 的 14 号 21 号 峰 较 大,23 号 峰 较 小 ;S4 的 6 号 21 号 峰 较 小, 在 17.916 24.699 31.335 min 较 其 他 厂 家 出 峰 高 ;S6 的 6 号 10 号 21 号 22 号 峰 均 很 小 ;S8 的 7 号 21 号 峰 S5 S7 S2 S3 S8 S9 S1 S6 S11 S10 S4 相 似 系 数 0 5 10 15 20 25 图 4 聚 类 分 析 Fig. 4 Cluster analysis 很 小, 在 24.699 min 较 其 他 厂 家 出 峰 高 ;S10 的 21 号 峰 很 小,15 号 峰 为 一 个 峰 面 积 为 38 338 的 高 峰, 其 余 厂 家 15 号 峰 面 积 均 为 2 000 多, 经 鉴 定 15 号 峰 为 防 腐 剂 苯 甲 酸 钠 的 峰 结 合 聚 类 分 析 结 果, 不 同 厂 家 样 品 被 聚 为 4 类, 说 明 其 质 量 差 异 较 大 通 过 比 较 发 现, 相 似 度 评 价 结 果 和 聚 类 分 析 结 果 不 一 致 其 原 因 是 相 似 度 的 计 算 是 按 照 各 色 谱 峰 峰 面 积 中 位 数 生 成 共 有 模 式, 研 究 对 象 是 每 张 指 纹 图 谱 的 各 个 色 谱 峰 ; 而 聚 类 分 析 研 究 对 象 是 所 有 指 纹 图 谱 的 共 有 峰, 故 聚 类 分 析 未 出 体 现 非 共 有 峰 的 信 息 3 讨 论 3.1 供 试 品 制 备 方 法 及 色 谱 条 件 的 选 择 3.1.1 供 试 品 制 备 方 法 的 选 择 本 实 验 考 察 了 提 取
994 中 草 药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 44 卷 第 8 期 2013 年 4 月 溶 剂 为 甲 醇 乙 醇 甲 醇 - 水 (1 1) 乙 醇 - 水 (1 1) [4] 的 情 况, 其 中 乙 醇 - 水 (1 1) 提 取 物 的 色 谱 峰 最 多, 故 选 择 50% 乙 醇 溶 液 提 取 ; 采 用 回 流 提 取 和 超 声 提 取 的 提 取 物 色 谱 图 的 峰 形 无 明 显 差 异, 故 选 用 方 便 快 捷 的 超 声 提 取 法 ; 超 声 10 20 30 40 min 的 提 取 物 色 谱 图 无 明 显 差 异, 故 选 取 时 间 最 短 的 10 min 进 行 超 声 提 取 ; 提 取 溶 剂 量 5 倍 量 10 倍 量 25 倍 量 溶 剂 提 取 物 色 谱 图 中, 不 同 倍 量 溶 剂 提 取 物 色 谱 峰 数 量 和 分 离 度 无 明 显 差 别, 故 选 择 倍 量 较 少 的 5 倍 量 溶 剂 提 取 ; 经 考 察, 离 心 能 增 加 提 取 物 纯 度, 滤 除 沉 淀, 故 选 取 4 500 r/min 离 心 10 min 3.1.2 色 谱 条 件 的 选 择 分 别 对 乙 腈 - 水 - 冰 醋 酸 甲 醇 - 水 乙 腈 - 水 和 乙 腈 -0.1% 磷 酸 水 等 体 系 进 行 了 梯 度 洗 脱 试 验 结 果 表 明, 乙 腈 -0.1% 磷 酸 水 系 统 有 助 于 各 色 谱 峰 的 分 离, 色 谱 峰 最 多, 分 离 度 最 好 分 别 考 察 了 4 种 体 积 流 量 :0.5 0.8 1.0 2.0 ml/min, 结 果 表 明 0.8 ml/min 为 最 佳 体 积 流 量 ; 依 次 考 察 了 210 230 236 254 274 290 300 nm 7 种 不 同 的 波 长 对 图 谱 的 影 响, 结 果 在 254 nm 波 长 下, 色 谱 峰 较 多, 兼 顾 了 多 种 成 分, 各 峰 分 离 度 良 好, 基 线 平 稳, 且 是 养 阴 清 肺 糖 浆 中 丹 皮 主 要 成 分 丹 皮 酚 的 最 大 吸 收 波 长, 故 选 择 254 nm 为 检 测 波 长 依 次 考 察 了 20 25 30 35 4 种 不 同 的 柱 温, 结 果 表 明, 柱 温 高 低 对 色 谱 峰 峰 形 保 留 时 间 影 响 较 大, 最 终 选 择 30 为 最 佳 柱 温 3.2 指 纹 图 谱 15 号 峰 的 归 属 及 分 析 经 鉴 定, 指 纹 图 谱 15 号 峰 可 能 为 防 腐 剂 苯 甲 酸 钠 部 颁 标 准 中 规 定 苯 甲 酸 钠 添 加 量 为 0.3%,S10 样 品 该 峰 面 积 远 远 超 过 其 他 厂 家, 测 得 其 量 约 为 3.23%, 分 析 可 能 为 防 腐 剂 加 入 量 过 大 也 可 能 和 苯 甲 酸 钠 在 酸 性 条 件 下 溶 解 度 较 低 有 关, 如 果 搅 拌 不 均 匀, 会 出 现 局 部 有 苯 甲 酸 钠 结 晶 析 出, 导 致 局 部 产 品 添 加 剂 超 标 近 年 来 研 究 发 现, 因 山 梨 酸 和 山 梨 酸 钾 的 毒 性 比 苯 甲 酸 小, 防 腐 效 果 比 苯 甲 酸 钠 好 更 加 安 全, 许 多 国 家 已 经 开 始 逐 渐 采 用 山 梨 酸 和 山 梨 酸 钾 替 代 苯 甲 酸 和 苯 甲 酸 钠 所 以 建 议 对 养 阴 清 肺 糖 浆 防 腐 剂 的 加 入 种 类 与 方 式 应 加 以 研 究 和 改 进 3.3 造 成 产 品 质 量 差 异 的 原 因 造 成 产 品 质 量 差 异 的 原 因 有 以 下 几 点 :1 原 药 材 来 源 不 同, 加 工 炮 制 方 法 的 差 异, 易 造 成 药 材 质 量 的 差 异, 从 而 导 致 中 药 制 剂 质 量 不 稳 定 [5] ;2 以 本 实 验 为 例, 部 颁 标 准 中 关 于 水 提 和 醇 提 的 溶 剂 倍 量 提 取 时 间 混 合 静 置 时 间 沉 淀 转 溶 及 浓 缩 方 法 等 工 艺 参 数 均 没 有 明 确 说 明, 各 厂 家 通 常 按 照 经 验 来 调 整 和 控 制, 这 些 工 艺 参 数 对 成 品 的 质 量 至 关 重 要 ;3 未 严 格 按 照 处 方 量 和 工 艺 制 备, 如 防 腐 剂 添 加 过 量 等, 均 会 导 致 指 纹 图 谱 出 峰 异 常, 影 响 其 质 量 3.4 小 结 本 实 验 以 养 阴 清 肺 糖 浆 原 有 部 颁 标 准 为 基 础, 首 次 建 立 了 养 阴 清 肺 糖 浆 HPLC 指 纹 图 谱 该 方 法 简 便 可 靠, 专 属 性 强, 精 密 度 稳 定 性 重 现 性 均 良 好 对 11 个 厂 家 养 阴 清 肺 糖 浆 指 纹 图 谱 进 行 了 分 析 和 比 较 相 似 度 评 价 和 聚 类 分 析 的 结 果 表 明, 不 同 厂 家 养 阴 清 肺 糖 浆 质 量 差 异 较 大 同 一 厂 家 不 同 批 次 的 样 品 指 纹 图 谱 相 似 度 较 高, 质 量 较 稳 定 本 实 验 为 完 善 养 阴 清 肺 糖 浆 质 量 评 价 体 系, 以 及 进 一 步 研 究 工 艺 参 数 对 其 质 量 的 影 响 奠 定 了 基 础 并 为 以 指 纹 图 谱 技 术 作 为 中 药 复 方 制 剂 质 量 控 制 的 新 方 法 提 供 技 术 支 持 今 后, 可 以 建 立 在 规 范 并 统 一 原 药 材 和 生 产 工 艺 参 数 的 基 础 上, 生 成 标 准 对 照 指 纹 图 谱, 从 相 似 度 共 有 峰 保 留 时 间 和 峰 面 积 等 参 数 比 对 来 控 制 中 间 体 及 成 品 的 质 量, 并 选 取 规 定 了 上 下 限 参 考 值 的 指 标 性 和 功 效 成 分 进 行 定 量, 结 合 薄 层 色 谱 鉴 别 方 法, 实 施 全 过 程 质 量 控 制, 建 立 一 套 完 整 的 质 量 标 准 在 此 基 础 上, 该 中 药 制 剂 的 各 项 检 查 项 目, 如 乙 醇 的 量 含 糖 量 ph 值 总 固 体 等 也 均 可 以 控 制 在 一 个 相 对 稳 定 的 范 围 从 而 使 该 制 剂 的 质 量 稳 定 可 控, 确 保 其 临 床 使 用 安 全 有 效 参 考 文 献 [1] 中 华 人 民 共 和 国 卫 生 部 药 品 标 准 中 药 成 方 制 剂. [S]. 第 十 五 册. 1998. [2] 孙 姣, 孙 泽 沾, 康 勇. ZTC 1+1 用 于 养 阴 清 肺 糖 浆 水 提 液 的 絮 凝 工 艺 研 究 [J]. 中 草 药, 2011, 42(3): 478-483. [3] 中 国 药 典 [S]. 一 部. 2010. [4] 王 磊. 养 阴 清 肺 糖 浆 静 置 工 艺 的 研 究 [D]. 天 津 : 天 津 大 学, 2007. [5] 封 亮, 贾 晓 斌, 范 晨 怡, 等. HPLC 测 定 六 味 地 黄 浓 缩 丸 及 药 材 的 指 纹 图 谱 [J]. 中 成 药, 2008, 30(12): 1720-1726.