HB180819 Hieff Mut TM Site-Directed Mutagenesis Kit Cat No. 11003 产品说明书 本产品仅作科研用途!
产品信息 产品名称 货号 规格 储存 Hieff Mut TM Site-Directed Mutagenesis Kit 定点突变试剂盒 11003ES10 10 T -20 产品描述 Hieff Mut TM Site-Directed Mutagenesis Kit 是基于 Hieff Clone TM 快速克隆技术的定点突变系统 使用本试剂盒, 目标质粒 扩增产物经 DpnI 消化 Hieff Clone TM 重组环化后直接进行转化即可完成定点突变 该试剂盒由两个模块组成 :Hieff II Pfu DNA Polymerase 扩增模块和 Hieff Clone 快速克隆模块 Hieff II Pfu DNA Polymerase 超高的保真度显著降低了扩增过程中引 入新突变的可能性, 其卓越的长片段扩增能力, 广泛适用于长度小于 20 kb 的任何质粒扩增 Hieff Clone 快速克隆系统利用 高效的同源重组反应替代传统的退火成环反应 因此使用 Hieff Mut TM Site-Directed Mutagenesis Kit 进行 DNA 定点突变时, 引 物设计更加灵活, 且扩增反应不再需要以线性方式进行, 极大减少了模板使用量, 有利于原始甲基化模板的彻底降解 Hieff Clone 技术可以高效完成两个 PCR 产物的无缝拼接, 因此该试剂盒还能以单次扩增的方式对目标质粒上不连续的两个位点同 时进行突变 Hieff Mut TM Site-Directed Mutagenesis Kit 中的重组酶 Exnase 经过优化, 专门针对单碱基 不连续双碱基定点突变 此外, 如扩增产物特异, 其 DpnI 消化产物可不进行 DNA 纯化而直接用于重组反应 高度优化的反应缓冲液 快捷的操作流程以及 极高的成功率, 使得 Hieff Mut TM Site-Directed Mutagenesis Kit 成为 DNA 定点突变首选试剂盒 应用范围 DNA 定点突变 注 : 如使用本品对质粒进行定点突变, 请使用甲基化酶无缺陷的宿主菌 ( 例如 Top10 DH5α JM109) 扩增原始质粒! 产品组成 产品编号 / 规格 编号 组分 11003ES10 (10 T) 11003-A 2 Hieff II PCR buffer 500 μl 11003-B dntp Mix (10 mm each) 20 μl 11003-C Hieff II Pfu DNA Polymerase (1 U/μl) 20 μl 11003-D Dpn I (10 U/μl) 20 μl 11003-E 2 Hieff Clone Enzyme Premix 100 μl 运输与保存方法 冰袋 (wet ice) 运输 产品 -20 保存 有效期 1 年 第 1 页, 共 8 页
单碱基 ( 或连续多碱基 ) 定点突变实验方案 实验流程概览 ( 图一 ) Forward Primer Reverse Primer Mutation Point Complementary Region Original Vector (Methylated) 设计部分反向互补的引物 ; 对质粒模板进行反向扩增 ; 扩增产物经 DpnI 消化, 去除甲基化模板 Complementary Region Linear Amplicon (Non-Methylated) 进行重组环化反应 Mutated Vector (Non-Methylated) 重组产物直接转化到感受态细胞中 Mutated Vector (Methylated) 图一 : 使用 Hieff Mut TM Site-Directed Mutagenesis Kit 进行单碱基 ( 或连续多碱基 ) 定点突变实验流程 1. 引物设计向质粒引入单碱基或连续多碱基定点突变, 只需设计一对引物将质粒进行反向 PCR 扩增即可 引物设计基本原则为 : 正反向扩增引物 5 端包含 15-21 bp 反向互补区域 (GC 含量 40%-60% 为佳 ), 各引物非互补区域长度至少为 15 bp( 待突变位点至引物 3 端区域 Tm 值高于 60 为佳 ) 所需引入突变可以包含在互补区域内 ( 需要两条引物上均引入点突变 ), 也可以包含在任一条引物的非互补区域 ( 只需在一条引物上引入点突变 ), 请勿将突变位点置于引物末端 以向 puc18 引入单碱基突变为例, 引物设计具体方案如图二所示 第 2 页, 共 8 页
Mutation Point puc18 Non-complementary Region 5 GCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAA 3 3 CGGATAAAAATATCCAATTACAGTACTATTATTACCAAAGAATCTGCAGTCCACCGTGAAAAGCCCCTTTACACGCGCCTT 5 Non-complementary Region 载体正向扩增引物序列为 : 载体反向扩增引物序列为 : Non-complementary Region 5 TAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATG 3 3 TATCCAATTACAGTACTATTATTACCAAAGAATCTGCAGTC 5 Non-complementary Region 图二 : 向质粒引入单碱基 ( 或连续多碱基 ) 定点突变引物设计示意图 注 : 计算引物 Tm 值时, 应计算待突变位点至引物 3 端这一区域内的碱基, 调整引物长度使这一段 Tm 值高于 60, 待突 变位点至引物 5 端区域内的碱基不应参与计算 2. 目标质粒扩增 2.1 配制 PCR 反应体系 反应各组分解冻后请充分摇匀, 使用完毕后及时放回 -20 2 Hieff II PCR buffer 请勿长时间敞口放置 为了增加扩增特异性, 反应体系配制过程请于冰水浴中进行 为了防止 Hieff II Pfu DNA Polymerase 的校对活性降解引 物, 请将聚合酶最后加入反应体系中 ddh 2 O 2 Hieff II PCR buffer dntp Mix (10 mm each) a 模板 DNA b 引物 1 (10 μm) 引物 2 (10 μm) Hieff II Pfu DNA Polymerase (1 U/μl) c a. 请勿使用 dutp 和带有尿嘧啶的引物或模板 Up to 50 μl 25 μl Optional b. 在质粒能正常扩增的前提下, 应尽量减少质粒模板使用量, 推荐使用 1 ng 新鲜提取的质粒做模板 c. 推荐的酶的终浓度为 1 U/50 μl 反应 可将 Hieff II Pfu DNA Polymerase 在 0.5-2 U/50 μl 之间进行优化, 但不要超过 2 U/50 μl, 尤其当扩增子长度大于 5 kb 时 2.2 PCR 扩增反应 推荐 PCR 反应条件 : 循环步骤温度时间循环数 预变性 95 30 sec 1 a 变性 b 退火 c 延伸 95 60 ~72 72 2 μl 2 μl 15 sec 15 sec 30-60 sec/kb 彻底延伸 72 5 min 1 a. 对于大多数质粒, 变性温度使用 95 即可 30 d 第 3 页, 共 8 页
b. Hieff II Pfu DNA Polymerase 能够促进模板和引物高效退火 一般来说, 退火温度设置为引物 Tm 值即可 如果需要, 可以 建立一个温度梯度反应去寻找引物模板结合的最适温度 退火时间太长可能导致扩增产物在胶上呈现弥散状 c. 对于大多数扩增反应, 延伸过程可在 72 进行 长的延伸时间有助于提高扩增产量 d. 为了防止扩增过程中引入非目标突变, 强烈建议扩增循环数 35 如果扩增效率良好的话, 推荐扩增循环数 30 反应结束后取少量扩增产物进行琼脂糖电泳检测 如目标质粒正确扩增, 则可进行下步实验 3. 扩增产物 DpnI 消化, 去除甲基化模板质粒 因上述扩增产物中包含原始模板质粒, 为防止其在转化后形成假阳性转化子, 必须在进行重组环化之前进行 DpnI 消化 推荐反应体系如下 : DpnI 扩增产物 40~50 μl 轻轻吹打混匀后, 将上述反应体系置于 37 恒温反应 1~2 小时 如产物扩增特异, 产物条带单一,DpnI 消化产物无需纯 化, 可直接用于后续重组反应 如扩增不特异,DpnI 消化结束后应胶回收纯化目标扩增产物 4. 重组反应 4.1 配制重组反应体系 正反向扩增引物 5 端包含完全反向互补的一段序列, 因此在 Exnase 催化下扩增产物 5 末端和 3 末端可以发生同源重组, 完成扩增产物环化过程 于冰水浴中, 将下列组分依次加到无菌的 1.5 ml Eppendorf 管或 PCR 管的管底 如果不慎将液体粘在 管壁, 请务必通过短暂离心使其沉入管底 体系配制完成后, 用移液器上下轻轻吹打几次混匀各组分, 避免产生气泡 ( 请勿 剧烈震荡或者涡旋混匀 ) 2 Hieff Clone Enzyme Premix DpnI 消化产物 ddh 2 O 10 μl 50~400 ng Up to 20 μl 单点突变重组反应体系最适 DNA 使用量为 0.03 pmol 该摩尔数对应的 DNA 质量可由以下公式粗略计算获得 : DpnI 消化产物最适使用量 = [0.02 目标质粒碱基对数 ] ng (0.03 pmol) 例如, 向长度为 5 kb 的目标质粒引入单点突变,DpnI 消化产物最适使用量应为 :0.02 5000 = 100 ng 注 :DNA 量太多或者太少都将降低环化效率 请务必通过琼脂糖电泳预先确认 DNA 浓度, 尽量严格按照推荐量配制反应 体系 当 DpnI 消化产物最适使用量计算值不足 50 ng 或者超过 400 ng 时, 加入 50ng 或 400 ng 即可 DpnI 消化产物不纯化直接用 于重组反应时, 使用量不应超过反应总体积的 1/5, 即 4μl 4.2 重组反应 1) 将上述体系置于 50 反应 20 min 2) 待反应完成后, 立即将反应管置于冰水浴中冷却 3) 之后, 反应产物可直接进行转化 ; 也可储存于 -20, 待需要时解冻转化 5. 反应产物转化 涂板 克隆鉴定 1) 取 10 μl 冷却反应液, 加入到 100 μl 感受态细胞中, 轻弹管壁数下混匀, 在冰上放置 30 min 2) 42 热激 45~90 秒, 冰水浴孵育 2 min 3) 加入 900 μl SOC 或 LB 培养基,37 孵育 10min 充分复苏 4) 37,200rpm-250rpm, 摇菌 45 min 5) 取 100 μl 菌液均匀涂布在含有适当抗生素的平板上 将平板倒置, 于 37 过夜培养 注 : 我们推荐您使用转化效率 >10 8 cfu/μg 的感受态细胞 如果感受态转化效率 <10 8 cfu/μg ( 例如用 CaCl 2 法新鲜制备的感 受态转化效率通常在 10 6-10 7 cfu/μg 之间 ), 请将培养菌液在 5,000 rpm 离心 3 min 收集菌体, 用 100 μl LB 培养基重悬后全部 涂板 第 4 页, 共 8 页
不连续双碱基定点突变实验方案 ( 两突变位点相距超过 50 bp) 实验流程概览 ( 图三 ) 以待突变位点 A B 为界, 将质粒分为 AB 和 BA 段 在每个待突变位点处设计部分反向互补的引物 ; 以原始质粒为模板, 分别扩增 AB 段 (A Forward Primer 和 B Reverse Primer) 和 BA 段 ( A Reverse Primer 和 B Forward Primer); 扩增产物经 DpnI 消化, 去除甲基化模板 进行重组环化反应 重组产物直接转化到感受态细胞中 图三 : 使用 Hieff Mut TM Site-Directed Mutagenesis Kit 进行不连续双碱基定点突变实验流程 1. 引物设计向质粒两个不连续位点引入不连续双碱基定点突变, 需要设计两对引物将质粒分为两段进行扩增 引物设计基本原则为 : 在每个待突变位点处设计部分反向互补的扩增引物对 每对正反向引物 5 端包含 15-21 bp 反向互补区域 所需引入突变可以包含在互补区域内 ( 需要两条引物上均引入点突变 ), 也可以包含在任一条引物的非互补区域 ( 只需在一条引物上引入点突变 ), 请勿将突变位点置于引物末端 以向 puc18 引入双碱基突变为例, 引物设计具体方案如图四所示 第 5 页, 共 8 页
Mutation Points A B puc18 5 ACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACT CTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTG 3 3 TGTGGTGCTACGGACATCGTTACCGTTGTTGCAACGCGTTTGA GAACGTTTGTTTTTTTGGTGGCGATGGTCGCCACCAAACAAAC 5 待突变位点 A 正向扩增引物序列为 : 待突变位点 A 反向扩增引物序列为 : 5 CCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAAC 3 3 GTGGTGCTACGGACATCGTTACCGTTGTTGC 5 待突变位点 B 正向扩增引物序列为 : 待突变位点 B 反向扩增引物序列为 : 5 AAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTG 3 3 CGTTTGTTTTTTTGGTGGCGATGGTCGCC 5 图四 : 向质粒引入不连续双碱基定点突变引物设计示意图 注 : 计算引物 Tm 值时, 应计算待突变位点至引物 3 端这一区域内的碱基, 调整引物长度使这一段 Tm 值高于 60, 待突变位点至引物 5 端区域内的碱基不应参与计算 2. 目标质粒扩增以待突变位点 A B 为界, 将质粒分为 AB 段和 BA 段 使用 Hieff TM II Pfu DNA Polymerase 对 AB 段和 BA 段分别进行扩增 AB 段扩增引物对为 : 待突变位点 A 正向扩增引物和待突变位点 B 反向扩增引物 ;BA 段扩增引物对为 : 待突变位点 B 正向扩增引物和待突变位点 A 反向扩增引物 2.1 配制 PCR 反应体系反应各组分解冻后请充分摇匀, 使用完毕后及时放回 -20 2 Hieff II PCR buffer 请勿长时间敞口放置 为了增加扩增特异性, 反应体系配制过程请于冰水浴中进行 为了防止 Hieff II Pfu DNA Polymerase 的校对活性降解引物, 请将聚合酶最后加入反应体系中 推荐反应体系如下 : ddh 2 O Up to 50 μl 2 Hieff II PCR buffer 25 μl dntp Mix (10 mm each) a 模板 DNA b Optional 引物 1 (10 μm) 2 μl 引物 2 (10 μm) 2 μl Hieff II Pfu DNA Polymerase (1 U/μl) c a. 请勿使用 dutp 和带有尿嘧啶的引物或模板 b. 在各片段能正常扩增的前提下, 应尽量减少质粒模板使用量, 推荐使用 1 ng 新鲜提取的质粒做模板 第 6 页, 共 8 页
c. 推荐的酶的终浓度为 1 U/50 μl 反应 可将 Hieff II Pfu DNA Polymerase 在 0.5-2 U/50 μl 之间进行优化, 但不要超过 2 U/50 μl, 尤其当扩增子长度大于 5 kb 时 2.2 PCR 扩增反应 推荐 PCR 反应条件 : 循环步骤温度时间循环数 预变性 95 30 sec 1 a 变性 b 退火 c 延伸 95 60 ~72 72 15 sec 15 sec 30-60 sec/kb 彻底延伸 72 5 min 1 a. 对于大多数质粒, 变性温度使用 95 即可 对于超过 15 kb 的扩增子, 变性温度降低至 92 可以提高扩增效率 b. Hieff II Pfu DNA Polymerase 能够促进模板和引物高效退火 一般来说, 退火温度设置为引物 Tm 值即可 如果需要, 可以 建立一个温度梯度反应去寻找引物模板结合的最适温度 退火时间太长可能导致扩增产物在胶上呈现弥散状 c. 对于大多数扩增反应, 延伸过程可在 72 进行 长的延伸时间有助于提高扩增产量 d. 为了防止扩增过程中引入非目标突变, 强烈建议扩增循环数 35 如果扩增效率良好的话, 推荐扩增循环数 30 反应结束后取少量扩增产物进行琼脂糖电泳检测 如目标质粒正确扩增, 则可进行下步实验 3. 扩增产物 DpnI 消化, 去除甲基化模板质粒 因上述扩增产物中包含原始模板质粒, 为防止其在转化后形成假阳性转化子, 必须在进行重组环化之前进行 DpnI 消化 推荐反应体系如下 : DpnI 扩增产物 40~50 μl 将上述反应体系置于 37 恒温反应 1~2 小时 如产物扩增特异, 产物条带单一,DpnI 消化产物无需纯化, 可直接用 于后续重组反应 如扩增不特异,DpnI 消化结束后应胶回收纯化目标扩增产物 4. 重组反应 4.1 配制重组反应体系 AB 段和 BA 段扩增产物末端分别包含完全一致的一段序列, 因此在 Exnase 催化下两扩增产物末端可以分别发生同源重 组, 完成环化过程 于冰水浴中, 将下列组分依次加到无菌的 1.5 ml Eppendorf 管或 PCR 管的管底 如果不慎将液体粘在管 壁, 请务必通过短暂离心使其沉入管底 体系配制完成后, 用移液器上下轻轻吹打几次混匀各组分, 避免产生气泡 ( 请勿剧 烈震荡或者涡旋混匀 ) ddh 2 O 2 Hieff Clone Enzyme Premix AB 段 DpnI 消化产物 BA 段 DpnI 消化产物 Up to 20 μl 10 μl 20~200 ng 20~200 ng 不连续双点突变重组反应体系最适 DNA 使用量为 : 较长片段 0.03 pmol, 较短片段为 0.06 pmol 这些摩尔数对应的 DNA 质量可由以下公式粗略计算获得 : 较长片段 DpnI 消化产物使用量 = [0.02 片段碱基对数 ] ng (0.03 pmol) 较短片段 DpnI 消化产物使用量 = [0.04 片段碱基对数 ] ng (0.06 pmol) 例如,AB 段长度为 1 kb,ba 段长度为 5 kb 则 DpnI 消化产物最适使用量为 :AB 段 0.04 1000 = 40 ng;ba 段 0.02 5000 = 100 ng 注 :DNA 量太多或者太少都将降低环化效率 请务必通过琼脂糖电泳预先确认 DNA 浓度, 尽量严格按照推荐量配制反应 体系 当 DpnI 消化产物最适使用量计算值不足 20 ng 或者超过 200 ng 时, 加入 20ng 或 200 ng 即可 DpnI 消化产物不纯化直接用 于重组反应时, 使用量不应超过反应总体积的 1/5, 即 4μl 4.2 重组反应 1) 将上述体系置于 50 反应 20 min 30 d 第 7 页, 共 8 页
2) 待反应完成后, 立即将反应管置于冰水浴中冷却 3) 之后, 反应产物可直接进行转化 ; 也可储存于 -20, 待需要时解冻转化 5. 反应产物转化 涂板 克隆鉴定 1) 取 10 μl 冷却反应液, 加入到 100 μl 感受态细胞中, 轻弹管壁数下混匀, 在冰上放置 30 min 2) 42 热激 45~90 秒, 冰水浴孵育 2 min 3) 加入 900 μl SOC 或 LB 培养基,37 孵育 10min 充分复苏 4) 37,200rpm-250rpm, 摇菌 45 min 5) 取 100 μl 菌液均匀涂布在含有适当抗生素的平板上 将平板倒置, 于 37 过夜培养 注 : 我们推荐您使用转化效率 >10 8 cfu/μg 的感受态细胞 如果感受态转化效率 <10 8 cfu/μg ( 例如用 CaCl 2 法新鲜制备的感 受态转化效率通常在 10 6-10 7 cfu/μg 之间 ), 请将培养菌液在 5,000 rpm 离心 3 min 收集菌体, 用 100 μl LB 培养基重悬后全部涂板 注意事项 1) 引物设计时 5 端反向互补区尽量选择无重复序列, 且 GC 含量比较均匀的区域 当这一区域内 GC 含量在 40%~60% 范围 之内时, 重组环化效率将达到最大 如这部分区域 GC 含量高于 70% 或者低于 30%, 重组环化效率会受到较大影响 2) 当两突变位点相距小于 50bp 时, 应将其视为一个突变位点, 将两突变引入同一条 / 对引物进行实验 3)DpnI 只能识别甲基化 DNA, 请务必使用从甲基化酶无缺陷的宿主菌中扩增的质粒作为 PCR 模板 4) 长期放置 反复冻融会导致模板质粒断裂 开环或降解, 应使用新鲜制备的质粒作为模板 5) 质粒 PCR 扩增结果需高度特异, 杂带较多会影响实验结果 6) 重组反应体系中应尽量避免金属络合剂 ( 如 EDTA) 的带入 因此, 建议将 DNA 纯化产物溶解在 ph8.0 的 ddh 2 O 中保存 ( 常规 胶回收试剂盒中的洗脱液可用 ph8.0 的 ddh 2 O 替代 ), 请勿使用 TE 进行 DNA 保存 7) 冷却后的重组反应产物应在 1h 内进行转化, 且转化前保持在冰水浴中 如需储存, 于 -20 冻存 尽量避免室温较长时间 放置或 4 长期储存 8) 反应产物的转化体积不应超过感受态细胞体积的 1/10, 否则会降低转化效率 另外, 当转化的 DNA 浓度太高时, 会抑制 转化反应 将重组反应产物稀释 5 倍后取 1/5 进行转化 9) 为了您的安全和健康, 请穿实验服并戴一次性手套操作 本产品仅作科研用途! 第 8 页, 共 8 页