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2010 年第 30 卷有机化学 Vol. 30, 2010 第 9 期, 1366~1371 Chinese Journal of Organic Chemistry No. 9, 1366~1371 研究论文 N ε - 苯胺酰基 -N α -(3- 取代苯基异噁唑 -5- 基羰基 ) 赖氨酸类化合物的合成及其除草活性研究胡德金刘素芳黄统辉涂海洋 * 李伟国朱晓磊张爱东 * ( 华中师范大学化学学院农药与化学生物学教育部重点实验室武汉 4300791) 摘要植物细胞内囊体中的 D1 蛋白酶是近年来发现的潜在的除草剂作用靶标. 以异噁唑甲酰赖氨酸脲先导结构信息为基础, 设计合成了未见报道的异噁唑甲酰赖氨酸类化合物 11 个. 目标化合物分子结构经 IR, 1 H NMR, 元素分析予以确证. 平皿法活体生物活性测试表明部分化合物具有中等除草活性 ; 化合物 8h 的离体生物活性测试表明其对 D1 蛋白酶有一定的抑制作用. 关键词 D1 蛋白酶 ; 抑制剂 ; 异噁唑酰赖氨酸 ; 合成 ; 除草剂 Synthesis and Herbicidal Activities of N ε -Anilinocarbonyl-N α -{3-[(un)- substituted phenyl]isoxazol-5-ylcarbonyl}lysine Derivatives Hu, Dejin Liu, Sufang Huang, Tonghui Tu, Haiyang* Li, Weiguo Zhu, Xiaolei Zhang, Aidong* (Key Laboratory of Pesticide and Chemical Biology of Ministry of Education, College of Chemistry, Central China Normal University, Wuhan 430079) Abstract Recently the D1 protease locating in the thylakoids of higher plants was found to be a potential herbicidal target. Based on one lead hit N α -(isoxazol-5-ylcarbonyl)lysine of D1 protease inhibitors, a series of novel N ε -anilinocarbonyl-n α -{3-[(un)substituted phenyl]isoxazol-5-ylcarbonyl}lysine derivatives were designed and synthesized, and their molecular structures were verified with IR, 1 H NMR, and elemental analysis. The biological activity examined in vivo demonstrated that most of the compounds exhibited moderate herbicidal activities. Meanwhile, the enzyme activity of one compound 8h was tested against the spinach D1 protease and the result showed its inhibitive effect against the enzyme. Keywords D1 protease; inhibitor; isoxazolecarbonyllysine derivative; synthesis; herbicide D1 蛋白酶 (CtpA) 作用于 D1 蛋白前体, 剪切其羧基端 9~16 个氨基酸残基, 形成光合作用必需的成熟 D1 蛋白, 用于光合系统 II 锰簇合物的组装 [1]. 研究表明 [2,3], 海藻 Scenedesmus 及蓝藻菌 Synechocystis 中 CtpA 剔除后导致植物不能光自养, 这和传统的 D1 蛋白抑制剂如西玛津, 阿特拉津作用效果相同. 因此, 如果抑制了 D1 蛋白酶的合成, 则可以抑制光合作用的发生. 同时, D1 蛋白酶在植物体内有高度的同源性 [4], 在高等植物体内含量远低于 D1 蛋白 ( 约 1% 左右 ) [5], 因此可以预计 D1 蛋白酶抑制剂将具有高效及广谱性. [6] 目前 Duff 等发表了一篇有关 D1 蛋白酶抑制剂的研究报道, 其采用的方法是利用荧光极化高通量筛选获 * E-mail: adzhang@mail.ccnu.edu.cn; haiytu@mail.ccnu.edu.cn; Tel.: 027-67867635. Received January 5, 2009; revised May 4, 2009; accepted April 30, 2010. 国家自然科学基金 (Nos. 20972056, 20672044) 资助项目.

No. 9 胡德金等 :N ε - 苯胺酰基 -N α -(3- 取代苯基异噁唑 -5- 基羰基 ) 赖氨酸类化合物的合成及其除草活性研究 1367 得五类 D1 蛋白酶的潜在抑制剂, 并对部分化合物进行了化学合成和先导结构的验证. 在我们前期工作中, 以 [7] Liao 等报道的斜生栅藻 D1 蛋白酶晶体结构为模板, 通过同源模建得到高等植物菠菜 D1 蛋白酶的三维结构模型, 并对自建化合物库和已知化合物库进行了虚拟筛选, 获得了 D1 蛋白酶抑制剂的先导化合物异噁唑甲酰赖氨酸脲分子结构信息. 本文在这一工作基础上, 设计合成了一系列异噁唑甲酰赖氨酸类化合物 (Scheme 1), 并探讨了这类化合物的活体除草活性. 通过对化合物 8h 的离体生物活性测试, 表明了其作为 D1 蛋白酶抑制剂先导化合物的可能性. 1 实验部分 1.1 仪器和试剂化合物熔点用 Electrothermal 数字熔点测定仪 ( 温度计未经校正 ) 测定 ; 1 H NMR 用 Varian MERCURY-PLUS 400 型核磁共振仪, 以氘代氯仿或 DMSO-d 6 为溶剂, TMS 为内标 ; LC-MS 用 ABI 2000 型色谱液质联用谱仪 ( 美国 ABI 公司 ) 测定 ; 元素分析用 Vario EL-III CHNSO 元素分析仪测定 ; 薄层层析用 GF25 型硅胶板 ( 青岛海洋化工厂 ); 高效液相色谱采用 Agilent 1100, Hypersil BDS C(8) (5 µm 0.46 cm 15 cm) 反相柱 ; D1 蛋白酶由本实验室从菠菜叶内囊膜中提取并经阴离子交换和凝胶柱层析提纯得到 ; D1 蛋白前体底物模拟物 24 肽 (S24) 由上海吉尔生化有限公司采用固相法合成. 所有进口或国产试剂均为 AR, 使用前经常规除水处理. 1.2 中间体的合成 1.2.1 3- 芳基 -5- 羟基亚甲基异噁唑 (2a~2k) 及其对应的 3- 芳基 -5- 异噁唑甲酸 (3a~3k) 合成化合物 2a~2k 参照文献 [8] 合成, 其中已知化合物通过薄板层析纯度分析和熔点测定, 并与文献值对照. 2a: 白色固体, 产率 50%. m.p. 52~53 ( 文献值 [8] : 52~53.5 ). 2b: 白色固体, 产率 78%. m.p. 103~105 ( 文献值 [10] : 99~101 ). 2c: 无色油状物, 产率 57%. 1 H NMR (CDCl 3, 400 MHz) δ: 8.43 (s, 1H, ArH), 7.05~7.35 (m, 3H, ArH), 6.5 (s, 1H, isoxazole 4-H), 4.78 (s, 2H, CH 2 ), 3.83 (s, 3H, OCH 3 ), 2.10 (s, 1H, OH); LG-MS m/z: 206.3 (M + +1). Anal. calcd for C 11 H 11 NO 3 : C 64.38, H 5.40, N 6.83, found C 64.69, H 5.24, N 7.11. 2d: 淡黄色针状晶体, 产率 64%. m.p. 114~116 ; 1 H NMR (CDCl 3, 400 MHz) δ: 8.00 (d, J=8.4 Hz, 1H, ArH), 7.73~7.61 (m, 3H, ArH), 6.38 (s, 1H, isoxazole 4-H), 4.84 (s, 2H, CH 2 ), 2.20 (s, 1H, OH); LG-MS m/z: 220.1 (M + ). Anal. calcd for C 10 H 8 N 2 O 4 : C 54.55, H 3.66, N 12.72, found C 54.72, H 3.59, N 12.85. Scheme 1

1368 有机化学 Vol. 30, 2010 2e: 淡黄色晶体, 产率 66%. m.p. 120~122 ; 1 H NMR (CDCl 3, 400 MHz) δ: 8.63 (s, 1H, ArH), 8.32 (d, J= 5.2 Hz, 1H, ArH), 8.18 (d, J=4.8 Hz, 1H, ArH), 7.63 (t, J= 10.4 Hz, 1H, ArH), 6.68 (s, 1H, isoxazole 4-H), 4.88 (s, 2H, CH 2 ), 2.05 (s, 1H, OH); LG-MS m/z: 221.2 (M + +1). Anal. calcd for C 10 H 8 N 2 O 4 : C 54.55, H 3.66, N 12.72, found C 54.48, H 3.75, N 12.86. 2f: 黄色晶体, 产率 54%. m.p. 163~164 ; 1 H NMR (CDCl 3, 400 MHz) δ: 8.34 (d, J=8.8 Hz, 2H, ArH), 8.00 (t, J=8.8 Hz, 2H, ArH), 6.66 (s, 1H, isoxazole 4-H), 4.88 (d, J=5.2 Hz, 2H, CH 2 ), 2.15 (s, 1H, OH); LG-MS m/z: 220.1 (M + ). Anal. calcd for C 10 H 8 N 2 O 4 : C 54.55, H 3.66, N 12.72; found C 54.78, H 3.79, N 12.61. 2g: 白色固体, 产率 65%. m.p. 78~79 ; 1 H NMR (CDCl 3, 400 MHz) δ: 7.72 (d, J=7.8 Hz, 1H, ArH), 7.49 (d, J=7.8 Hz, 1H, ArH), 7.44~7.26 (m, 2H, ArH), 6.72 (s, 1H, isoxazole 4-H), 4.85 (s, 2H, CH 2 ), 2.22 (s, 1H, OH); LG-MS m/z: 210.5 (M + +1). Anal. calcd for C 10 H 8 ClNO 2 : C 57.30, H 3.85, N 6.68; found C 57.59, H 3.76, N 6.51. 2h: 白色固体, 产率 43%. m.p. 114~115 ( 文献值 [8] : 114 ). 2i: 白色固体, 产率 51%. m.p. 118~120 ( 文献值 [10] : 114~116 ). 2j: 无色晶体, 产率 63%. m.p. 52~54 ; 1 H NMR (CDCl 3, 400 MHz) δ: 7.62~7.41 (m, 2H, ArH), 7.41~ 7.21 (m, 1H, ArH), 7.08~7.05 (m, 1H, ArH), 6.72 (s, 1H, isoxazole 4-H), 4.85 (s, 2H, CH 2 ), 2.15 (s, 1H, OH). LG-MS m/z: 194.6 (M + +1). Anal. calcd for C 10 H 8 FNO 2 : C 62.18, H 4.17, N 7.25; found C 62.41, H 4.46, N 6.98. 2k: 无色晶体, 产率 83%. m.p. 89~90 ; 1 H NMR (CDCl 3, 400 MHz) δ: 7.92~7.76 (m, 3H, ArH), 7.28~ 7.18 (m, 1H, ArH), 6.72 (s, 1H, isoxazole 4-H), 4.85 (s, 2H, CH 2 ), 2.12 (s, 1H, OH); LG-MS m/z: 193.2 (M + ). Anal. calcd for C 10 H 8 FNO 2 : C 62.18, H 4.17, N 7.25; found C 61.95, H 4.42, N 7.53. 3- 芳基 -5- 异噁唑甲酸 3a~3k 按文献 [9] 方法合成, 其分子结构用 1 H NMR 确定. 1.2.2 N ε - 苯胺酰基赖氨酸 (7) 的合成 16.7 g (65.7 mmol) CuSO 4 5H 2 O, 40 ml 水溶液中, 加入 20.0 g (110 mmol) Lys HCl, 回流 2 h, 冷却至室温. 调节溶液 ph 值至 9, 室温机械搅拌下滴加 17.57 g 苯基异氰酸酯 20 ml 二噁烷溶液, 1 h 后得到深蓝色混浊液, 抽滤, 水洗至滤液无色, 热乙醇溶液 50 ml 3 洗涤, 得到蓝色固体粉末状的赖氨酸苯基脲的铜盐 20 g, 产率 62%. 铜盐固体 20 g, 加入 300 ml 水, 浓盐酸调节酸性至 ph=2, 通入 H 2 S 气体 2 h, 得到棕褐色混浊液, 抽滤, 水洗, 滤液用 0.5 mol L -1 NaOH 调节 ph 值 6~8 之间, 得到白色混浊, 抽滤, 得白色固体产品 15.55 g, 产率 84%. m.p. 240~241 ; 1 H NMR (CDCl 3 +CF 3 COOH, 400 MHz) δ: 8.86 (s, 1H, NH), 7.61 (s, 2H, NH 2 ), 7.40 (d, J=10.8 Hz, 2H, ArH), 7.23~7.15 (m, 1H, ArH), 6.69~93 (m, 3H, ArH), 6.55 (s, 1H, NH), 3.28~3.42 (m, 1H, CH), 3.51~3.73 (m, 2H, CH 2 ), 1.55~1.69 (m, 2H, CH 2 ), 1.30~1.42 (m, 4H, CH 2 CH 2 ); IR (KBr) ν: 3410, 3306, 2935, 2861, 1647, 1580, 1499 cm -1 ; LC-MS m/z: 265.5 (M), 287.7 (M+Na + ). 1.3 目标产物 8a~8k 的合成化合物 3 2.2 mmol 溶于 2 ml SOCl 2, 2 ml 甲苯溶液, 回流 2~3 h, 减压蒸去溶剂, 冷却备用. 在 50 ml 三颈瓶中加入赖氨酸苯基脲 0.536 g (2 mmol), 水 5 ml, NaOH 0.08 g (2 mmol), 搅拌溶解, 冷却至 10. 上述酰氯 5 ml 甲苯溶液, 0.4 mol L -1 NaOH 的 5 ml 水溶液, 分别置于两个滴液漏斗中, 同时滴加入反应瓶中, 加完后室温 1 h, 分离水层, 水层酸化至 ph=1, 得到固体沉淀, 抽滤, 干燥, 乙醇 - 水重结晶得化合物 8, 产率 50%~81%. 8a: 白色固体, 产率 53%. m.p. 176~178 ; 1 H NMR (DMSO-d 6, 400 MHz) δ: 12.86 (s, 1H, COOH), 9.19 (d, J=7.2 Hz, 1H, NH), 8.39 (s, 1H, NH), 7.83~7.95 (m, 2H, ArH), 7.70 (s, 1H, NH), 7.48~7.57 (m, 3H, ArH), 7.29~7.40 (m, 2H, ArH), 7.13~7.21 (m, 2H, ArH), 6.85 (t, J=7.2 Hz, 1H, isoxazole 4-H), 6.15 (s, 1H, NH), 4.37 (s, 1H, CH), 2.98~3.10 (m, 2H, NHCH 2 ), 1.79~1.91 (m, 2H, CH 2 ), 1.42~1.50 (m, 4H, CH 2 CH 2 ); IR (KBr) ν: 3458, 3298, 3088, 1680, 1600, 1580, 1500 cm -1 ; LG-MS m/z: 435.2 (M + ), 437.5 (M+Na + ). Anal. calcd for C 23 H 24 N 4 O 5 : C 63.29, H 5.54, N 12.84; found C 63.27, H 5.53, N 12.85. 8b: 白色固体, 产率 75%. m.p. 175~177 ; 1 H NMR (DMSO-d 6, 400 MHz) δ: 12.85 (s, 1H, COOH), 9.28 (d, J=7.2 Hz, 1H, NH), 8.37 (s, 1H, NH), 7.89 (s, 1H, ArH), 7.85 (s, 1H, ArH), 7.58~6.68 (m, 2H, ArH), 7.35 (d, J=7.8 Hz, 2H, ArH), 7.18 (t, J=7.8 Hz, 2H, ArH), 6.86 (t, J=7.2 Hz, 1H, isoxazole 4-H), 6.13 (s, 1H, NH), 4.37 (s, 1H, CH), 3.84 (s, 3H, OCH 3 ), 3.03~3.11 (m, 2H, CH 2 ), 1.79~1.88 (m, 2H, CH 2 ), 1.39~1.47 (m, 4H, CH 2 CH 2 ); IR (KBr) ν: 3458, 3300, 3088, 1680, 1600, 1580, 1505 cm -1 ; LG-MS m/z: 466.2 (M + ), 488.5 (M+Na + ). Anal. calcd for C 24 H 26 N 4 O 6 : C 61.79, H 5.62, N 12.01; found C 61.81, H 5.60, N 12.00.

No. 9 胡德金等 :N ε - 苯胺酰基 -N α -(3- 取代苯基异噁唑 -5- 基羰基 ) 赖氨酸类化合物的合成及其除草活性研究 1369 8c: 白色固体, 产率 71%. m.p. 173~174 ; 1 H NMR (DMSO-d 6, 400 MHz) δ: 12.82 (s, 1H, COOH), 9.20 (d, J=7.8 Hz, 1H, NH), 8.37 (s, 1H, NH), 7.79 (d, J=7.2 Hz, 1H, ArH), 7.53 (d, J=9.6 Hz, 2H, ArH), 7.31~7.40 (m, 2H, ArH), 7.24~7.08 (m, 4H, ArH), 6.86 (t, J=7.2 Hz, 1H, isoxazole 4-H), 6.13 (s, 1H, NH), 4.37 (s, 1H, CH), 3.90 (s, 3H, OCH 3 ), 3.04~3.13 (m, 2H, CH 2 ), 1.84~ 1.91 (m, 2H, CH 2 ), 1.44~1.53 (m, 4H, CH 2 CH 2 ); IR (KBr) ν: 3460, 3305, 3090, 1680, 1601, 1580, 1503 cm -1 ; LG-MS m/z: 466.44 (M + ), 488.56 (M+Na + ). Anal. calcd for C 24 H 26 N 4 O 6 : C 61.79, H 5.62, N 12.01; found C 61.78, H 5.62, N 12.03. 8d: 淡黄色固体, 产率 56%. m.p. 180~181 ; 1 H NMR (DMSO-d 6, 400 MHz) δ: 12.85 (s, 1H, COOH), 9.27 (d, J=7.2 Hz, 1H, NH), 8.34 (s, 1H, NH), 7.99 (d, J=8.4 Hz, 2H, ArH), 7.78~7.62 (m, 3H, ArH), 7.70 (s, 1H, ArH), 7.57~7.64 (m, 2H, ArH), 7.35 (d, J=7.8 Hz, 2H, ArH), 6.86 (t, J=7.2 Hz, 1H, isoxazole 4-H), 6.13 (s, 1H, NH), 4.37 (s, 1H, CH), 3.04~3.12 (m, 2H, CH 2 ), 1.86 (m, 2H, CH 2 ), 1.39~1.46 (m, 4H, CH 2 CH 2 ); IR (KBr) ν: 3478, 3306, 3094, 1682, 1601, 1580, 1503 cm -1 ; LC-MS m/z: 481.2 (M + ), 519.7 (M+K + ). Anal. calcd for C 23 H 23 N 5 O 7 : C 57.38, H 4.82, N 14.55; found C 57.38, H 4.84, N 14.59. 8e: 黄色晶体, 产率 50%. m.p. 133~134 ; 1 H NMR (DMSO-d 6, 400 MHz) δ: 12.85 (s, 1H, COOH), 9.28 (d, J=7.2 Hz, 1H, NH), 8.69 (s, 1H, NH), 8.24~8.43 (m, 3H, ArH), 7.93 (s, 1H, ArH), 7.82~7.91 (m, 1H, ArH), 7.35 (t, J=7.8 Hz, 2H, ArH), 7.18 (t, J=7.8 Hz, 2H, ArH), 6.86 (t, J=7.2 Hz, 1H, isoxazole 4-H), 6.14 (t, J=9.6 Hz, 1H, NH), 4.37 (s, 1H, CH), 3.02~3.11 (m, 2H, CH 2 ), 1.84~1.91 (m, 2H, CH 2 ), 1.43~1.51 (m, 4H, CH 2 CH 2 ); IR (KBr) ν: 3459, 3305, 3090, 1680, 1601, 1580, 1503 cm -1 ; LC-MS m/z: 481.4 (M + ), 503.6 (M+Na + ). Anal. calcd for C 23 H 23 N 5 O 7 : C 57.38, H 4.82, N 14.55; found C 57.39, H 4.86, N 14.59. 8f: 白色固体, 产率 75%. m.p. 154~157 ; 1 H NMR (DMSO-d 6, 400 MHz) δ: 12.84 (s, 1H, COOH), 9.29 (d, J=7.2 Hz, 1H, NH), 8.37 (s, 1H, NH), 8.32~8.40 (m, 2H, ArH), 8.22 (d, J=8.4 Hz, 2H, ArH), 7.83 (s, 1H, ArH), 7.57~7.64 (m, 2H, ArH), 7.35 (d, J=7.8 Hz, 2H, ArH), 7.18 (t, J=7.8 Hz, 2H, ArH), 6.86 (t, J=7.2 Hz, 1H, isoxazole 4-H), 6.13 (s, 1H, NH), 4.37 (s, 1H, CH), 3.03~ 3.11 (m, 2H, CH 2 ), 1.80~1.89 (m, 2H, CH 2 ), 1.39~1.46 (m, 4H, CH 2 CH 2 ); IR (KBr) ν: 3478, 3306, 3094, 1682, 1601, 1580, 1503 cm -1 ; LC-MS m/z: 481.4 (M + ), 503.4 (M+Na + ). Anal. calcd for C 23 H 23 N 5 O 7 : C 57.38, H 4.82, N 14.55; found C 57.39, H 4.82, N 14.55. 8g: 白色针状晶体, 产率 81%. m.p. 174~175 ; 1 H NMR (DMSO-d 6, 400 MHz) δ: 12.83 (s, 1H, COOH), 9.28 (d, J=7.2 Hz, 1H, NH), 8.37 (s, 1H, NH), 7.75~7.60 (m, 2H, ArH), 7.53~7.58 (m, 2H, ArH), 7.52 (t, J=7.8 Hz, 1H, ArH), 7.35 (d, J=7.8 Hz, 2H, ArH), 7.18 (t, J=7.8 Hz, 2H, ArH), 6.86 (t, J=7.2 Hz, 1H, isoxazole 4-H), 6.13 (s, 1H, NH), 4.37 (s, 1H, CH), 3.01~3.09 (m, 2H, CH 2 ), 1.84 (m, 2H, CH 2 ), 1.40~1.51 (m, 4H, CH 2 CH 2 ); IR (KBr) ν: 3480, 3308, 3098, 1680, 1600, 1580, 1501 cm -1 ; LC-MS m/z: 470.1 (M + ), 492.4 (M+Na + ). Anal. calcd for C 23 H 23 ClN 4 O 5 : C 58.66, H 4.92, N 11.90; found C 58.67, H 4.90, N 11.92. 8h: 白色固体, 产率 70%. m.p. 171~172 ; 1 H NMR (DMSO-d 6, 400 MHz) δ: 12.82 (s, 1H, COOH), 9.17 (d, J=7.2 Hz, 1H, NH), 8.38 (s, 1H, NH), 7.81~7.92 (m, 2H, ArH), 7.64 (s, 1H, ArH), 7.35 (d, J=7.8 Hz, 2H, ArH), 7.18 (t, J=7.8 Hz, 2H, ArH), 7.09 (d, J=9.0 Hz, 2H, ArH), 6.85 (t, J=7.2 Hz, 1H, isoxazole 4-H), 6.13 (s, 1H, NH), 4.36 (s, 1H, CH), 3.01~3.12 (m, 2H, CH 2 ), 1.78~1.89 (m, 2H, CH 2 ), 1.38~1.47 (m, 4H, CH 2 CH 2 ); IR (KBr) ν: 3480, 3309, 3098, 1680, 1600, 1580, 1501 cm -1 ; LC-MS m/z: 505.1 (M + ), 527.1 (M+Na + ). Anal. calcd for C 23 H 22 Cl 2 N 4 O 5 : C 54.66, H 4.39, N 11.09; found C 54.66, H 4.41, N 11.09. 8i: 白色固体, 产率 76%. m.p. 174~175 ; 1 H NMR (DMSO-d 6, 400 MHz) δ: 12.82 (s, 1H, COOH), 9.24 (d, J=7.2 Hz, 1H, NH), 8.37 (s, 1H, NH), 7.88 (d, J=7.8 Hz, 2H, ArH), 7.75~7.73 (m, 3H, ArH), 7.35 (d, J=7.8 Hz, 2H, ArH), 7.18 (t, J=7.8 Hz, 2H, ArH), 6.86 (t, J=7.2 Hz, 1H, isoxazole 4-H), 6.13 (s, 1H, NH), 4.37 (s, 1H, CH), 3.04~3.13 (m, 2H, CH 2 ), 1.82~1.94 (m, 2H, CH 2 ), 1.40~1.51 (m, 4H, CH 2 CH 2 ); IR (KBr) ν: 3480, 3309, 3098, 1680, 1600, 1580, 1501 cm -1 ; LC-MS m/z: 515.4 (M + ), 537.6 (M+Na + ). Anal. calcd for C 23 H 23 BrN 4 O 5 : C 53.60, H 4.50, N 10.87; found C 53.62, H 4.50, N 10.82. 8j: 白色固体, 产率 57%. m.p. 177~179 ; 1 H NMR (DMSO-d 6, 400 MHz) δ: 12.84 (s, 1H, COOH), 9.29 (d, J=7.2 Hz, 1H, NH), 8.36 (s, 1H, NH), 7.83 (s, 1H, ArH), 7.48~7.59 (m, 2H, ArH), 7.35 (d, J=7.8 Hz, 2H, ArH), 7.24~7.34 (m, 1H, ArH), 7.16~7.22 (m, 1H, ArH), 7.18 (t, J=7.8 Hz, 2H, ArH), 6.86 (t, J=7.2 Hz, 1H, isoxazole 4-H), 6.13 (s, 1H, NH), 4.37 (s, 1H, CH), 3.01~ 3.11 (m, 2H, CH 2 ), 1.82~1.90 (m, 2H, CH 2 ), 1.39~4.47

1370 有机化学 Vol. 30, 2010 (m, 4H, CH 2 CH 2 ); IR (KBr) ν: 3480, 3310, 3098, 1682, 1601, 1583, 1501 cm -1 ; LC-MS m/z: 454.3 (M + ), 476.6 (M+Na + ). Anal. calcd for C 23 H 23 FN 4 O 5 : C 60.79, H 5.10, N 12.33; found C 60.81, H 5.12, N 12.31. 8k: 白色固体, 产率 76%. m.p. 127~129 ; 1 H NMR (DMSO-d 6, 400 MHz) δ: 12.82 (s, 1H, COOH), 9.24 (d, J=7.2 Hz, 1H, NH), 8.37 (s, 1H, NH), 7.86 (d, J=7.8 Hz, 1H, ArH), 7.75~7.84 (m, 1H, ArH), 7.68~7.73 (m, 1H, ArH), 7.40~7.49 (m, 1H, ArH), 7.35 (d, J=7.8 Hz, 2H, ArH), 7.19~7.30 (m, 1H, ArH), 7.18 (t, J=7.8 Hz, 2H, ArH), 6.86 (t, J=7.2 Hz, 1H, isoxazole 4-H), 6.13 (s, 1H, NH), 4.37 (s, 1H, CH), 3.01~3.12 (m, 2H, CH 2 ), 1.81~1.93 (m, 2H, CH 2 ), 1.39~1.47 (m, 4H, CH 2 CH 2 ); IR (KBr) ν: 3482, 3310, 3098, 1680, 1601, 1583, 1501 cm -1 ; LC-MS m/z: 454.1 (M + ), 476.1 (M+Na + ). Anal. calcd for C 23 H 23 FN 4 O 5 : C 60.79, H 5.10, N 12.33; found C 60.76, H 5.12, N 12.34. 1.4 活体和离体除草活性活体除草活性测定 : 采用国家十一五新农药创制生测标准方法 ( 平皿法 ) 测定了标题化合物在浓度分别为 100 和 10 mg L -1 时对单子叶植物稗草 ( 根 / 茎 ) 和双子叶植物油菜 ( 根 / 茎 ) 的抑制率 (%). 离体除草活性测定 : 采用的高效液相测定条件是 C8 反相柱, 洗脱相为水相 ( 含 0.1% TFA) 和有机相 CH 3 CN( 含 0.065% TFA). 保留时间 0~1.00 min 用 10% 有机相平衡反相柱, 1.01~16.00 min 采用有机相进行体线性梯度 (10%~40%) 洗脱, 紫外检测波长为 220 nm. 利用从菠菜中提取出的 D1 蛋白酶 ( 本实验室提取 ) 直接与抑制剂进行相互作用来进行离体生物活性测试, 验证目标化合物是否对 D1 蛋白酶有直接的抑制作用. 选择 D1 蛋白前体 (pre-d1) 剪切点附近的 24 个氨基酸残基组成的多肽 (S24) 作为底物模拟物 [11], 其序列为 + NH 3 -VMHERNAHNFPLDLA*AIEAPSTNG-COO -, 其中带星号的丙氨酸的羧端是 D1 蛋白酶的剪切位点. 取 10 µl D1 蛋白酶 (2.77 mg ml -1 ), 底物 S24 (5 mmol L -1 ) 4 µl, 化合物 8h (1 mmol L -1 ) 15.84 µl, 均以缓冲液 G (50 nmol L -1 HEPES, ph=7.7, 100 mmol L -1 NaCl, 100 ml 甘油, 0.5 g L -1 曲拉通 X-100) 配制, 并补足至 80 µl. 于 25 恒温反应 6 h 后加入 20 µl TFA (0.1 mol L -1 ) 中止反应, 离心 10 min (14000 g) 后取 20 µl 上清液进行高效液相测定. 依据该反应条件, 化合物 8h 与酶的反应浓度为 100 mg L -1. 在酶抑制状态下根据模拟底物 S24 肽的浓度增加或水解产物 9 肽或 15 肽浓度的降低, 可以计算出化合物对 D1 蛋白酶的抑制率. 2 结果与讨论 2.1 合成方法及条件选择在合成 3- 芳基异噁唑亚甲基醇时, 利用经典 1,3- 偶 [12,13] 极环加成反应形成异噁唑环. 有报道利用 CH 2 Cl 2 作溶剂从肟出发一锅法合成该异噁唑化合物 [14]. 在本实验中, 部分取代苯基肟在 CH 2 Cl 2 中溶解性较差, 影响反应产率, 如硝基芳基肟 ; 且在一锅法中从取代肟形成氯代肟时剧烈放热, 不易控制, 使得最终产物收率不高. 本文选择两步反应进行合成异噁唑亚甲基醇. 取代苯基肟与 NCS 反应, DNF 作溶剂, 得到纯度较高的可直接用于下步反应的取代苯基氯代肟, 再进行环加成, 收率较高, 且易于提纯. 赖氨酸形成铜盐时其 α- 羧基和 α- 氨基被同时螯合, 末端的氨基直接与苯基异氰酸酯形成脲的结构, 避免了 α- 羧基和 α- 氨基的较为繁琐的保护及脱保护过程. 成脲反应时, 将异氰酸酯配成溶于水的二噁烷溶液, 并滴加到赖氨酸的溶液中, 一方面可以稀释异氰酸酯的浓度, 使得滴入的异氰酸酯立即反应, 避免水解 ; 另一方面增加异氰酸酯水溶性, 加快了反应速率, 反应收率相对于直接滴加异氰酸酯提高 30% 左右. 在目标化合物的合成中, 直接将 N ε - 脲基赖氨酸溶于碱性水溶液, 使羧基成盐, 只留氨基一个反应位点, 从而避免了氨基酸复杂的保护及脱保护的过程. 尝试用溶于水有机溶剂的 THF, 二噁烷稀释酰氯, 滴加到氨基酸脲的碱性 [NaOH, Et 3 N, (i-pr) 2 Net] 水溶液中, 酰氯易水解, 收率很低. 采用甲苯作溶剂稀释酰氯进行缓慢滴加, 同时在冰水浴冷却的条件下缓慢地滴加稍过量的 NaOH 溶液, 保持反应始终处于碱性, 避免了羧基的副反应, 也避免了酰氯的水解, 反应进行顺利, 收率较高. 2.2 目标化合物的除草活性测试室内平皿法活体生物活性测试结果表明, 所有化合物均表现出一定的除草活性. 其中异噁唑 3- 位苯环上邻位取代无论是供电子基团 (OCH 3 ) 还是吸电子基团都比无取代苯环衍生物的生物活性要好 ; 在苯环其它位置含有取代基时, 吸电子基团的效果较好. 其中, 二氯代苯基异噁唑衍生物在 100 mg L -1 时可以达到 93% 的抑制率. 但所有化合物在浓度降低时活性下降较多, 可能是由于抑制酶的量较少, 未能显著影响植物的光合作用过程, 导致抑制作用效果明显下降. 2.3 化合物 8h 的离体生物活性图 1 是 D1 蛋白酶催化水解 S24 肽在加入化合物 8h 前 ( 曲线 A) 和 8h 后 ( 曲线 B) 的 HPLC 分析结果. 其中, 保留时间 13.8 min 的峰为 S24; 保留时间 11.6 和 5.4 min

No. 9 胡德金等 :N ε - 苯胺酰基 -N α -(3- 取代苯基异噁唑 -5- 基羰基 ) 赖氨酸类化合物的合成及其除草活性研究 1371 表 1 化合物 8a~8k 的除草活性 ( 相对抑制率 %) Table 1 Herbicidal activities (inhibition rate/%) of title compounds 8a~8k 油菜 ( 根 / 茎 ) 稗草 ( 根 / 茎 ) Compd. 100 mg L -1 10 mg L -1 100 mg L -1 10 mg L -1 8a 80.0/62.5 40.0/50.0 82.9/36.4 68.6/82.7 8b 84.0/45.8 48.8/29.2 85.7/40.9 74.3/31.8 8c 78.8/70.8 55.0/58.3 88.6/40.9 71.4/31.8 8d 80.0/50.0 52.5/41.7 77.1/45.5 71.4/40.9 8e 81.3/58.3 47.5/54.2 82.9/36.4 60.0/22.7 8f 82.8/50.0 51.3/45.8 82.9/45.5 68.6/40.9 8g 82.5/50.0 66.3/50.0 68.6/36.4 68.6/27.3 8h 93.0/58.3 60.0/54.2 81.7/50.0 68.6/36.4 8i 85.0/66.7 50.0/50.0 80.0/45.5 60.0/22.7 8j 80.9/45.5 31.5/18.2 60.9/29.3 39.1/22.0 8k 87.7/50.0 38.2/4.5 69.6/24.4 37.0/12.2 的峰分别为 S24 被 D1 蛋白酶水解生成的 15 肽和 9 肽. 在加入化合物后, 24 肽的对应峰高和峰面积相对于未加 8h 时有所增大, 而 15 肽和 9 肽的峰高和峰面积则相应减少, 说明化合物 8h 一定程度上抑制了 D1 蛋白酶催化活性. 通过对面积积分, 得到化合物 8h 对 D1 蛋白酶的抑制率为 43.6%. 该结果说明化合物 8h 在 100 mg L -1 的浓度下, 对 D1 蛋白酶有一定的抑制作用, 表明 8h 可能是 D1 蛋白酶抑制剂的先导化合物. 图 1 化合物 8h 加入前 (A) 和后 (B) D1 蛋白酶水解 S24 的 HPLC 图 Figure 1 HPLC elution profile of D1 protease catalyzed S24 hydrolysis before (A) and after (B) the addition of compound 8h 3 结论本文在以 D1 蛋白酶为模板虚拟筛选得到异噁唑甲酰赖氨酸先导结构信息化合物的基础上, 设计合成了一系列新颖的异噁唑甲酰赖氨酸类化合物. 在合成中采用铜盐螯合赖氨酸 α- 氨基和羧基进行同时保护, 与三光气和胺反应一锅法形成 N ε - 苯胺酰基赖氨酸. 该合成策略具有方便快捷的特点, 避免了赖氨酸 α 和 ε 氨基以及羧基较为繁琐的正交保护. N ε - 苯胺酰基赖氨酸与 3- 苯基异噁唑 -5- 甲酰氯通过两相 ( 水和甲苯 ) 反应得到目标化合物, 具有较好的收率. 目标化合物分子结构经 IR, 1 H NMR, 元素分析予以确认. 平皿法活体生物活性测试表明部分化合物具有中等除草活性 ; 化合物 8h 的酶水平生物活性测试表明其对 D1 蛋白酶的有一定的抑制作用, 表明这类化合物可能是 D1 蛋白酶的抑制剂. References 1 Nixon, P. J.; Trost, J. T.; Diner, B. A. Biochemistry 1992, 31, 10859. 2 Anbudurai, P. R.; Mor, T. S.; Ohad, I.; Shestakov, S. V.; Pakrasi, H. B. Proc. Natl. Acad. Sci. 1994, 91, 8082. 3 Trost, J. T.; Chisholm, D. A.; Jordan, D. B.; Diner, B. A. J. Biol. Chem. 1997, 272, 20348. 4 Inagaki, N.; Satoh, K. Handbook of Proteolytic Enzyme, Vol. 2, 2nd ed., Academic Press, London, 2004, pp. 2028~ 2031. 5 Fabbri, B. J.; Duff, S. M. G.; Remsen, E. E.; Chen, Y.-C. S.; Anderson, J. C.; CaJacob, C. A. Pest Manage. Sci. 2005, 61, 682. 6 Duff, S. M. G.; Chen, Y.-C. S.; Fabbri, B. J.; Yalamanchili, G.; Hamper, B. C.; Walker, D. M.; Brookfield, F. A.; Boyd, E. A.; Ashton, M. R.; Yarnold, C. J.; CaJacob, C. A. Pest. Biochem. Physiol. 2007, 88, 1. 7 Liao, D-I.; Qian, J.; Chisholm, D. A.; Jordan, D. B.; Diner, B. A. Nat. Struct. Biol. 2000, 7, 749. 8 Aicher, T. D.; Balkan, B.; Bell, P. A.; Brand, L. J.; Cheon, S. H.; Deems, R. O.; Fell, J. B.; Fillers, W. S.; Fraser, J. D.; Gao, J.-P.; Knorr, D. C.; Kahle, G. G.; Leone, C. L.; Nadelson, J.; Simpson, R.; Smith, H. C. J. Med. Chem. 1998, 41, 4556. 9 Luca, L. D.; Giacomelli, G.; Riu, A. J. Org. Chem. 2001, 66, 6823. 10 Barbachyn, M. R.; Cleek, G. J.; Dolak, L. A.; Garmon, S. A.; Morris, J. J. Med. Chem. 2003, 46, 284. 11 Oelmüller, R.; Herrmann, R. G.; Pakrasi, H. B. J. Biol. Chem. 1996, 271, 21848. 12 Wang, H.-Y.; Liu, F.-M.; Yan, Q.; Guo, Q.-S. J. Org. Chem. 2005, 25, 75 (in Chinese). ( 王厚勇, 刘方明, 阎琴, 郭群胜, 有机化学, 2005, 25, 75). 13 Li, X.-L.; Wang, Y.-P.; Chen, H.; Li, Z.-W.; Xing, C.-Y. J. Org. Chem. 2008, 28, 1750 (in Chinese). ( 李小六, 王彦坡, 陈华, 李志伟, 邢春勇, 有机化学, 2008, 28, 1750.) 14 Liu, L.-J.; Yong, J.-P.; Dai, X.-J.; Jia, J.; Wang, X.-Z.; Wang, J.-W. Chem. J. Chin. Univ. 2006, 27, 1669 (in Chinese). ( 刘利军, 雍建平, 戴小军, 贾炯, 王西照, 王建武, 高等学校化学学报, 2006, 27, 1669.) (Y0901051 Qin, X.; Zheng, G.)