臺 大 漁 推. 第 十 八 期. 第 1~10 張 頁 瑞 昕 蕭 孟 仁 王 俊 順 陳 秀 男 養 殖 淡 水 長 臂 大 蝦 結 病 毒 及 附 屬 超 小 病 毒 顆 粒 之 研 究 張 瑞 昕 1 蕭 孟 仁 1 王 俊 順 1 2 陳 秀 男 一 前 言 1 國 立 高 雄 大 學 生 命 科 學 系 2 國 立 台 灣 大 學 漁 業 科 學 研 究 所 淡 水 長 臂 大 蝦 (Macrobrachium rosenbergii) 為 臺 灣 重 要 的 養 殖 種 類 之 一, 根 據 政 府 的 漁 業 年 報 顯 示 :2004 年 在 臺 灣 的 養 殖 面 積 約 2528 公 頃 ; 產 量 10039 公 噸, 僅 次 於 白 蝦 ; 產 值 約 新 台 幣 30 億, 高 於 白 蝦 產 值 新 台 幣 10 億 以 上, 由 於 淡 水 長 臂 大 蝦 為 一 高 經 濟 價 值 的 水 產 物 種, 採 取 集 約 式 的 養 殖, 因 此 傳 染 性 疾 病 的 問 題 隨 之 而 起, 進 而 造 成 養 殖 業 者 的 經 濟 損 失, 並 影 響 此 項 產 業 的 發 展, 目 前 已 知 臺 灣 養 殖 淡 水 長 臂 大 蝦 的 疾 病 包 括 :(1) 蝦 苗 階 段 - 淡 水 長 臂 大 蝦 結 病 毒 (M. rosenbergii nodavirus; MrNV) 及 附 屬 超 小 病 毒 顆 粒 (Extra small virus particle; XSV) 的 感 染 所 造 成 的 白 尾 病 (White Tail Disease; WTD) 及 溶 藻 弧 菌 (Vibrio alginolyticus) 螢 光 弧 菌 (Vibrio harveyi) 等 所 造 成 的 弧 菌 病 (Vibriosis)(Anas et al., 2005);(2) 成 蝦 養 殖 階 段 - 乳 酸 鏈 球 菌 (Lactococcus gravieae) 所 造 成 的 肌 肉 白 濁 症 (Cheng et al., 1998); 酵 母 菌 (Yeast) 所 引 起 的 黃 肝 病 (Chen et al., 2003) 及 推 測 由 細 菌 所 造 成 的 軟 殼 症 由 於 水 產 動 物 的 病 毒 性 疾 病 目 前 尚 無 適 當 的 藥 物 可 以 防 治, 只 能 依 賴 檢 驗 的 方 式 以 防 止 病 原 散 佈 及 疫 情 的 擴 大, 因 此 本 文 僅 就 淡 水 長 臂 大 蝦 結 病 毒 及 附 屬 超 小 病 毒 顆 粒 做 一 介 紹, 期 能 對 防 治 淡 水 長 臂 大 蝦 蝦 苗 的 白 尾 病 有 所 助 益 二 流 行 疫 情 自 1992 年 起, 臺 灣 南 部 淡 水 長 臂 大 蝦 繁 殖 場 的 後 期 幼 蟲 蝦
養 殖 淡 水 長 臂 大 蝦 結 病 毒 及 附 屬 超 小 病 毒 顆 粒 之 研 究 苗 常 傳 出 大 量 死 亡 的 疫 情, 病 蝦 呈 現 游 泳 緩 慢, 喜 好 攀 附 水 中 隱 蔽 物, 如 水 草 水 中 之 傘 網, 行 動 遲 緩, 成 長 停 頓 及 腹 部 肌 肉 白 濁 的 病 徵, 業 者 稱 為 白 尾 病 (WTD) ( 照 片 一 ), 病 蝦 大 多 於 發 病 後 兩 個 星 期 內 死 亡, 極 少 數 存 活 超 過 一 個 月, 發 病 的 池 子 死 亡 率 達 50%-90%, 造 成 嚴 重 的 經 濟 損 失 Tung 等 人 以 組 織 病 理 切 片 及 電 子 顯 微 鏡 的 觀 察, 推 測 23-26 nm 的 二 十 面 體 病 毒 為 其 病 原, 並 將 之 命 名 為 淡 水 長 臂 大 蝦 肌 肉 壞 死 病 毒 (Macrobrachium muscle virus; MMV) (Tung et al.,1999) 相 對 於 台 灣 的 疫 情, 在 1995 年, 法 屬 哥 德 洛 普 島 發 現 了 第 一 個 淡 水 長 臂 大 蝦 白 尾 病 的 案 例, 接 著 馬 丁 尼 克 島 也 發 生 白 尾 病 的 疫 情 而 在 中 國 大 陸 印 度 泰 國 及 法 屬 西 印 度 群 島 等 地 的 淡 水 長 臂 大 蝦 繁 殖 場 也 陸 續 傳 出 有 白 尾 病 的 疫 情 (Arcier et al., 1999; Shekhar et al, 2006), 主 要 感 染 為 後 期 幼 蟲 (Postlarvae) 階 段, 在 發 病 的 2-3 天 內, 其 累 積 死 亡 率 可 高 達 100%, 臨 床 症 狀 顯 示 為 蝦 體 尾 部 肌 肉 區 域 同 樣 呈 現 白 濁 的 現 象 三 病 理 特 徵 及 電 子 顯 微 鏡 的 觀 察 罹 患 白 尾 病 的 淡 水 長 臂 大 蝦, 在 病 理 組 織 切 片 的 觀 察 下 可 看 見 蝦 體 內 的 肌 肉 病 變 部 位 發 生 血 球 浸 潤, 肌 肉 細 胞 核 不 正 常 增 生 及 聚 集, 並 出 現 核 腫 大 染 色 質 外 移 的 現 象, 同 時 病 變 的 肌 肉 組 織 可 發 現 病 毒 的 包 含 體 (Inclusion body) (Tung et al., 1999) 電 子 顯 微 鏡 觀 察 方 面, 在 病 變 肌 肉 部 分 上 有 腫 大 的 粒 腺 體, 消 失 的 肌 漿 膜, 多 層 膜 之 粒 腺 體, 以 及 退 化 消 失 之 肌 纖 維 此 外 病 變 細 胞 的 細 胞 質 中 發 現 有 兩 種 大 小 不 同 的 病 毒 顆 粒, 其 中 較 大 的 病 毒 顆 粒, 不 含 外 套 膜 二 十 面 體 直 徑 大 小 約 26-27 nm, 命 名 為 淡 水 長 臂 大 蝦 結 病 毒 (M. rosenbergii nodavirus; MrNV), 另 一 種 較 小 的 病 毒, 直 徑 約 14-16 nm, 亦 不 含 外 套 膜, 二 十 面 體, 命 名 為 超 小 病 毒 顆 粒 (Extra small virus particle; XSV) (Qian et al., 2003), 此 兩 種 病 毒 究 竟 何 者 造 成 淡 水 長 臂 大 蝦 蝦 苗 產 生 肌 肉 白 濁 的 病 癥 尚 不 清 楚, 但 目 前 研 究 顯 示 XSV 可 能 為 一 種 隨 體 病 毒 (Satellite virus), 必 須 依 賴 MrNV 才 能 在 細 胞 內 複 製 (Sri Widada and Bonami., 2004a) 2
張 瑞 昕 蕭 孟 仁 王 俊 順 陳 秀 男 四 病 毒 特 性 將 罹 患 白 尾 病 的 病 蝦 組 織 研 磨, 利 用 氯 化 銫 濃 度 梯 度 離 心 法, 可 順 利 的 純 化 此 兩 種 病 毒, 淡 水 長 臂 大 蝦 結 病 毒 的 密 度 介 於 1.258-1.358 g/ml, 病 毒 直 徑 約 27 nm, 核 酸 分 析 顯 示 MrNV 病 毒 內 含 兩 段 的 ssrna (RNA-1 及 RNA-2), 大 小 分 別 約 為 2900 bp 及 1260 bp, 其 中 RNA-1 可 轉 譯 病 毒 的 RNA-dependent RNA polymerase, 而 RNA-2 可 轉 譯 一 個 43 kda 的 病 毒 鞘 蛋 白 ; 超 小 病 毒 顆 粒 (Extra small virus; XSV) 的 密 度 介 於 1.325 g/ml, 病 毒 直 徑 約 15 nm, 病 毒 的 核 酸 成 分 只 有 一 段 RNA, 大 小 約 796 bp, 序 列 3 端 有 一 短 的 poly(a) 尾 巴, 可 轉 譯 一 個 17 kda 以 及 一 個 16 kda 的 病 毒 結 構 蛋 白, 至 於 其 對 蝦 體 的 影 響 則 需 進 一 步 的 研 究 (Bonami et al., 2005) 五 病 原 性 實 驗 利 用 500-1000 倍 稀 釋 的 白 尾 病 病 蝦 組 織 研 磨 液 感 染 健 康 的 淡 水 長 臂 大 蝦, 在 感 染 12-14 天 後, 蝦 苗 的 累 積 死 亡 率 可 達 100%, 相 同 的 感 染 實 驗 並 未 對 成 蝦 造 成 死 亡, 但 利 用 反 轉 錄 聚 合 酶 連 鎖 反 應 (RT-PCR) 的 方 式 分 別 檢 測 感 染 病 蝦 的 各 個 部 位, 可 發 現 在 病 蝦 的 血 淋 巴 (Hemolymph) 鰓 (Gill tissue) 心 臟 (Heart) 胃 (Stomach) 頭 肌 (Head muscle) 腹 肌 (Abdominal muscle) 尾 肌 (Tail muscle) 卵 巢 (Ovary) 腸 道 組 織 (Intestine) 泳 足 (Pleopod) 均 可 偵 測 到 病 毒 的 RNA (Sahul Hameed et al., 2004) Sudhakaran 等 人 將 白 尾 病 病 蝦 組 織 研 磨 液 以 肌 肉 注 射 及 餵 食 的 方 式 分 別 感 染 印 度 對 蝦 斑 節 蝦 及 草 蝦, 結 果 並 未 造 成 任 何 死 亡 的 情 形, 但 以 RT- PCR 的 方 法 可 檢 驗 到 此 三 種 對 蝦 的 鰓 肌 肉 胃 腸 道 及 血 淋 巴 有 MrNV 及 XSV 的 感 染, 如 將 此 三 種 對 蝦 的 組 織 研 磨 液 以 水 浴 的 方 式 感 染 健 康 的 淡 水 長 臂 大 蝦 蝦 苗, 結 果 可 造 成 100% 的 死 亡 率, 顯 示 雖 然 MrNV 及 XSV 不 會 對 此 三 種 對 蝦 造 成 影 響, 但 可 以 對 蝦 做 為 儲 存 寄 主, 同 時 保 存 病 毒 的 致 病 性 (Sudhakaran et al., 2006a) 同 時 有 研 究 顯 示 以 MrNV 及 XSV 感 染 豐 年 蝦 (Artemia), 有 相 同 的 實 驗 結 果, 因 此, 豐 年 蝦 亦 可 能 為 此 兩 種 病 毒 傳 播 的 一 種 載 體 (Vector) 3
養 殖 淡 水 長 臂 大 蝦 結 病 毒 及 附 屬 超 小 病 毒 顆 粒 之 研 究 (Sudhakaran et al., 2006b) 六 檢 驗 方 法 (A) 反 轉 錄 聚 合 酶 連 鎖 反 應 (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction; RT-PCR) 反 轉 錄 聚 合 酶 連 鎖 反 應 (RT-PCR) 為 一 靈 敏 快 速 檢 測 病 毒 的 方 法, 其 檢 驗 過 程 如 下 : 將 病 蝦 組 織 以 TRIzol 進 行 研 磨, 進 而 進 行 RNA 的 萃 取, 以 萃 取 所 得 Total RNA ( 含 組 織 RNA 及 病 毒 RNA) 作 為 模 板, 以 淡 水 長 臂 大 蝦 結 病 毒 (M. rosenbergii nodavirus; MrNV) 之 專 一 性 引 子 (Primer) 先 合 成 cdna, 再 以 PCR 的 方 式 複 製 病 毒 的 核 酸 片 段, 反 應 產 物 以 1.5% 洋 菜 膠 電 泳 分 析 檢 驗 目 前 已 有 多 組 檢 驗 MrNV 及 XSV 的 專 一 性 引 子, 如 Sri Widada 等 人 發 展 一 套 專 一 性 引 子 MrNV2aF:5 -GCGTTATAGATGGCACAAGG-3, MrNV2aR:5 -AGCTGTGAAA CTTCAACTGG-3, 可 以 成 功 檢 測 出 MrNV 病 毒, 其 檢 測 靈 敏 度 可 以 達 到 0.25 fg RNA (Sahul Hameed et al., 2004) ( 圖 一 ); 而 檢 測 XSV 病 毒 方 面, 其 靈 敏 度 可 以 達 到 5 fg RNA (Sri Widada et al., 2004b) (B) Multiplex RT-PCR 同 時 利 用 MrNV 及 XSV 的 專 一 性 引 子 進 行 RT-PCR, 可 以 同 時 檢 測 是 否 有 MrNV 和 XSV 共 同 感 染 的 現 象, 利 用 此 方 式 檢 驗 靈 敏 度 可 以 達 到 25 fg (Yoganandhan et al., 2005) 而 Tripathy 等 人 利 用 此 兩 種 病 毒 的 鞘 蛋 白 基 因 序 列 設 計 專 一 性 引 子, 以 相 同 的 技 術 檢 驗 MrNV 及 XSV, 其 靈 敏 度 可 以 達 到 1 fg RNA, 同 時 可 在 7-9 小 時 完 成 檢 測 (Tripathy et al., 2006) (C) 點 墨 雜 交 (Dot blot hybridization) 4
張 瑞 昕 蕭 孟 仁 王 俊 順 陳 秀 男 利 用 PCR 的 方 法, 將 MrNV 以 及 XSV 此 兩 個 病 毒 的 片 段 基 因 以 DIG 標 誌 製 成 檢 驗 探 針, 將 病 蝦 抽 取 出 的 核 酸 結 合 在 NC membrane 上, 以 標 誌 探 針 進 行 點 墨 雜 交 反 應 (Dot blot hybridization), 可 確 認 病 蝦 中 體 內 是 否 含 有 白 尾 病 毒 (MrNV) 以 及 超 小 病 毒 顆 粒 (XSV), 利 用 此 檢 測 方 法 其 靈 敏 度 可 達 2.5 pg 病 毒 RNA (Sri Widada et al., 2004b) ( 圖 二 圖 三 ) (D) 原 位 雜 交 (In situ hybridization) 將 MrNV 病 毒 的 DIG 標 誌 檢 驗 探 針, 對 病 蝦 的 病 理 組 織 切 片 進 行 原 位 雜 交 反 應 (in situ hybridization), 可 得 知 病 毒 感 染 的 部 位, 也 可 確 認 蝦 體 各 器 官 對 此 兩 種 病 毒 的 感 受 性 Sri Widada 等 人 利 用 此 方 法 偵 測 MrNV 的 感 染 器 官, 結 果 顯 示 橫 紋 肌 為 病 毒 感 染 的 主 要 器 官, 病 蝦 的 肝 胰 臟 表 皮 組 織 及 消 化 道 上 皮 細 胞 皆 沒 有 受 到 病 毒 感 染 的 現 象 (Sri Widada et al., 2003) (E) 酵 素 連 結 免 疫 吸 附 分 析 (Enzyme linked immunosorbent assay; ELISA) 將 MrNV 病 毒 顆 粒 以 蔗 糖 濃 度 梯 度 離 心 法 進 行 純 化, 注 射 到 老 鼠 體 內 製 成 抗 MrNV 之 多 株 抗 體 (Polyclonal antibodies), 以 此 多 株 抗 體 之 IgG 作 為 1 級 抗 體, 再 以 連 接 peroxidase 之 抗 老 鼠 IgG 的 抗 體 作 為 2 級 抗 體, 以 Sandwich ELISA 進 行 MrNV 的 偵 測, 結 果 可 得 其 靈 敏 度 為 10 μg 病 蝦 組 織 蛋 白 /ml (Romestand et al., 2003) 七 預 防 與 控 制 目 前 針 對 淡 水 長 臂 大 蝦 結 病 毒 (M. rosenbergii nodavirus; MrNV) 以 及 超 小 病 毒 顆 粒 (Extra small virus particle; XSV) 並 沒 有 疫 苗 或 免 疫 方 面 的 防 治 方 法, 同 時 亦 無 抗 病 毒 藥 物 可 供 使 用, 只 能 夠 採 取 預 防 感 染 的 措 施, 包 括 養 蝦 池 之 池 底 及 池 壁 定 時 清 理 消 毒 及 曝 曬, 母 蝦 產 卵 及 蝦 子 幼 苗 養 殖 用 的 海 水 必 須 先 經 過 消 毒, 加 強 養 5
養 殖 淡 水 長 臂 大 蝦 結 病 毒 及 附 屬 超 小 病 毒 顆 粒 之 研 究 殖 的 管 理, 水 質 的 控 制 及 蝦 子 飼 料 營 養 的 補 充 等 在 引 進 母 蝦 進 行 繁 殖 時, 可 以 利 用 隨 機 取 樣 進 行 反 轉 錄 聚 合 酶 連 鎖 反 應 來 檢 測 母 蝦 是 否 有 帶 原 的 情 形, 以 減 少 母 蝦 將 病 毒 傳 染 至 剛 孵 出 的 幼 苗 此 外, 蝦 體 的 免 疫 系 統 主 要 是 非 專 一 性 的 細 胞 免 疫, 可 以 利 用 浸 泡, 飼 料 添 加 多 醣 體 的 方 式 來 增 加 蝦 子 抗 病 毒 的 能 力, 利 用 益 生 菌 改 善 繁 殖 環 境 亦 可 獲 得 相 當 的 效 果 參 考 文 獻 Anas A., Paul S., Jayaprakash N. S., Philip R. and Bright Singh I. S. (2005) Antimicrobial activity of chitosan against vibrios from freshwater prawn Macrobrachium rosenbergii larval rearing systems. Diseases of Aquatic Organisms 67, 177-179. Arcier J. M., Herman F., Lighter D. V., Redman R. M., Mari J. & Bonami J. R. (1999) A viral disease associated with mortalities in hatchery-reared postlarve of the freshwater prawn Macrobrachium rosenbergii. Diseases of Aquatic Organisms 38, 177-181. Bonami J. R., Shi Z., Qian D. & Sri Widada J. (2005) White tail disease of the giant freshwater prawn, Macrobrachium rosenbergii: separation of the associated virions and characterization of MrNV as a new type of nodavirus. Journal of Fish Diseases 28, 23-31. Chen S. C., Chen T. H., Wang P. C., Chen Y. C., Haung J. P., Lin Y. D., Chaug H. C. and Liaw L. L. (2003) Metschnikowia bicuspidate and Enterocccus faecium coinfection in giant freshwater prawn Macrobrachium rosenbergii. Diseases of Aquatic Organisms 55, 161-167. Cheng W. and Chen J. C. (1998) Isolation and characterization of an Entercoccus-like bacterium causing muscle necrosis and mortality in Macrobrachium rosenbergii. Diseases of Aquatic Organisms 34, 93-101. 6
張 瑞 昕 蕭 孟 仁 王 俊 順 陳 秀 男 Qian D., Shi Z., Zhang S., Cao Z., Liu W., Li L., Xie Y., Cambournac I. & Bonami J. R. (2003) Extra small virus-like particles (XSV) and nodavirus associated with whitish muscle diseases in the giant freshwater prawn, Macrobrachium rosenbergii. Journal of Fish Diseases 26, 521-527. Romestand B. & Bonami J.R. (2003) A sandwich enzyme linked immunosorbent assay (S-ELISA) for detection of MrNV in the giant freshwater prawn, Macrobrachium rosenbergii (de man). Journal of Fish Diseases 26, 71-75. Sahul Hameed A. S., Yoganandhan K., Sri Widada J. & Bonami J. R. (2004) Studies on the occurrence of Macrobrachium rosenbergii nodavirus and extra small virus-like particles associated with white tail diseases of M. rosenbergii in India by RT-PCR detection. Aquaculture 238, 127-133. Shekhar M. S., Azad I. S. & Jithendran K. P. (2006) RT-PCR and sequence analysis of Macrobrachium rosenbergii nodavirus: Indian isolate. Aquaculture 252, 128-132. Sri Widada J., Durand S., Cambournac I., Qian D., Shi Z., Dejonghe E., Richard V. & Bonami J. R. (2003) Genome-based detection methods of Macrobrachium rosenbergii nodavirus, a pathogen of the giant freshwater prawn, Macrobrachium rosenbergii: dot-blot, in situ hybridization and RT-PCR. Journal of Fish Diseases 26, 583-590. Sri Widada J. & Bonami J. R. (2004a) Characteristics of the monocistronic genome of extra small virus, a virus-like particle associated with Macrobrachium rosenbergii nodavirus: possible candidate for a new species of satellite virus. Journal of General Virology 85, 643-646. 7
養 殖 淡 水 長 臂 大 蝦 結 病 毒 及 附 屬 超 小 病 毒 顆 粒 之 研 究 Sri Widada J., Richard V., Shi Z., Qian D. & Bonami J. R. (2004b) Dot-blot hybridization and RT-PCR detection of extra small virus (XSV) associated with white tail disease of prawn Macrobrachium rosenbergii. Diseases of Aquatic Organisms 58, 83-87. Sudhakaran R., Syed Musthaq S., Haribabu P., Mukerjee S. C., Gopal C and Sahul Hameed A.S. (2006a) Experimental transmission of Macrobrachium rosenbergii nodavirus (MrNV) and extra virus small virus (XSV) in three species of marine shrimp (Penaeus indicus, Penaeus japonicus and Penaeus monodon). Aquaculture 257, 136-141. Sudhakaran R., Yoganandhan K., Ishaq Ahmed V. P. and Sahul Hameed A.S. (2006b) Artemia as a possible vector for Macrobrachium rosenbergii nodavirus (MrNV) and extra virus small virus (XSV) to Macrobrachium rosenbergii post-larvae. Diseases of Aquatic Organisms 70, 161-166. Tripathy S., Sahoo P. K., Kumari J., Mishra B. K., Sarangi N. and Ayyappan S.(2006) Multiplex RT-PCR detection and sequence comparison of viruses MrNv and XSV associated with white tail disease in Macrobrachium rosenbergii. Aquaculture 258, 134-139. Tung C. W., Wang C. S. & Chen S. N. (1999) Histological and electron microscopic study on Macrobrachium muscle virus (MMV) infection in the giant freshwater prawn, Macrobrachium rosenbergii (de Man), cultured in Taiwan. Journal of Fish Diseases 22, 319-323. Yoganandhan K., Sri Widada J., Bonami J. R. & Sahul Hameed A. S. (2005) Simultaneous detection of Macrobrachium rosenbergii nodavirus and extra small virus by a single tube, one-step multiplex RT-PCR assay. Journal of Fish Diseases 28, 65-69. 8
張 瑞 昕 蕭 孟 仁 王 俊 順 陳 秀 男 照 片 一 罹 患 白 尾 病 的 蝦 苗 與 正 常 蝦 體 比 較 上 端 為 病 蝦, 可 見 到 蝦 體 腹 部 肌 肉 呈 現 白 濁 情 形, 下 端 為 健 康 的 淡 水 長 臂 大 蝦 肌 肉 為 清 澈 狀 圖 一 利 用 反 轉 錄 聚 合 酶 連 鎖 反 應 偵 測 罹 患 白 尾 病 淡 水 長 臂 大 蝦 電 泳 圖 9
養 殖 淡 水 長 臂 大 蝦 結 病 毒 及 附 屬 超 小 病 毒 顆 粒 之 研 究 圖 二 淡 水 長 臂 大 蝦 結 病 毒 的 RNA1 及 RNA2 點 墨 雜 交 靈 敏 度 測 試 上 圖 為 病 毒 RNA1 片 段 基 因 重 組 質 體 以 連 續 十 倍 稀 釋 的 方 式, 由 30 ng 到 0.3 fg 以 RNA1 作 為 探 針 可 觀 察 到 其 靈 敏 度 可 達 30 pg 下 圖 為 病 毒 RNA2 完 整 基 因 重 組 質 體 以 連 續 十 倍 稀 釋 方 式, 由 50 ng 到 0.5 fg, 而 利 用 RNA2 作 為 探 針 靈 敏 度 可 達 到 5 pg 圖 三 超 小 病 毒 顆 粒 點 墨 雜 交 靈 敏 度 測 試 利 用 超 小 病 毒 顆 粒 完 整 基 因 重 組 質 體 以 連 續 十 倍 稀 釋 的 方 式, 由 80 ng 到 0.8 fg, 利 用 XSV 片 段 基 因 作 為 探 針 靈 敏 度 可 達 8 pg 10