Phanta ax aster ix P-0/0/0 Vazyme Biotech Co., Ltd Web: Tel: 00-00-9 Sales: sales@vazyme.com Support: support@vazyme.com Service: service@vazyme.com Vazyme biotech co., ltd. 使用说明书 Version 9.
目 录 Contents 0/产品概述 Phanta ax Super-Fidelity DNA Polymerase是Phanta Super-Fidelity DNA Polymerase的升级 版本 与上一代产品相比 Phanta ax中添加了独特的因子 特异性促进因子以及平台期 解抑制因子 使其在长片段扩增能力 扩增特异性以及扩增产量方面得到了大幅度提升 使用λ DNA 质粒等简单模板 Phanta ax可以有效扩增长达0 kb的片段 使用基因组DNA等复杂模 板 Phanta ax可以扩增长达0 kb的片段 使用cDNA模板 Phanta ax可以有效扩增长达 0 kb的片段 其错配率是普通Taq酶的/ 是Pfu酶的/ 此外 Phanta ax对pcr抑制剂 具有良好的抵抗能力 可用于细菌 真菌 植物组织 动物组织或全血样品的直接PCR Phanta ax中添加了在常温下能够抑制其 聚合酶活性和 外切酶活性的两种单克隆抗 体 可进行高特异性的热启动PCR 本产品包含Phanta ax Super-Fidelity DNA Polymerase dntp以及优化的缓冲体系 只需加入引物和模板即可进行扩增 减少了移液操作 提高了检测 通量和结果的重现性 体系中加入的保护剂使得 aster mix经过反复冻融后仍可保持稳定的 活性 扩增产物为平端 适用于ClonExpress 和拓扑克隆试剂盒(C/C/C/C0) 0/产品组分 组分 P-0 P-0 P-0 ml ml ml 0/保存条件 0/产品概述... 0 0/产品组分... 0 0/保存条件... 0 0/单位定义... 0 0/质量控制... 0 0/实验流程... 0 0-/普通PCR操作流程... 0 0-/长片段扩增指南... 0 0-/粗品扩增指南... 0 07/应用实例... 0 07-/适用于各种长度片段的扩增... 0 07-/稳定的粗品扩增能力... 0 07-/优异的高GC扩增能力... 08 07-/值得信赖的高保真度... 09 08/注意事项... 09 09/常见问题与解决方案... 0-0 ~ - 保存 运输条件 0 避免反复冻融 0/单位定义 用活化的大马哈鱼精子DNA作为模板/引物 7 0 min内 摄入0 nmol的全核苷酸为酸性不溶 物的活性定义为个活性单位(U) 0/质量控制 核酸内切酶残留检测 本品和0. μg Supercoiled pbr DNA在7 下孵育 h 经琼脂糖 凝胶电泳检测 DNA的电泳谱带不发生变化 大肠杆菌残留DNA检测 本品中残留的核酸经E.coli gdna特异性引物进行sybr Green qpcr 检测 E.coli基因组残留低于0拷贝 0/ 0
功能检测 0 μl PCR体系中加入本品 以00 ng人基因组dna为模板 扩增个循 环后取/0的PCR产物进行%琼脂糖凝胶电泳 EB染色 可见单一的7. kb的条带 0-/长片段扩增指南 Phanta ax Super-Fidelity DNA Polymerase具有卓越的长片段扩增能力 扩增特异性以及扩增 功能检测 0 μl PCR体系中加入本品 以0 ng λdna为模板 扩增个循环后取 产量 在扩增长片段时 若推荐程序不能有效扩增 可尝试下表所示Touch Down两步法PCR /0的PCR产物进行%琼脂糖凝胶电泳 EB染色 可见单一的 kb的条带 彻底 0/实验流程 0-/普通PCR操作流程 所有操作请在冰上进行 各组分解冻后请充分混匀 用完之后请及时放回-0 保存 up to 0 μl x μl 模板DNAa 来优化PCR反应 a 退火b c 彻底 模板起始量 0-00 ng 0 pg - 0 ng - μl (不超过PCR反应总体积的/0) ~ 0 sec/ 0 - - b. 请根据引物Tm值设置退火 如引物Tm值 可删除退火步骤 直接进行后续的步骤(两 步法PCR) 如果需要 可以设置退火梯度寻找引物与模板结合的最适 此外 退火直 接决定扩增特异性 如发现扩增特异性差 可适当提高退火 0-/粗品扩增指南 Phanta ax Super-Fidelity DNA Polymerase对许多PCR抑制剂具有良好的抵抗能力 可用于细 样品类型 全血 滤纸干血清 培养细胞 酵母 细菌 霉菌 精液 浮游生物 植物组织 小鼠尾巴 食品 推荐操作方式(0 μl体系) 吸取 - μl作为扩增模板 剪取 - mm滤纸作为扩增模板 取少量细胞作为扩增模板 挑取单克隆或 μl菌液作为扩增模板 挑取单克隆或 μl菌液作为扩增模板 挑取少量作为扩增模板 挑取少量作为扩增模板 挑取少量作为扩增模板 剪取 - mm组织作为扩增模板 吸取 - μl裂解液作为扩增模板 吸取 - μl裂解液作为扩增模板 扩增方式 裂解后吸取裂解液扩增 裂解后吸取裂解液扩增 样品裂解液制备过程 动物组织 /食品 取少量样品浸泡于00 μl Lysis Buffer中 补加Proteinase K至 终浓度为00 μg/ml(自备) 0 0 min a. 推荐大多数模板的为 为 质粒或病毒DNA 0 sec 基因组或cDNA c. 适当延长有助于扩增产量的提高 菌 真菌 植物组织 动物组织或全血样品的直接PCR 下表为已成功扩增的粗品列表 a. 不同模板最佳反应浓度有所不同 下表为0 μl体系推荐模板使用量 请使用高质量的模板 若产量较低可适当提高模板投入量 推荐使用长引物 当扩增片段GC含量> 0%且优化条件也无法正常扩增时 推荐使用PCR Enhancer (Vazyme #P0) 模板种类 基因组DNA 质粒或病毒DNA cdna 7 70 8 8 0 min 充分混匀后 室温离心取上清 Lysis Buffer 0 m Tris-HCl, 00 m EDTA, 0.% SDS, ph 8.0 如实验需要 可依据上述配方自行配制 0/ 0
07/应用实例 07-/适用于各种长度片段的扩增 以人基因组DNA为模板 使用分别扩增0. kb.0 kb. kb.0 kb.0 kb. kb. kb 7. kb 8. kb 0. kb 7.8 kb 0. kb. kb目标 片段 所有扩增引物Tm值均为0 左右(使用Primer Premier 计算) 配制以及反 应程序如下 * 扩增. kb. kb 8. kb目标片段时退火分别是0 70 0 退火 彻底 扩增产物电泳结果 0 / /70 退火* 彻底 to 0 μl μl 00 ng/μl人基因组dna * 全血添加量分别为 μl μl to 0 μl x μl 全血* 7 8 9 0 Phanta ax aster ix A公司高效率 Phanta ax aster ix B公司高效率 DL000 DNA arker : DL000 DNA arker : 0. kb :.0 kb :. kb :.0 kb :.0 kb :. kb 7:. kb 8: 7. kb 9: 8. kb 0: 0. kb : 7.8 kb : 0. kb :. kb 07-/稳定的粗品扩增能力. 以EDTA采血管采集的人类全血(来源于Vazyme实验室)为模板 分别使用 Phanta ax aster ix A公司高效率 B公司高效率扩增,9 bp的目标片段 另外使用扩增更长的目的片段 如,7 bp和8, bp 所 有扩增引物Tm值均为0 左右(使用Primer Premier 计算) 配制以及反应程. kb ( μl血液). kb (血液). kb ( μl血液). kb (血液). kb (血液) 8. kb (血液) * 使用A B公司扩增时 使用各自说明书推荐的条件. 以番茄叶 稻叶 精米(来源于Vazyme实验室)为模板 以稻叶纯化基因组DNA (来源于Vazyme 实验室)为阳性对照 分别使用 A公司高效率 B公司高 效率扩增. kb目标片段 所有扩增引物Tm值均为0 左右(使用Primer Premier 计算) 配制以及如下 植物组织* to 0 μl x μl * 推荐使用植物组织直径为0. - mm 序如下 0/ 0
0 退火 彻底 Phanta ax aster ix A公司高效率 B公司高效率 DL 000 DNA arker A公司高效率 Phanta ax aster ix - 目标片段均为. kb B公司高效率 DL 000 DNA arker 番茄叶 稻叶 精米 稻叶纯化基因组DNA * 使用A B公司扩增时 使用各自说明书推荐的条件 A公司高效率 B公司高效率扩增. kb目标片段 所有扩增引物Tm值 均为0 左右(使用Primer Premier 计算) 配制以及如下 to 0 μl 小鼠尾巴裂解液 退火 彻底 0 7 min 07-/优异的高GC扩增能力 能够高效扩增常规聚合酶无法正常扩增的高GC片段 以人基因组为 模板扩增 bp 900 bp 800 bp,00 bp,00 bp bp目标片段 各扩增子GC含量 均高于8% 依据检测结果可知 在默认条件下均可以高效扩增 所有扩增引物Tm值均为0 左右(使用Primer Premier 计算) 配制参照0-. 以小鼠尾巴(来源于Vazyme实验室)裂解液为模板 分别使用 彻底 sec/kb DL 000 DNA arker bp 8.% GC Content 900 bp 9.% GC Content 800 bp 7.% GC Content 00 bp 7.% GC Content 00 bp 7.7% GC Content bp 7.8% GC Content 07/ 08
07-/值得信赖的高保真度 Phanta ax Super-Fidelity DNA Polymerase具有超高的扩增保真性 其保真度是Taq DNA Polymerase的倍 Pfu DNA Polymerase的倍 显著优于同类产品 下图为LacI分析方 法测定(Cline et al., Nucleic Acids Research : -(99))的不同聚合酶的扩增保 真度比较 80 9 Fidelity Compared to Taq 70 0 0 09/常见问题与解决方案 无产物或产物量少 引物 优化引物设计 退火 设置退火梯度 找到合适的退火 引物浓度 适当提高引物浓度 适当增加 增加至 - 0个循环 模板纯度 使用高纯度模板 模板使用量 使用量可参照推荐量并适量增加 0 有杂带或弥散条带 0 引物 优化引物设计 退火 尝试提高退火并设置退火梯度 引物浓度 降低引物浓度至终浓度为0. µ 有大于目标条带的杂带时可适当减少 减少至 - 0个循环 使用两步法或Touch down PCR程序 模板纯度 使用高纯度模板 模板使用量 使用量参照推荐量调整或适当减少 0 0 0 PrimerSTAR GXL KOD FX 8 Phanta ax Phanta EVO Phanta Q Pfu Taq 08/注意事项. 请使用高质量的模板. 请勿使用dUTP和带有尿嘧啶的引物和模板. Phanta ax Super-Fidelity DNA Polymerase具有较强的校对活性 因此 如扩增产物需 要进行TA克隆 加A之前必须进行DNA纯化. 引物设计: 引物 端最后一个碱基最好为G或者C 引物 端最后8个碱基应避免出现连续错配 引物 端应避免出现发夹结构 正向引物和反向引物的Tm值相差不超过 为佳 Tm值调整至 ~ 为佳(引物Tm 值推荐使用Primer Premier 进行计算) 引物额外附加序列 即与模板非配对序列 不应参与引物Tm值计算 引物的GC含量控制在0% - 0%之间 引物A G C T整体分布要尽量均匀 避免使用GC或者AT含量高的区域 引物内部或者两条引物之间避免有个碱基以上的互补序列 两条引物的 端避免有个 碱基以上的互补序列 引物设计完毕请使用NCBI BLAST功能检索引物特异性 以避免非特异性扩增产生 09/ 0