36期

中 国 农 学 通 报 22,28(6):7-2 Chinese Agricultural Science Bulletin 响 应 曲 面 法 优 化 罗 布 麻 愈 伤 组 织 中 绿 原 酸 的 提 取 工 艺 邓 倩, 王 芳, 刘 小 锐, 计 巧 灵 ( 新 疆 大 学 生 命 科 学 与 技 术 学 院 新 疆, 乌 鲁 木 齐 846) 摘 要 : 通 过 优 化 罗 布 麻 愈 伤 组 织 中 绿 原 酸 的 提 取 工 艺, 为 进 一 步 探 索 规 模 化 提 取 罗 布 麻 愈 伤 组 织 中 的 绿 原 酸 奠 定 前 期 工 作 基 础 以 罗 布 麻 愈 伤 组 织 中 绿 原 酸 得 率 为 指 标, 通 过 HPLC 法 测 定 并 比 较, 得 出 最 佳 提 取 方 法 ; 在 单 因 素 试 验 的 基 础 上, 结 合 响 应 曲 面 法 优 化 提 取 绿 原 酸 的 工 艺 从 罗 布 麻 愈 伤 组 织 中 提 取 绿 原 酸 的 最 佳 方 法 是 超 声 波 辅 助 提 取 法 ; 在 单 因 素 试 验 的 基 础 上, 结 合 响 应 曲 面 法 优 化 超 声 波 辅 助 提 取 绿 原 酸 的 最 佳 工 艺 条 件 为 : 提 取 时 间 4 min, 提 取 功 率 4 W, 料 液 比 :4, 绿 原 酸 最 高 得 率 为.49 mg/g, 提 取 时 间 和 提 取 功 率 的 交 互 作 用 对 得 率 有 显 著 影 响 建 立 的 二 次 多 项 式 数 学 模 型 对 从 罗 布 麻 愈 伤 组 织 中 提 取 绿 原 酸 具 有 重 要 的 指 导 作 用 关 键 词 : 罗 布 麻 愈 伤 组 织 ; 绿 原 酸 ; 提 取 工 艺 ; 响 应 曲 面 法 中 图 分 类 号 :Q8. 文 献 标 志 码 :A 论 文 编 号 :22-684 RSM in Extraction Process Optimization for Yield of Chlorogenic Acid in Callus of Apocynum venetum Deng Qian, Wang Fang, Liu Xiaorui, Ji Qiaoling (College of Life Science and Technology, Xinjiang University, Urumqi 846) Abstract: RSM in extraction process optimization for yield of chlorogenic acid (CGA) in callus of Apocynum venetum, the results laid the foundation for further exploration of extracting CGA in the callus on large scale. The yield of CGA was taken as the index, CGA yields in the callus were determined with HPLC and compared, the optimum extraction process was determined. On the basis of single factor analysis test, combined with central composite experimental design principle, response surface methodology (RSM) was used to optimize extraction process. The optimum extraction method from callus of A. venetum was microwave-assisted extraction. On the basis of single factor analysis test, experiments were carried out and combined with RSM, the optimum microwave-assisted extraction process was as follows: extraction time 4 min, extraction power 4 W, ratio of solid to liquid :4, the CGA maximum yield reached.49 mg/g, interaction between extraction time and extraction power had a significant impact. Establishment of the two polynomial mathematical models had the important role for CGA extraction from callus of A. venetum. Key words: callus of Apocynum venetum L.; chlorogenic acid; extraction process; response surface methodology 引 言 罗 布 麻 全 草 入 药, 作 为 药 材 历 史 悠 久, 目 前 收 载 入 [-2] 25 2 年 的 中 华 人 民 共 和 国 药 典 之 中 此 [] 外, 它 还 具 有 较 高 的 生 态 价 值 和 经 济 价 值 但 近 年 报 道 罗 布 麻 资 源 已 匮 乏 [4] 利 用 组 织 培 养 法 生 产 重 要 的 药 效 成 份 已 成 为 天 然 药 物 生 产 的 研 究 热 点, 它 具 有 代 替 原 植 物 获 得 有 效 成 份, 并 可 能 高 产 的 优 点 978 [5] 年 郑 光 植 等 在 国 际 会 议 上 提 出 了 植 物 细 胞 有 次 级 基 金 项 目 : 国 家 自 然 科 学 基 金 项 目 亚 麻 与 罗 布 麻 体 细 胞 杂 交 及 其 种 质 的 耐 盐 性 遗 传 研 究 (6695) 第 一 作 者 简 介 : 邓 倩, 女,988 年 出 生, 在 读 硕 士 生, 研 究 方 向 : 植 物 生 物 技 术 通 信 地 址 :846 新 疆 大 学 胜 利 路 4 号 生 命 科 学 与 技 术 学 院,E-mail: 5658879@qq.com 通 讯 作 者 : 计 巧 灵, 女,956 年 出 生, 安 徽 人, 教 授, 硕 士, 研 究 方 向 : 植 物 生 物 技 术 通 信 地 址 :846 新 疆 大 学 胜 利 路 4 号 生 命 科 学 与 技 术 学 院, E-mail:wji8@6.com 收 稿 日 期 :22-5-2, 修 回 日 期 :22-7-22

8 中 国 农 学 通 报 http://www.casb.org.cn 代 谢 的 全 能 性 的 观 点, 目 前 运 用 组 织 培 养 技 术 获 得 有 效 成 分 成 功 的 药 用 植 物 已 有 几 十 种, 该 技 术 是 解 决 天 然 药 用 植 物 资 源 匮 乏 活 性 成 分 低 或 不 稳 定 等 问 题 的 有 效 途 径 之 一 [6] 绿 原 酸 (Chlorogenic acid,cga), 又 名 咖 啡 鞣 酸, 是 咖 啡 酸 与 奎 尼 酸 的 缩 酚 酸 [7], 常 以 羟 基 桂 皮 酸 酯 的 形 式 广 泛 存 在 植 物 中, 是 莽 草 酸 途 径 的 产 物 从 Kim [8] 等 报 道 的 罗 布 麻 叶 水 提 物 及 其 成 分 对 Cu 2+ 诱 导 的 低 密 度 脂 蛋 白 氧 化 的 抑 制 作 用 表 明, 罗 布 麻 叶 中 的 绿 原 酸 抗 氧 化 作 用 最 强 绿 原 酸 除 了 具 有 强 抗 氧 化 能 力 [9-] [-2] [-4] [5] 外, 还 具 有 抗 病 毒 降 脂 抗 癌 和 抗 肿 瘤 等 疗 效, 目 前 中 国 抑 菌 抗 病 毒 药 物 的 质 量 标 准 主 要 以 绿 [9,6] [7] 原 酸 含 量 为 主 Wang 等 报 道 了 杜 仲 悬 浮 培 养 物 [8] 中 绿 原 酸 的 积 累 ; 王 亚 琴 等 也 对 杜 仲 悬 浮 细 胞 产 绿 [9-2] 原 酸 进 行 了 初 步 研 究 在 前 期 工 作 的 基 础 上, 笔 者 通 过 响 应 曲 面 法 优 化 了 从 罗 布 麻 愈 伤 组 织 提 取 CGA 的 方 法, 旨 在 为 进 一 步 探 索 规 模 化 提 取 罗 布 麻 愈 伤 组 织 中 的 绿 原 酸 奠 定 前 期 工 作 基 础 材 料 与 方 法. 仪 器 与 试 药 高 效 液 相 色 谱 仪 ( 日 本 岛 津 公 司 )LC-A (LC-ATVP 泵,SPD-AVP 紫 外 检 测 器, CTO-AVP 柱 温 箱,2 化 学 工 作 站 );.22 μm 有 机 微 孔 纤 维 素 滤 膜 ( 上 海 兴 亚 公 司 ); 减 压 浓 缩 装 置 ; 紫 外 可 见 分 光 光 度 计 (UV-, 中 国 莱 伯 泰 公 司 ); 紫 外 透 射 反 射 仪 (WD-94C 型, 北 京 沃 德 生 物 医 学 仪 器 公 司 ); 超 声 波 细 胞 粉 碎 机 (JY-92D 型, 宁 波 新 芝 生 物 科 技 有 限 股 份 公 司 ); 试 验 室 常 规 仪 器 设 备 甲 醇 冰 醋 酸 无 水 甲 醇 乙 酸 乙 酯 无 水 乙 醇 ( 甲 醇 为 色 谱 纯, 其 余 试 剂 与 药 品 均 为 分 析 纯 ) 绿 原 酸 标 准 品 ( 色 谱 纯 ) 购 自 南 京 青 泽 医 药 科 技 开 发 有 限 公 司.2 材 料 用 罗 布 麻 无 菌 苗 的 下 胚 轴 作 外 植 体, 在 MB+6-BA (.5 mg/l)+naa(.5 mg/l)+ 蔗 糖 g/l+ 琼 脂 7 g/l 的 培 养 基 上 诱 导 出 愈 伤 组 织, 并 进 行 固 体 继 代 扩 增, 继 代 周 期 为 天 将 得 到 的 一 部 分 愈 伤 组 织 在 常 温 下 晾 干, 用 研 钵 研 成 粉, 过 4 目 筛, 作 为 优 化 提 取 工 艺 的 材 料 ; 另 一 部 分 愈 伤 组 织 继 续 继 代 扩 增. 方 法.. 最 佳 提 取 方 法 的 选 择 对 愈 伤 组 织 粉 末 分 别 采 用 [2] [22] [2] 超 声 波 法 索 氏 提 取 法 和 水 提 醇 沉 法 提 取 绿 原 酸, 选 出 最 佳 的 提 取 方 法..2 对 照 品 吸 收 峰 值 的 确 定 精 密 称 取 绿 原 酸 对 照 品. mg, 用 甲 醇 溶 解 ; 定 容 至 ml, 在 紫 外 可 见 分 光 光 度 计 下 扫 描, 由 此 确 定 绿 原 酸 的 最 大 吸 收 峰 值.. 高 效 液 相 色 谱 条 件 绿 原 酸 测 定 采 用 色 谱 柱 : Cl8 54.6 mm( 日 本 岛 津 公 司 ); 流 动 相 为 甲 醇 :% 冰 乙 酸 =4:6; 流 速 为.6 ml/min; 进 样 量 为 2 μl; 柱 温 为 室 温 ; 检 测 系 统 为 紫 外 检 测 器 ; 检 测 波 长 为 确 定 的 绿 原 酸 最 大 吸 收 峰 值..4 绿 原 酸 标 准 曲 线 的 绘 制 及 线 性 关 系 的 考 察 精 密 称 取 绿 原 酸 对 照 品. mg, 用 8% 甲 醇 溶 解, 定 容 至 5 ml, 浓 度 为.6 mg/ml 标 准 品 溶 液 分 别 精 确 吸 取 绿 原 酸 标 准 品.2.5.8..5 ml, 用 8% 甲 醇 定 容 至 ml, 分 别 用.22 μm 孔 径 滤 膜 过 滤 后, 取 2 μl 进 样, 用 高 效 液 相 色 谱 仪 测 定 峰 面 积 值..5 方 法 学 考 察 () 精 密 度 试 验 将 绿 原 酸 对 照 品 溶 液 ( 浓 度 为 6 μg/ml) 连 续 进 样 5 次, 每 次 2 μl, 按 色 谱 条 件 测 定 峰 面 积 值 (2) 稳 定 性 试 验 按 最 优 提 取 工 艺 制 备 供 试 品 溶 液, 分 别 在 2 6 8 2 h 进 样 测 定 () 重 复 性 试 验 精 确 称 取 5 份 同 种 样 品 各. g, 按 最 优 提 取 工 艺 制 备 5 份 供 试 溶 液, 分 别 按 色 谱 条 件 测 定 绿 原 酸 含 量 (4) 加 样 回 收 率 试 验 精 密 称 取 5 份 已 知 绿 原 酸 含 量 的 样 品 各. g, 分 别 精 确 加 入 绿 原 酸 对 照 品. mg, 按 最 优 提 取 工 艺 制 备 5 份 供 试 溶 液, 分 别 取 2 μl 进 样 测 定..6 HPLC 检 测 将 标 准 溶 液 按 上 述 色 谱 条 件 进 行 测 定, 确 定 绿 原 酸 的 保 留 时 间, 作 为 供 试 品 的 参 照 用 同 样 的 色 谱 条 件 测 定 供 试 溶 液..7 最 佳 提 取 工 艺 的 优 化 设 置 最 佳 提 取 方 法 的 影 响 因 素 和 水 平, 通 过 响 应 曲 面 法 优 化, 筛 选 绿 原 酸 含 量 最 高 的 提 取 条 件 2 结 果 与 分 析 2. 绿 原 酸 最 佳 提 取 方 法 的 确 定 从 比 较 种 方 法 提 取 绿 原 酸 的 结 果 看 出, 超 声 波 法 提 取 愈 伤 组 织 粉 末 中 绿 原 酸 的 得 率 最 高, 且 方 法 简 便 因 此 之 后 的 试 验 均 采 用 超 声 波 法 提 取 CGA 2.2 对 照 品 最 大 吸 收 峰 值 和 溶 液 的 线 性 关 系 对 照 品 绿 原 酸 的 最 大 吸 收 峰 值 为 28 nm 以 绿 原 酸 标 准 品 浓 度 为 横 坐 标, 峰 面 积 为 纵 坐 标, 得 回 归 方 程 :Y=7258X-225,r=.9999 绿 原 酸 在 ~ 5 μg/ml 范 围 内 均 呈 良 好 的 线 性 关 系 2. 方 法 学 考 察 结 果 精 密 度 试 验 结 果 表 明, 相 对 标 准 偏 差 RSD=.97%, 说 明 本 法 在 此 条 件 下 精 密 度 良 好 ; 稳 定 性 试 验

邓 倩 等 : 响 应 曲 面 法 优 化 罗 布 麻 愈 伤 组 织 中 绿 原 酸 的 提 取 工 艺 9 结 果 测 得, 绿 原 酸 峰 面 积 的 RSD=.% (n=6), 说 明 供 试 品 溶 液 在 2 h 内 稳 定 ; 重 复 性 试 验 结 果,RSD=.5% (n=5), 说 明 重 现 性 良 好 ; 加 样 回 收 率 试 验 结 果, 绿 原 酸 的 平 均 回 收 率 为 96.%,RSD=.44%, 说 明 该 法 适 宜 于 罗 布 麻 愈 伤 组 织 中 绿 原 酸 含 量 的 测 定 2.4 绿 原 酸 标 准 品 和 供 试 品 的 HPLC 检 测 图 从 图 中 可 知 绿 原 酸 标 准 品 的 保 留 时 间 为 5.262 min, 从 供 试 液 色 谱 图 2 中 可 知, 图 中 出 现 有 2 个 峰, 保 留 时 间 分 别 为.24 min 和 5. min, 从 保 留 时 间 为 5. min 的 峰 可 判 定 供 试 液 中 含 有 绿 原 酸 电 压 值 /mv 保 留 时 间 /min 图 绿 原 酸 标 准 品 色 谱 图 电 压 值 /mv 保 留 时 间 /min 图 2 样 品 中 绿 原 酸 的 色 谱 图 2.5 响 应 曲 面 法 确 定 的 罗 布 麻 愈 伤 组 织 中 绿 原 酸 最 佳.44 mg/g; 超 声 提 取 的 最 佳 料 液 比 为 :4, 绿 原 酸 含 提 取 工 艺 量 为.466 mg/g 2.5. 单 因 素 试 验 设 计 试 验 分 成 个 组 号, 详 细 情 况 2.5.2 响 应 面 因 素 水 平 设 计 及 结 果 分 析 利 用 见 表 Minitab5 软 件, 根 据 Box-Behnken 的 中 心 组 合 设 计 原 [24] 单 因 子 试 验 结 果 ( 图 ~5) 显 示, 超 声 提 取 的 最 佳 时 理, 以 提 取 时 间 (A), 超 声 功 率 (B), 料 液 比 (C) 个 因 间 为 min, 提 取 的 绿 原 酸 含 量 最 高 为.46 mg/g 子 为 自 变 量, 以 绿 原 酸 的 得 率 为 响 应 值, 设 计 三 因 素 三 超 声 提 取 的 最 佳 功 率 为 8 W, 绿 原 酸 含 量 为 水 平 共 5 个 试 验 点 的 响 应 面 分 析 试 验 ( 表 2)

中 国 农 学 通 报 http://www.casb.org.cn 表 单 因 素 试 验 设 计 试 验 提 取 条 件 组 号 提 取 时 间 /min 提 取 功 率 /W 料 液 比 (W/L) 提 取 试 剂,2,,4,5,6 8 :4 8% 甲 醇 2 4,8,2,6,2 :4 8% 甲 醇 8 :2,:,:4,:5,:6 8% 甲 醇 注 : 试 验 2 依 次 进 行 绿 原 酸 含 量 绿 原 酸 含 量 超 声 时 间 图 超 声 时 间 对 绿 原 酸 含 量 的 影 响 图 5 料 液 比 对 绿 原 酸 含 量 的 影 响 物 料 比 表 2 响 应 面 分 析 因 子 及 水 平 表 水 平 提 取 时 间 (A)/min 超 声 功 率 (B)/W 料 液 比 (C) 绿 原 酸 含 量 超 声 功 率 图 4 超 声 功 率 对 绿 原 酸 含 量 的 影 响 根 据 表 结 果, 采 用 Minitab5 软 件 进 行 模 拟 回 归 分 析, 得 到 绿 原 酸 提 取 率 对 超 声 时 间 (A) 超 声 功 率 (B) 液 料 比 (C) 的 二 次 多 项 式 回 归 方 程 : 从 表 可 看 出, 提 取 时 间 4 min, 提 取 功 率 4 W, 料 液 比 :4 的 提 取 条 件 下 提 取 得 到 的 绿 原 酸 含 量 最 高 达 到.49 mg/g - 对 该 回 归 模 型 进 行 方 差 分 析, 结 果 见 表 4 由 表 4 可 知, 失 拟 项 P=.276>.5, 说 明 在 P=.5 水 平 上 预 测 值 与 实 测 值 的 差 异 不 显 著, 模 型 拟 合 情 况 良 好 从 表 5 看 出, 超 声 时 间 和 超 声 功 率 的 交 互 作 用 对 绿 原 酸 得 率 有 显 著 的 影 响 (P<.5), 其 余 项 影 响 不 显 著 对 绿 原 酸 含 量 影 响 程 度 由 大 到 小 依 次 为 : 超 声 时 间 > 料 液 比 > 超 声 功 率 讨 论 2 4 本 研 究 首 次 利 用 响 应 曲 面 法 (RSM) 对 罗 布 麻 愈 伤 [7] 组 织 中 绿 原 酸 的 提 取 工 艺 进 行 了 优 化,Wang 等 研 究 表 明, 运 用 响 应 曲 面 法 提 取 杜 仲 悬 浮 细 胞 中 的 绿 原 酸 得 率 为 2.5 mg/g, 与 原 植 物 中 绿 原 酸 得 率 相 近 本 室 [9] 已 多 年 从 事 罗 布 麻 组 织 和 细 胞 培 养, 刘 小 锐 等 用 改 良 的 索 氏 提 取 法 提 取 罗 布 麻 愈 伤 组 织 中 的 绿 原 酸, 得 [2] 率 为.6249 mg/g, 高 小 艳 等 采 用 超 声 波 辅 助 提 取 法 从 罗 布 麻 悬 浮 细 胞 中 提 取 绿 原 酸, 得 率 为 4 8 2 : :4 :5

邓 倩 等 : 响 应 曲 面 法 优 化 罗 布 麻 愈 伤 组 织 中 绿 原 酸 的 提 取 工 艺 运 行 序 号 2 4 5 6 7 8 9 2 4 5 来 源 回 归 表 试 验 设 计 及 绿 原 酸 含 量 绿 原 酸 含 量 /(mg/g) A B C - - - - - - - - - - - - 预 测 值.474.988.824.79.944.69.555.425.49.788.49.46.824.826.476 实 测 值.474.988.824.79.944.69.555.425.49.788.48.46.824.824.477 表 4 回 归 模 型 的 方 差 分 析 表 平 方 和 自 由 度 (DF) (SS) 9.42 均 方 (MS) F 值 P 值.49 2..86 的 最 佳 得 率 为.49 mg/g, 远 高 于 前 期 从 培 养 物 中 绿 原 酸 的 得 率, 也 远 高 于 原 植 物 叶 中 绿 原 酸 的 得 率 (.22 mg/g) 说 明 在 提 取 工 艺 的 优 化 上, 用 响 应 曲 面 法 比 常 规 的 正 交 设 计 法 更 优 越 传 统 的 正 交 设 计 法 同 时 考 虑 多 种 因 素 水 平, 寻 求 最 佳 因 素 水 平 组 合, 但 不 能 在 给 定 的 整 个 区 域 上 找 到 因 素 和 响 应 值 之 间 的 一 个 明 确 的 函 数 表 达 式 响 应 面 分 析 法 是 通 过 中 心 组 合 试 验 设 计 对 几 种 因 素 及 其 交 互 作 用 的 一 种 回 归 分 析 法, 具 有 试 验 次 数 少 周 期 短 求 得 的 回 归 方 程 精 度 高 等 优 点 随 着 计 算 机 技 术 的 发 展, 这 种 方 法 已 成 为 精 度 高 应 用 广 并 具 有 实 用 生 产 指 导 作 用 的 技 术 4 结 论 在 单 因 子 试 验 的 基 础 上, 用 Box-Benhnken 的 中 心 组 合 试 验 设 计 试 验, 用 响 应 面 法 优 化 以 及 Minitab5 软 件 分 析, 以 罗 布 麻 愈 伤 组 织 中 的 绿 原 酸 含 量 为 响 应 值, 以 提 取 时 间 超 声 功 率 和 料 液 比 为 考 察 因 素, 建 立 了 二 次 多 项 式 数 学 模 型, 并 对 该 模 型 进 行 了 显 著 性 检 验, 确 定 了 绿 原 酸 最 佳 提 取 工 艺 为 : 超 声 波 辅 助 提 取 时 间 4 min 提 取 功 率 4 W 料 液 比 :4, 在 此 条 件 下 绿 原 酸 得 率 为.49 mg/g 该 模 型 对 进 一 步 从 罗 布 麻 培 养 物 中 规 模 化 提 取 绿 原 酸 的 实 际 生 产 具 有 重 要 的 指 导 作 用 线 性 平 方 交 互 作 用 残 差 误 差 失 拟 纯 误 差 合 计 项 常 量 A B C A 2 B 2 C 2 AB AC BC 5 2 4.225.64.656.28.26.627.6658.75.2.287.648.87..66.87.8 2.78.289.252.2.276 表 5 二 次 模 型 回 归 方 程 系 数 显 著 性 检 验 系 数 系 数 标 准 误 T P.428.8862.6.68.996 -.7654 -.2679 -.4225.45.22.4692.8997.8997.8997.24.24.24.2724.2724.2724 27.48 2.97.8.756.57.578 -.969 -.6.26.7..9.9.484.9 -.588.6.25.758.87.8 mg/g, 笔 者 运 用 响 应 曲 面 法 优 化 了 超 声 波 辅 助 提 取 绿 原 酸 的 工 艺, 从 罗 布 麻 愈 伤 组 织 中 得 到 绿 原 酸 参 考 文 献 [] 张 卫 明, 肖 正 春, 顾 龚 平, 等. 罗 布 麻 资 源 利 用 与 罗 布 麻 植 物 分 类 问 题 [J]. 中 国 野 生 植 物 资 源,26,25(2):5-9. [2] 杨 志 芳, 王 维 娜, 杨 冲, 等. 正 交 设 计 优 选 罗 布 麻 叶 中 总 黄 酮 提 取 工 艺 [J]. 中 草 药,26,7(8):77-78. [] 王 宁, 陈 斌. 柴 达 木 盆 地 资 源 植 物 罗 布 麻 的 开 发 利 用 [J]. 青 海 科 技, 25(6):5-6. [4] 徐 红. 新 疆 罗 布 麻 品 种 特 点 及 开 发 [J]. 新 纺 织,25(8):5-9. [5] 罗 玉. 利 用 毛 状 根 的 培 养 生 产 植 物 次 生 代 谢 物 [J]. 云 南 农 业 科 技, 2(2):4-42. [6] 李 品, 岳 彩 鹏, 王 新 建, 等. 植 物 细 胞 培 养 生 产 次 生 代 谢 物 的 影 响 因 素 [J]. 河 南 林 业 科 技,27,27():2-2. [7] 吴 卫 华, 康 桢, 欧 阳 冬 生, 等. 绿 原 酸 的 药 理 学 研 究 进 展 [J]. 天 然 产 物 研 究 与 开 发,26(8):69-694. [8] Kim D W, Yokozawa T, Hattori M, et al. Inhibitory effects of an aqueous extract of Apocyum venetum leaves and its constituents on Cu 2 + - induced oxidative modification of low density lipoprotein[j]. Phytother Res,2,4(7):5-54. [9] 胡 克 杰, 孙 考 祥, 王 埽 璐, 等. 氯 原 酸 体 外 抗 病 毒 作 用 研 究 [J]. 哈 尔 滨 医 科 大 学 学 报,2,5(6):4-4. [] Chiang L C, Chiang W, Chang M Y, et al. Antiviral activity of plantago major extracts and related compounds in vitro[j]. Antiviral Res,22(55):5-62. [] Shimizu M, Yoshimi N, Yamada Y, et al. Suppressive effects of

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